氮素作为一种关键的矿质营养元素^[1]，不仅参与众多生物大分子的结构构成，其供给水平还直接影响农作物的产量和品质；但过度施用所导致的土壤酸化、温室气体排放、水体富营养化和生产成本增加等问题日益突出^[2]。木薯Manihot esculenta Crantz (Cassava)作为热带地区第三大粮食作物，粗生易栽，适应性强，在干旱贫瘠的山地丘陵地带也能获得较高产量^[3-7]。木薯特殊的形态特征、生理生化特性和自我调节机制，使其具有较高的养分利用效率^[8]；挖掘木薯氮高效基因，对于木薯及其他作物氮高效种质资源的改良和培育至关重要。

高亲和硝酸盐转运蛋白家族2(Nitrate transporter 2，NRT2)基因在低氮条件下的上调表达可提高作物对氮素的有效吸收，对作物耐低氮胁迫至关重要^[9-12]。木薯NRT2有6个成员^[13]，其中，木薯MeNRT2.6是拟南芥AtNRT2.7、毛果杨PtNRT2.7、水稻OsNRT2.4、油菜BnNRT2.7a/b等的同源基因^[14-19]。毛果杨PtNRT2.7可以被硝酸盐以及水杨酸、茉莉酸、赤霉素、生长素等多种激素诱导，并且能够增强植物根系生长，调控叶片硝酸盐同化和再吸收之间的平衡，提高植物对氮素的吸收利用^[20]。花生AhNRT2.7能够响应低氮胁迫，提高植物氮吸收和转运能力^[21]。与其他基因不同的是，OsNRT2.4为双亲和力硝酸盐转运蛋白基因，其表达受硝酸盐、生长素和茉莉酸的诱导，调控水稻根系生长以及根、叶中硝酸盐向其他器官的分配^{[17-18, 22]}。因此，本研究推测木薯MeNRT2.6可能也在硝酸盐转运、分配以及氮高效利用方面具有相似的功能。

本研究从低氮条件下RNA-seq差异基因数据中挖掘并克隆木薯MeNRT2.6基因，通过浸花法获得转基因拟南芥Arabidopsis thaliana，解析MeNRT2.6在氮素利用效率方面的功能，以期为木薯氮高效种质资源的筛选和创制提供一定的技术支撑。

1.   材料与方法

1.1   低氮条件下RNA-seq差异基因分析

为了筛选响应低氮诱导的木薯NRT2家族基因，本研究使用中国热带农业科学院热带生物技术研究所木薯逆境生物学研究课题组已有的转录组数据^[23]进行分析，使用的材料为木薯栽培种C3，处理方式为：低氮(0.2 mmol/L KNO₃溶液)以及高氮(10.0 mmol/L KNO₃溶液)。使用转录组数据分析响应低氮诱导的MeNRT2基因，筛选条件为差异倍数(Fold change，FC)≥2、校正后P≤0.001。

1.2   生物信息学分析

从JGI植物基因组数据库以及NCBI数据库下载木薯MeNRT2.6和其他物种同源基因序列信息，使用MEGA11软件的ClustalW算法进行多序列比对，比对完成后，采用邻接法(Neighbor-joining algorithm)构建进化树，bootstrap值设置为1 000。构建完成后，使用在线工具iTOL美化进化树。利用在线分析工具SWISS-MODEL、SPOMA对MeNRT2.6蛋白进行结构预测分析。使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线工具对木薯NRT2蛋白结构域进行预测分析。木薯MeNRT2.6基因及其同源基因启动子序列从NCBI数据库中提取，大小均为上游2 000 bp。利用PlantCARE在线网站进行顺式作用元件预测分析，并将结果通过TBtools软件进行可视化分析。

