Association analysis of BMP6 gene polymorphisms with growth and slaughter traits in Yuexi Frizzled Feather chicken
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摘要:目的
探讨BMP6基因多态性对粤西卷羽鸡生长性状及屠宰性状的影响。
方法以120只粤西卷羽鸡为试验材料，对BMP6基因外显子设计特异性扩增引物，采取PCR产物直接测序法分析SNP位点，利用单因素方差分析对SNP位点基因型与生长性状及屠宰性状进行关联分析。
结果在BMP6基因外显子区域共检测到7个SNP位点，其中，g.64185950 T>C、g.64195411 G>A和g.64195613 C>T处于编码区，均为同义突变。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，g.64195833 T>A在粤西卷羽鸡群体中显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。基因型与生长性状关联分析结果表明：在公鸡中，g.64195613 C>T位点CC基因型胫长显著高于TT基因型(P<0.05)；在母鸡中，g.64195411 G>A位点AA基因型龙骨长显著高于AG基因型(P<0.05)，g.64196373 T>C位点CC基因型胫长极显著高于CT基因型(P<0.01)，g.64196735 T>C位点CT基因型胫长显著高于TT基因型(P<0.05)。基因型与屠宰性状关联分析结果表明：在公鸡中，g.64196735 T>C位点CC基因型活体质量显著高于CT基因型(P<0.05)；在母鸡中，g.64195613 C>T位点CC基因型腹脂率显著高于CT基因型(P<0.05)，g.64196373 T>C位点CC基因型半净膛率显著高于CT基因型(P<0.05)。
结论BMP6基因多态性与粤西卷羽鸡的部分生长性状及屠宰性状相关，可作为粤西卷羽鸡标记辅助选择的候选基因。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of BMP6 gene polymorphism on growth and slaughter traits of Yuexi Frizzled Feather chicken.
MethodA total of 120 Yuexi Frizzled Feather chickens were used as experimental materials. Specific primers were designed for the exon fragment of the BMP6 gene. The SNP sites were detected by direct sequencing of PCR products. The single factor analysis of variance was used to analyze the associations of genotypes with growth and slaughter traits for each SNP site.
ResultSeven SNP sites were detected in the exon region of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather chicken, among which g.64185950 T>C, g.64195411 G>A and g.64195613 C>T were in the coding sequence region, and all these three SNPs were synonymous mutations. The results of Hardy-Weinberg equilibrium test showed that g.64195833 T>A significantly deviated from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05) in the Yuexi Frizzled Feather chicken. The results of association analysis between genotypes and growth traits showed that, in cocks, the shank bone length in CC genotype of g.64195613 C>T site was significantly higher than that of TT genotype (P<0.05), and in hens, the keel length in AA genotype of g.64195411 G>A site was significantly higher than that of AG genotype (P<0.05), the tibia length in CC genotype of g.64196373 T>C site was significantly higher than that of CT genotype (P<0.01), the tibia length in CT genotype of g.64196735 T>C site was significantly higher than that of TT genotype (P<0.05). The results of association analysis between genotypes and slaughter traits showed that, in cocks, the live weight in CC genotype of g.64196735 T>C site was significantly higher than that of CT genotype (P<0.05), and in hens, the abdominal fat rate in CC genotype of g.64195613 C>T site was significantly higher than that of CT genotype (P<0.05), and the half-bore weight rate in CC genotype of g.64196373 T>C site was significantly higher than that of CT genotype (P<0.05).
ConclusionThe BMP6 gene polymorphisms are associated with some growth and slaughter traits, which can be used as a candidate gene for marker-assisted selection in Yuexi Frizzled Feather chicken.