1.3   MeNRT2.6基因的克隆

从木薯基因组数据库下载木薯MeNRT2.6基因序列信息，使用Primer5.0软件设计特异引物，引物序列见表1。以木薯C3叶片cDNA为模板进行PCR扩增。

表  1  引物名称及序列

Table  1.  Primer names and sequences

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence
HYG-F	ATGAAAAAGCCTGAACTCACC
HYG-R	CTATTTCTTTGCCCTCGGACG
GFP-F	ACAAGTTCAGCGTGTCCG
GFP-R	CTCGTTGGGGTCTTTGCT
Xba I/NRT2.6cds-F	GCTCTAGAGC CATGGCTCAATCTCTTCTCCTGC
Kpn I/NRT2.6cds-R	GGGGTACCCC GGTAATCTTCAGCATCTTCGGCAG
MeActin-F	TGATGAGTCTGGTCCATCCA
MeActin-R	CCTCCTACGACCCAATCTCA
MeCN2.6-F	TCTGCGATCTCCTGGGTCCTC
MeCN2.6-R	ATCCAGAACTGATTAGCGACGAAG

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1.4   MeNRT2.6蛋白亚细胞定位

将MeNRT2.6基因CDS全长构建于16318-hGFP表达载体，将连接产物转化至大肠埃希菌DH5α，并将测序正确的重组载体质粒在拟南芥原生质体中瞬时表达。

1)原生质体制备：挑取长势良好的拟南芥叶片在超净工作台中切成0.5~1.0 mm宽的细丝，放入装有已过滤除菌的酶解液的无菌锥形瓶中，遮光处理后放入转速为50 r/min的摇床中酶解2~3 h；加入等体积的W5缓冲液终止酶解反应，用去掉针头的注射器吸取酶解产物，用70 µm Cell Strainer过滤到无菌锥形瓶中；4 ℃、800 r/min离心8 min，弃上清液。向锥形瓶缓缓加入10 mL预冷W5缓冲液，4 ℃、800 r/min离心8 min，弃上清液；缓慢加入10 mL预冷W5缓冲液重悬原生质体，冰浴30 min；4 ℃、800 r/min离心8 min，弃上清液；用MMG缓冲液重悬原生质体。

2)原生质体转化：取200 µL原生质体放入2 mL EP管中，加入10 µg重组质粒16318-MeNRT2.6-hGFP(去内毒素)，轻弹管壁混匀，室温放置5 min。加入210 µL PEG溶液，立即轻柔颠倒混匀，室温放置20 min；在室温下，于800 r/min 轻柔离心8 min，弃上清液；用1 mL WI缓冲液重悬原生质体，弱光下室温孵育过夜。在室温下，于800 r/min轻柔离心8 min，弃上清液；加入1 mL WI缓冲液重悬原生质体，在室温下，于800 r/min轻柔离心8 min，弃上清液；重复上一步操作；加入100 µL WI缓冲液，取20 µL重悬液于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.5   木薯MeNRT2.6基因表达模式分析

为明确木薯MeNRT2.6基因在不同硝态氮处理条件下的表达模式，分别提取不同硝态氮处理的木薯C3组培苗的根、茎、叶RNA，反转录后通过RT-qPCR进行表达模式分析。

1.5.1   材料处理

选取长势、长度、粗细等一致的木薯C3茎尖，分别扦插于正常MS培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度19.5 mmol/L、${\mathrm{NO}}_3^- $浓度39.5 mmol/L)中生根发芽，30 d后木薯茎尖已长为幼苗。将生长发育状态基本一致的木薯C3组培苗在不同KNO₃浓度培养基中进行处理。植株幼苗生长条件为光周期12 h光/12 h暗，温度25 ℃，相对湿度50%。分别采集各处理幼苗根、茎、叶肉、叶脉、叶柄作为试验材料，用液氮速冻后储存于−80 ℃冰箱内备用。

处理1：将木薯幼苗移至0.5 mmol/L KNO₃培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度与MS培养基一致，19.5 mmol/L)中处理6 d。

处理2：将木薯幼苗移至无氮条件处理6 d后，直接转入0. 5 mmol/L KNO₃培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度为0)中处理6 d。

处理3：将木薯幼苗无氮处理6 d后，转入39.5 mmol/L KNO₃培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度为0)中处理6 d。

处理4：将木薯幼苗无氮处理6 d后，先转入0.5 mmol/L KNO₃培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度为0)中处理6 d，再移至39.5 mmol/L KNO₃培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度为0)中处理6 d。

处理5：将木薯幼苗无氮处理6 d后，先转入39.5 mmol/L KNO₃培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度为0)中处理6 d，再转至0.5 mmol/L KNO₃培养基(${\mathrm{NH}}_4^+ $浓度为0)中处理6 d。

1.5.2   RT-qPCR

按照天根生物的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行木薯RNA提取，并利用艾科瑞生物科技有限公司的EvoM-MLV反转录预混型试剂盒将木薯RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒进行RT-qPCR检测，以MeActin为内参基因，每个反应设3次生物学重复，用2^−△△CT法分析结果，使用GraphPad Prism 8.3进行制图和差异显著性分析。

1.6   MeNRT2.6基因过表达拟南芥株系构建

采用浸花法构建异源表达拟南芥株系：设计基因特异引物，引物序列见表1，构建植物表达载体pCAMBIA1300-MeNRT2.6-GFP，提取质粒后进行农杆菌LBA4404转化，摇菌至D_{600 nm} = 0.4~0.5，浸染拟南芥花序。收获的种子在含有30 µg/mL潮霉素(Hygromycin，Hyg)的选择性培养基上进行筛选，以获得带有目标基因的转基因植株T₂代纯合种子。利用天根生物的高效植物基因组DNA提取试剂盒提取初步筛选的T₂代转基因拟南芥植株叶片DNA和RNA，通过PCR、RT-qPCR进一步筛选并鉴定阳性植株。

1.7   低/高浓度硝态氮处理下过表达及野生型拟南芥氮同化关键酶活性等指标测定

将拟南芥种子消毒后播种于MS培养基中生根发芽，待长出2片子叶后，选取长势一致的幼苗分别移栽于0.5、39.5 mmol/L KNO₃培养基中处理7 d。每个处理分别选取6棵植株进行指标检测：用直尺测量植株的根长、株高；擦干植株表面水分，利用分析天平称量植株鲜质量；分别采用苏州科铭生物技术有限公司的硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)活性测定试剂盒(微量法)、亚硝酸还原酶(Nitrite reductase，NiR)试剂盒(微量法)、谷氨酸合成酶(Glutamate synthase，GOGAT)试剂盒(微量法)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)试剂盒(微量法)进行氮同化关键酶活性检测，每个处理设置3次生物学重复，取试验结果平均值进行统计分析。

2.   结果与分析

2.1   低氮条件下木薯MeNRT2基因的转录组数据

利用已有的转录组数据^[23]，从低氮处理中筛选低氮条件下表达量较高的MeNRT2基因。结果如图1所示：低氮条件下，根中表达量最高的基因为MeNRT2.2和MeNRT2.6，并且与MeNRT2基因不同的是，MeNRT2.6基因在根、茎、叶中均有较高表达。

图  1  木薯MeNRT2基因转录组热图

Figure  1.  Transcriptome heatmap of cassava MeNRT2 gene

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2.2   木薯MeNRT2.6蛋白系统进化

为研究木薯MeNRT2.6蛋白与其他物种中同源蛋白的亲缘关系，本研究采用MEGA软件中的邻接法对木薯MeNRT2蛋白家族(6个成员)、拟南芥AtNRT2家族(7个成员)以及玉米部分ZmNRT2家族(5个成员)、水稻OsNRT2家族(4个成员)、草莓FvNRT2.7、毛果杨PtNRT2家族(5个成员)、番茄SlNRT2.7以及LeNRT2家族(4个成员)、小麦TaNRT2-7A/B/D、花生AhNRT2.7a/b、白菜BnNRT2.7a/b、烟草NtNRT2.4进行进化分析，结果如图2所示。木薯MeNRT2.6蛋白与毛果杨PtNRT2.7亲缘关系最近，序列相似性为74.5%。与其他MeNRT2成员相比，MeNRT2.5与MeNRT2.6的序列相似性较高，也仅为60.1%。上述结果表明，木薯MeNRT2.6蛋白与毛果杨PtNRT2.7蛋白相似度较高，推测二者功能可能存在一定相似性。