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近些年来，随着国民经济的快速发展与城市化进程的加快，废水排放量不断增加，给水资源保护和利用带来了巨大压力和挑战。废水中氨氮和总磷是导致水体富营养化的主要原因，其中畜禽养殖场禽畜排泄物和饲料导致养殖废水中氨氮和总磷含量较高，尤其是猪场水泡粪工艺收集的养殖废水，氨氮质量浓度高达2 300 mg/L，总磷质量浓度可达250~500 mg/L[1-4]，如何降低养殖废水中氨氮和总磷浓度成为全球研究热点。
传统化学法除磷，成本昂贵；物理法吹脱氨气，能耗巨大。相比于物理、化学法，生物法处理具有明显的低成本优势[5]。传统生物法脱氮在厌氧阶段需要投加额外的有机碳源，增加处理过程中的能耗与成本[6]；而厌氧氨氧化工艺(Anammox)可在厌氧条件下，通过厌氧氨氧化菌将NH4+−N和NO2−−N转化为N2[7]，该工艺节约了曝气的能源消耗以及有机碳源的添加，剩余污泥量少，且温室气体(如CO2、N2O、NO等)的排放量也相对较低[8]，脱氮效果好，是一种很有潜力的新型污水脱氮技术。
传统微生物燃料电池(Microbial fuel cell，MFC)耦合电化学和微生物过程处理污染物并同步发电，过程无需能耗且能输出能量，在双碳时代成为处理废水的一种关键技术[9-10]。当前，MFC已应用于生活污水、工业废水及农业废水等多种废水处理[11]。Wang等[12]使用固定化微藻光自养MFC处理生活废水，化学需氧量(Chemical oxygen demand，COD)、NH4+−N和PO43−−P的去除率分别为93.2%、95.9%、82.7%，最高输出电压为303.1 mV。Sonu等[13]使用H2O2修饰的碳化玉米芯阳极单室MFC处理印染废水，COD的去除率为89%，脱色效率达92%，最大开路电压(Open circuit voltage)为1.2 V。Min等[14]使用MFC处理猪场废水，COD、氨氮去除率分别为86%、83%，但PO43−−P基本未被去除甚至略微上升，试验最高输出电压为126 mV。
目前MFC常用构型主要有单室和双室，传统单室MFC存在库伦效率偏低、系统失稳、电极距离过近导致O2在阳极扩散限制产电细菌生长、阴极易受污染等问题[11, 15]。双室MFC通过分设阴极室和阳极室，中间使用质子交换膜分隔，规避了单室MFC存在的上述问题。
厌氧氨氧化工艺可应用于双室MFC，将厌氧氨氧化污泥接种至阳极，发生氧化反应产生电子并去除氨氮，实现脱氮效率更高、能耗更低的目标。Hassan等[16]将厌氧氨氧化污泥接种到阳极以处理垃圾渗滤液，总氮去除率达到94%，证明厌氧氨氧化污泥的“阳极接种”有利于脱氮。此外，MFC的阴极室可利用光合藻类接受电子，在藻类生长的同时处理污染物[17]，提高藻类生物量，而收获的藻类又能用于发酵产生物气或油。在常见的微藻种类中，小球藻具有适应性强、CO2固定效果好的特点，在产电效能上更具优势[15]。严茜[18]将微藻附着在可旋转的生物膜上作为阴极构建MFC，成功处理了垃圾渗滤液，其中COD的最高去除率为91.75%，氨氮去除率为91.53%。目前关于双室MFC的研究大多采用单生物电极，另一极为氧化还原能力较强的金属电极，利用细菌和藻类组成的双生物微生物燃料电池(Dual microbial fuel cell，DMFC)能以更低廉的成本处理大量废水并生产能源，但难点在于阳极菌的筛选。阳极微生物需要具备以下特点：1)能在代谢过程中产生电子；2)能耐受废水中高浓度的氨氮和总磷；3)不影响阴极微藻的生长。有研究表明，光合藻类微生物燃料电池(Photosynthetic algal microbial fuel cell)中的微藻能与产电菌组成菌藻共生系统，进行物质交换，提高MFC对外界环境的耐受性[15]。除此之外，厌氧氨氧化污泥能耐受高氨氮环境，并且能在厌氧状态下利用氨氮进行代谢，此过程产生的电子可以被阴极微藻利用，因此利用厌氧氨氧化污泥和微藻组成双生物电极的燃料电池在理论上具有可行性。