图  2  MeNRT2.6蛋白系统发育树

Figure  2.  Phylogenetic tree of MeNRT2.6 protein

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使用SMART在线网站对MeNRT2蛋白进行结构域预测，6个MeNRT2编码蛋白序列高度保守，均包含MFS_1结构域和跨膜结构域(Transmembrane region)。

2.3   木薯MeNRT2.6基因启动子顺式作用元件

通过PlantCARE网站对木薯MeNRT2.6基因及其同源基因上游2 000 bp启动子序列的顺式作用元件进行分析。木薯MeNRT2.6基因启动子顺式作用元件除大量的光响应元件外，存在低氮、干旱等逆境类响应元件(MYB、Myb、MRE)以及激素类响应元件(ABRE、ERE、GA-motif、CGTCA-motif、TGACG-motif)。表明木薯MeNRT2.6基因及其同源基因除了受光、激素诱导外，可能还参与植物低氮、干旱等逆境胁迫。

2.4   木薯MeNRT2.6蛋白结构

利用SPOMA以及SWISS-MODEL在线分析工具对木薯MeNRT2.6蛋白结构分析可知，MeNRT2.6二级结构主要包括α−螺旋、β−折叠、延伸链和无规则卷曲，其中α−螺旋占比较高，为48.03%，其次是无规则卷曲，占比30.26%。MeNRT2.6蛋白三级结构主要包含2种单体，分别为糖转运蛋白结构单体和MFS转运体的晶体结构。

2.5   木薯MeNRT2.6蛋白亚细胞定位

通过拟南芥原生质体瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察到，16318-MeNRT2.6-hGFP融合蛋白的绿色荧光信号出现在细胞膜上(图3)，并与膜定位marker蛋白PIP2;1-mCherry的红紫光信号重合，说明MeNRT2.6蛋白定位于细胞膜。

图  3  MeNRT2.6蛋白亚细胞定位

Figure  3.  Subcellular localization of MeNRT2.6 protein

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2.6   木薯MeNRT2.6基因表达模式

为了阐明不同硝态氮浓度下MeNRT2.6基因在木薯C3不同组织中的表达特性，本研究分别提取低浓度和高浓度硝态氮处理木薯根、茎、叶脉、叶肉和叶柄RNA，反转录后进行RT-qPCR分析。

2.6.1   低浓度硝态氮处理下MeNRT2.6基因的表达模式

低氮处理分为3种处理方式，分别为“1.5.1”的处理1、2和5。处理1条件下MeNRT2.6基因主要在根中表达(图4A)。为消除MS培养基对木薯组培苗的影响，随后统一对幼苗进行氮饥饿(无氮)处理6 d，再分别用不同浓度硝态氮进行处理。无氮处理后移入0.5 mmol/L KNO₃(处理2)，MeNRT2.6基因主要在叶脉、茎中表达；无氮处理后先移入39.5 mmol/L KNO₃处理，再移入0.5 mmol/L KNO₃处理(处理5)，MeNRT2.6基因主要在茎和叶肉中表达(图4B、４C)。

图  4  低浓度硝态氮处理(1、2、5)下木薯MeNRT2.6组织特异性表达

R：根，S：茎，M：叶肉，L：叶脉，P：叶柄；各小图中均以表达量最低的组织为对照；*和**分别表示与对照在P<0.05和P<0.01水平差异显著（t检验）。

Figure  4.  Tissue-specific expression of cassava MeNRT2.6 under low nitrate nitrogen treatment (1, 2, 5)

R: Root, S: Stem, M: Mesophyll, L: Leaf vein, P: Petiole; All using the tissue with the lowest expression level as the control in each figure; * and ** indicate significant differences compared to the control at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test).