本试验以厌氧氨氧化污泥为阳极微生物、以小球藻为阴极微生物制备厌氧氨氧化污泥耦合小球藻的DMFC，探究双生物电池对养殖废水中高浓度氨氮和总磷的去除效果，并监测该系统同步产电性能，为解决当前能源问题、碳排放问题与养殖废水处理问题提供新途径。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 厌氧氨氧化污泥
生物阳极接种厌氧氨氧化污泥，厌氧氨氧化污泥购自甲乙环保有限公司(江苏)，购回的厌氧氨氧化污泥在4 ℃冰箱保存备用。
1.1.2 小球藻
生物阴极接种小球藻(FACHB-30)，小球藻购自中国科学院淡水藻种库。首先将购回的小球藻放至BG-11培养基，于30 ℃培养8 d后，8 000 r/min离心5 min，倒掉上清液，将藻泥用蒸馏水振荡均匀后转移至阴极室培养。BG-11培养基成分(以1 L计)：150 g/L NaNO3溶液10 mL、40 g/L K2HPO4溶液4 mL、75 g/L MgSO4·7H2O溶液1 mL、36 g/L CaCI2·2H2O溶液1 mL、6 g/L柠檬酸溶液1 mL、6 g/L柠檬酸铁铵溶液1 mL、1 g/L EDTA溶液1 mL、20 g/L Na2CO3溶液1 mL、A5微量金属溶液1 mL。其中A5微量金属溶液组成(以1 L计)：H3BO3 2.86 g、MnCl2·4H2O 1.86 g、ZnSO4·7H2O 0.22 g、Na2MoO4·2H2O 0.021 g、CusO4·5H2O 0.08 g、Co(NO3)2·6H2O 0.05 g。BG-11液体培养基配置完成后，用1 mol/L的HCl溶液和1 mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0，经121 ℃高压灭菌30 min后备用。
1.1.3 模拟废水
本试验以水泡粪工艺的猪场废水为参照，模拟废水中设计可溶性化学需氧量(Soluble chemical oxygen demand，SCOD)，氨氮、NO2−−N和总磷质量浓度分别为3 000，1 500、420和40 mg/L[19-23]。猪场原水取自广东省农业科学院动物科学研究所（水产研究所），并添加以下成分(以1 L计)：CH3COONa 1.5 g、(NH4)2SO4 3.326 4 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 0.75 g、NaNO2 6.477 6 g、EDTA 15 g、ZnSO4·7H2O 0.43 g、CoCl2·6H2O 0.29 g、MnCl2·4H2O 0.99 g、CuSO4·5H2O 0.25 g、Na2MoO4·2H2O 0.22 g、NiCl2·2H2O 0.19 g、H3BO4 0.014 g、NaWO4·2H2O 0.05 g，获得试验模拟废水。模拟废水中实际SCOD，氨氮、NO2−−N和总磷质量浓度分别为2 930.00，1 588.97、422.73和39.22 mg/L，C∶N为1.84。
1.2 试验装置
本试验燃料电池容器由有机玻璃制成，分为阳极室和阴极室，两室有效容积均为400 mL，中间用阳离子交换膜(Nafion N117，183 μm，5 cm × 5 cm)分隔，阳极和阴极均采用石墨棒电极，其规格为6 mm × 90 mm，电极的表面积均为1 753 mm2，阴、阳极之间的数据采集卡(DAQM-
4202 ，西安周正电子科技)用于记录装置电压，三者之间由铜丝连接(图1)。阳极室和阴极室上各有3个孔，1个用于更换底物，1个插入电极，1个作为出气口(备用)，用橡胶管将两室的出气口封堵。![]()
图 1 试验装置模拟图(A)和实物图(B)1：阳极室(厌氧氨氧化污泥)，2：阴极室(小球藻)，3：阳离子交换膜，4：石墨棒电极，5：数据采集卡；废水从进水口a处进入装置，停留24 h后从出水口a处排出并收集，循环利用至进水口b，停留24 h后从出水口b排出。