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在${\mathrm{NH}}_4^+ $存在时，植株从(正常MS培养基)转移至低浓度硝态氮(处理1)，MeNRT2.6基因的表达主要在根中受到显著诱导(图5A)。而在没有${\mathrm{NH}}_4^+ $存在时，植株从高浓度硝态氮(正常MS培养基)移至低浓度硝态氮(处理2和5)，MeNRT2.6基因主要在茎中表达，不同浓度硝态氮处理下该基因在茎中的表达量无显著变化(图5B)。在没有${\mathrm{NH}}_4^+ $存在时，植株从氮饥饿条件转至低浓度硝态氮处理(处理2)，MeNRT2.6基因主要在叶肉和叶脉中受显著诱导(图5C)。

图  5  低浓度硝态氮处理下木薯MeNRT2.6的诱导表达

各小图中均以MS处理为对照；*和**分别表示与对照在P<0.05和P<0.01水平差异显著（t检验）。

Figure  5.  Inducible expression of cassava MeNRT2.6 under low nitrate nitrogen treatment

The MS treatment was used as the control in each figure; * and ** indicate significant differences compared to the control at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test).

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2.6.2   高浓度硝态氮处理下MeNRT2.6基因的表达模式

高浓度硝态氮处理主要有2种方式，即分别将木薯幼苗从无氮处理和低浓度硝态氮(0.5 mmol/L KNO₃)处理转移至高浓度硝态氮(39.5 mmol/L KNO₃)培养基(处理3、4)。RT-qPCR结果表明，MeNRT2.6在2种处理中均主要在叶肉和叶脉表达(图6)。

图  6  高硝态氮处理(3、4)下木薯MeNRT2.6组织特异性表达

R：根，S：茎，M：叶肉，L：叶脉，P：叶柄；各小图中均以表达量最低的组织为对照；*表示与对照在P<0.05水平差异显著（t检验）。

Figure  6.  Tissue-specific expression of cassava MeNRT2.6 under high nitrate nitrogen treatment (3, 4)

R: Root, S: Stem, M: Mesophyll, L: Leaf vein, P: Petiole; Both using the tissue with the lowest expression level as the control in each figure; * indicates significant difference compared to the control at P<0.05 level (t test).

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在这2种处理下，MeNRT2.6基因在叶肉和叶脉中的表达模式大致相同，均受氮饥饿处理显著抑制，添加低浓度或高浓度硝态氮后，抑制程度减弱(图7)。

图  7  高浓度硝态氮处理下木薯MeNRT2.6的诱导表达

各小图中均以无氮处理为对照；*和**分别表示与对照在P<0.05和P<0.01水平差异显著（t检验）。

Figure  7.  Inducible expression of cassava MeNRT2.6 under high nitrate nitrogen treatment

No nitrogen treatment was used as the control in each figure; * and ** indicate significant differences compared to the control at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test).

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2.7   拟南芥转基因植株鉴定

本研究通过浸花法创制稳定遗传的过表达MeNRT2.6基因的拟南芥T₂代株系，经PCR(GFP和HYG通用引物，图8A)以及RT-qPCR(图8B)鉴定，以表达量最高的3个过表达纯系株系OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6作为后续研究对象。

图  8  拟南芥MeNRT2.6过表达转基因株系鉴定

WT：野生型；OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6：转基因阳性株系；OE2.6-4、OE2.6-5、OE2.6-12；非转基因阳性株系。

Figure  8.  Identification of MeNRT2.6 overexpression transgenic lines in Arabidopsis thaliana

WT: Wild type; OE2.6-1, OE2.6-2, OE2.6-6: Transgenic positive lines; OE2.6-4, OE2.6-5, OE2.6-12: Not transgenic positive lines.

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2.8   低浓度硝态氮胁迫下过表达MeNRT2.6对拟南芥生长与氮代谢关键酶的影响

在无菌条件下，待MeNRT2.6过表达纯系OE2.6-1、OE2.6-2和OE2.6-6转基因种子发芽长出2片子叶后分别转接至0.5 mmol/L ${\mathrm{NO}}_3^- $MS培养基(无${\mathrm{NH}}_4^+ $)中处理7 d。肉眼可见，过表达株系的茎段和叶柄部位偏紫色，而野生型对照的相应部位并没有呈现出紫色表型(图9)。

图  9  低浓度硝态氮胁迫下拟南芥转基因植株表型

WT：野生型，OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6：转基因阳性株系。

Figure  9.  Phenotype of Arabidopsis thaliana transgenic lines under low nitrate nitrogen stress

WT: Wild type, OE2.6-1, OE2.6-2, OE2.6-6: Transgenic positive lines.

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进一步测量发现：在0.5 mmol/L ${\mathrm{NO}}_3^- $条件下，OE2.6-1、OE2.6-2株系的主根长度分别为5.90、5.35 cm，均显著高于野生型(3.28 cm)(图10A)。3个转基因株系的株高分别为2.60、1.31、1.87 cm，同样显著高于野生型(0.61 cm) (图10B)。过表达株系的鲜质量与野生型株系无显著差异(图10C)。

图  10  低浓度硝态氮胁迫下拟南芥转基因植株表型指标比

WT：野生型，OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6：转基因阳性株系；*和**分别表示与野生型在P<0.05和P<0.01水平差异显著（t检验）。

Figure  10.  Phenotypic indicators of Arabidopsis thaliana transgenic plants under low nitrate nitrogen stress

WT: Wild type, OE2.6-1, OE2.6-2, OE2.6-6: Transgenic positive lines; * and ** indicate significant differences compared to wild type at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test).

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为进一步明确低浓度硝态氮条件下在拟南芥中过表达MeNRT2.6是否会对植株氮素利用造成一定影响，本研究对3个过表达株系与野生型的氮代谢关键酶活进行了测定，结果如图11所示。3个转基因株系OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6的NR活性分别为48.06、88.25、62.35 nmol/(min×g)，显著高于野生型的15.59 nmol/(min×g)；相较于野生型，过表达转基因株系的GS活性提高了18%~42%，NIR活性提高了28%~282%，GOGAT活性提高了94%~196%。

图  11  低硝态氮胁迫下拟南芥转基因植株氮代谢关键酶活性

WT：野生型，OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6：转基因阳性株系。*和**分别表示与野生型在P<0.05和P<0.01水平差异显著（t检验）。

Figure  11.  Key enzyme activities of nitrogen metabolism in Arabidopsis thaliana transgenic plants under low nitrate nitrogen stress

WT: Wild type, OE2.6-1, OE2.6-2, OE2.6-6: Transgenic positive lines; * and **indicate significant differences compared to wild type at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test).

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2.9   高浓度硝态氮处理下过表达MeNRT2.6对拟南芥生长与氮代谢关键酶的影响

本研究将已经生根发芽的野生型和过表达拟南芥株系移栽至添加有39.5 mmol/L ${\mathrm{NO}}_3^- $的培养基中处理7 d，对转基因拟南芥与野生型的生理进行测定，结果如图12、13所示。高浓度硝态氮处理7 d后，过表达转基因株系OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6的主根长度分别为8.33、9.10、8.31 cm，野生型为6.55 cm；在株高方面，仅OE2.6-6显著高于野生型；转基因株系OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6的植株鲜质量与野生型无显著差异，分别为0.050、0.074、0.059、0.038，SPAD值也均无显著差异。

图  12  高硝态氮处理下拟南芥转基因植株表型

WT：野生型，OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6：转基因阳性株系。

Figure  12.  Phenotype of Arabidopsis thaliana transgenic plants under high nitrate nitrogen treatment

WT: Wild type, OE2.6-1, OE2.6-2, OE2.6-6: Transgenic positive lines.

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图  13  高硝态氮处理下拟南芥转基因植株生理指标

WT：野生型，OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6：转基因阳性株系。*表示与野生型在P<0.05水平差异显著（t检验）。

Figure  13.  Physiological indicators of Arabidopsis thaliana transgenic plants under high nitrate nitrogen treatment

WT: Wild type, OE2.6-1, OE2.6-2, OE2.6-6: Transgenic positive lines; * indicates significant difference compared to wild type at P<0.05 level (t test).

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为进一步明确高浓度硝态氮条件下在拟南芥中过表达MeNRT2.6是否会对植株氮素利用造成一定影响，本研究对3个过表达株系与野生型的氮代谢关键酶活进行了测定，结果如图14所示。3个转基因株系中仅OE2.6-6的NR活性与野生型差异显著，分别为116.90、44.81 nmol/(min×g) (图14A)。OE2.6-1、OE2.6-6的NIR活性分别为9.89、10.21μmol/(h×g)，显著高于WT株系的4.45 μmol/(h×g) (图14B)。3个转基因株系的GS活性略低于野生型，但差异并不显著(图14C)。

图  14  高浓度硝态氮处理下拟南芥转基因植株氮代谢关键酶活性

WT：野生型，OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6：转基因阳性株系。*和**分别表示与野生型在P<0.05和P<0.01水平差异显著（t检验）。

Figure  14.  Key enzyme activities of nitrogen metabolism in Arabidopsis thaliana transgenic plants under high nitrogen stress

WT: Wild type, OE2.6-1, OE2.6-2, OE2.6-6: Transgenic positive lines; * and **indicate significant differences compared to wild type at P<0.05 and P<0.01 levels respectively (t test).

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3.   讨论与结论

硝酸盐的吸收和利用是氮素有效利用的关键因素。NRT2是植物氮吸收和转运系统中重要的生物大分子之一^[24-25]，在低浓度外源硝酸盐的吸收和利用中发挥重要作用^{[10, 26-28]}。在对木薯MeNRT2.6同源基因的研究中发现，部分同源基因与植物氮素利用效率、根系生长高度相关^{[14, 20-21]}，在植物氮高效种质资源的开发和利用中具有较高潜力^[29-31]；如氮利用效率相关参数与番茄RO(基因型)芽中SlNRT2.7表达水平具有强相关性^[14]，过表达AhNRT2.7a能显著提高花生的氮素利用效率^[21]等。

本研究以转录组筛选出的低氮条件下在木薯根、茎、叶中均具有较高表达的MeNRT2.6基因作为研究对象。以木薯C3品种的cDNA为模板进行PCR扩增获得MeNRT2.6基因片段，由生物信息学与原生质体亚细胞定位分析可知，木薯MeNRT2.6蛋白定位于细胞膜，预测其三级结构含有糖转运蛋白结构单体和MFS转运体的晶体结构，与前人研究结果^[32]相似。唐贤礼等^[20]研究表明，毛果杨PtNRT2.7能够被茉莉酸、赤霉素等多种激素诱导，并且参与调控叶片硝酸盐通量平衡^[20]。由生物信息学分析可知，木薯MeNRT2.6与毛果杨PtNRT2.7蛋白的亲缘关系最近，氨基酸序列相似性为74.5%；并且，二者启动子区域均存在低氮、干旱等逆境类响应元件(MYB、Myb、MRE)以及赤霉素、生长素、茉莉酸等激素类响应元件(ABRE、ERE、GA-motif、CGTCA-motif、TGACG-motif)。以上结果表明，木薯MeNRT2.6蛋白可能与毛果杨PtNRT2.7功能相似，能响应多种激素信号并参与抵抗逆境胁迫^[20]。

为明确MeNRT2.6基因的表达模式，对木薯MeNRT2.6基因进行了2种硝态氮处理试验，分别为0.5 mmol/L硝态氮胁迫试验以及39.5 mmol/L硝态氮处理试验。其中，低浓度硝态氮胁迫试验分为3种处理，即0.5 mmol/L KNO₃(19.5 mmol/L ${\mathrm{NH}}_4^+ $)培养基中处理6 d(处理1)；无氮处理6 d后，转入0.5 mmol/L KNO₃培养基(无${\mathrm{NH}}_4^+ $)中处理6 d(处理2)；无氮处理6 d后，先转入39.5 mmol/L KNO₃培养基(无${\mathrm{NH}}_4^+ $)中处理6 d，再转至0.5 mmol/L KNO₃培养基(无${\mathrm{NH}}_4^+ $)中处理6 d(处理5)。在高浓度${\mathrm{NH}}_4^+ $(19.5 mmol/L)存在时，植株从高浓度硝态氮移至低浓度硝态氮，MeNRT2.6基因的表达主要在根中受到显著诱导。在没有${\mathrm{NH}}_4^+ $时，植株从氮饥饿条件转至0.5 mmol/L硝态氮处理，MeNRT2.6基因在叶中的表达量上调，表明MeNRT2.6基因可能参与调控叶片中硝酸盐含量；在没有${\mathrm{NH}}_4^+ $存在时，植株从高浓度硝态氮移至低浓度硝态氮，MeNRT2.6基因的表达在茎中被显著诱导。高浓度硝态氮试验主要有２种处理模式，均为将木薯幼苗从低浓度硝态氮(无氮、0.5 mmol/L KNO₃)培养基移至39.5 mmol/L硝态氮培养基，MeNRT2.6基因均主要在叶中的表达量受到明显诱导。以上结果反映了MeNRT2.6基因表达模式的复杂性，在不同氮浓度处理条件下，MeNRT2.6基因的表达部位存在差异，基因发挥的功能可能也并不一致；因此，MeNRT2.6基因功能具有复杂性。

衡量氮利用效率的标准受多种因素影响，静态的单一性状不能准确反映氮利用效率。植株对氮素的吸收、转运和利用均可能影响其氮素利用效率^[33-35]。多位学者^[36-41]通过主成分分析和聚类分析方法，对不同植物的多个品种进行氮效率评价，结果显示，相同植物氮高效品种的株高、鲜质量、叶绿素含量、总根长以及NR、NiR、GS、GOGAT等氮同化关键酶活性显著高于氮低效品种。叶利庭等^[42]进一步研究发现，水稻GS活性在不同生长时期均与外部氮浓度呈显著(P<0.05)相关，而NR仅在齐穗期与氮浓度呈极显著(P<0.01)正相关。综上所述，植株NR活性、GS活性、株高、鲜质量、叶绿素含量、总根长等可作为氮高效种质的筛选指标。本研究中，对将MeNRT2.6在拟南芥中异源表达所获得的过表达拟南芥株系进行筛选验证后，共筛选出OE2.6-1、OE2.6-2、OE2.6-6这3个表达量最高的转基因株系，并对其进行不同浓度硝态氮处理。结果发现，在低浓度硝态氮处理条件下，过表达拟南芥株系的株高、鲜质量、主根长、GS活性、NR活性、NIR活性等氮效率主要评价指标均高于野生型。由此表明，在拟南芥中过表达MeNRT2.6基因能提高拟南芥在低浓度硝态氮处理条件下的氮素利用效率。在高浓度硝态氮处理条件下，与野生型相比，3个过表达株系的主根长、株高、SPAD、NR活性、NIR活性均有所增加，但GS活性却降低，因此，在高浓度硝酸盐供应条件下，在拟南芥中异源表达MeNRT2.6基因是否能促进植株的氮素利用效率，仍需进一步验证。

作为陆生植株吸收的主要氮源之一^{[24, 43]}，硝态氮对植物产量和品质具有重要作用^[44-45]。提高植物氮素吸收能力和氮素利用效率是解决当下氮源污染的有效途径。通过在拟南芥中过表达MeNRT2.6基因发现，该基因可能与植物氮素利用效率高度相关，但在木薯中是否具有同样功能以及相关作用机制仍不明晰，因此，拟通过木薯遗传转化体系获得过表达MeNRT2.6基因木薯株系，经筛选鉴定后，对该过表达株系进行氮效率评价，以期研发出该基因在木薯氮素利用效率方面的功能。