Figure 1. Simulation image (A) and actual object image (B) of experiment apparatus1: Anode chamber (anaerobic ammonia oxidation sludge), 2: Cathode chamber (chlorella), 3: Cation exchange membrane, 4: Graphite rod electrode, 5: Data acquisition card; The wastewater enters the device from inlet a, and is then discharged and collected from outlet a after 24 h, it is recycled and used again at inlet b, where it stays for another 24 h before being discharged from outlet b.1.3 试验方法
将厌氧氨氧化污泥和模拟废水按1∶4(V/V)混合后，取400 mL投至DMFC阳极室，小球藻和BG-11培养基按1∶4(V/V)混合后，取400 mL加入DMFC阴极室，运行24 h后阳极开始出水，并将阳极出水加入阴极室中。整个反应器放置在恒温培养箱中，小球藻的最佳生长温度为30 ℃[24]，保证温度维持在(30±1) ℃，并设置生物光照灯，由于5 000 lx的光强照度适合大部分藻类生存[25]，而6 000 lx是小球藻吸收氨氮的最佳光照强度[26]，因此本试验的光照强度控制在5 500 lx。此外本试验设置了12 h黑暗、12 h光照的周期模式，以模拟自然环境中的日夜循环，避免长时间的光照导致光抑制[24]。试验过程中监测电压以及废水中SCOD，氨氮、NO2−−N、NO3−−N、总磷浓度和pH。当相邻2个周期的电压相似时，说明系统完成启动，进入了稳定运行阶段。稳定运行阶段重复以上操作。
1.4 测定项目
电压由数据采集卡每隔0.5 h采集1次，pH采用pH计(PHS-3C，上海)测定，SCOD采用重铬酸钾法(GB/T 11914—1989)[27]测定，总磷质量浓度采用钼酸铵分光光度法(GB/T 11893—1989)[28]测定，氨氮质量浓度采用纳氏试剂比色法(GB/T 7479—1987)[29]测定，NO3−−N质量浓度采用紫外分光光度法(GB/T 32737—2016)[30]测定， NO2−−N质量浓度采用N−(1−萘基)−乙二胺光度法(GB/T 13580.7—1992)[31]测定。
2. 结果与分析
2.1 双生物微生物燃料电池产电性能
电压反映MFC中微生物的电子交换能力，电压越高意味着MFC中微生物活性越强，图2表示了本研究DMFC的电压变化情况。本试验DMFC的电压存在正负交替现象，0—2 d电压先增加后下降，在第2天时达到电压负值高峰−353 mV，这可能是由于模拟光照期间小球藻进行光合作用，其利用碳源作电子供体时产电子能力大于厌氧氨氧化菌，因此小球藻所在室变为阳极室，厌氧氨氧化污泥所在室转变为阴极室。Ding等[19]采取在阴极接种厌氧氨氧化污泥，以亚硝酸盐和硝酸盐为电子受体发生还原反应；同样小球藻也有作阳极处理高氨氮废水的报道[20]。2 d后，电压又不断上升，在4—9 d获得整个试验周期最大正电压463 mV，大于Zhang等[21]报道的225 mV。9 d后电压急剧下降，这是由于在第9天时污泥中丝状菌大量繁殖，阳极室厌氧氨氧化污泥发生膨胀，导致厌氧氨氧化污泥上浮，沉降性能变差，降低厌氧氨氧化菌的活性，因此产电和去除污染物的能力有所下降。污泥膨胀是污泥中最常见的沉降问题，可能原因是长时间厌氧环境导致溶液中积累过多的挥发性有机酸，从而引起丝状菌的迅速繁殖[21-22]。但本试验在12 d后污泥膨胀得到缓解，系统恢复产电和去除污染物性能，在此期间厌氧氨氧化污泥虽受污泥膨胀影响，但电压变化仍呈规律性，换水后电压从负值逐渐升到正值，并在12 h内达到最大正电压。之后DMFC进入稳定运行阶段，其中平均正电压为51.9 mV，平均负电压为−24.7 mV，峰值电压分别为45与−125 mV，高于Zhang等[32]制作的厌氧氨氧化单极MFC的峰值电压39.8 mV。本试验构建的DMFC启动成功，并能通过生物调节克服厌氧氨氧化污泥膨胀的影响，实现系统稳定运行。
2.2 双生物微生物燃料电池脱氮性能
由图3A可见，厌氧氨氧化污泥在第1天对氨氮的去除率达到67.30%，但2—8 d氨氮质量浓度重新上升，说明厌氧氨氧化菌并未适应高氨氮的废水环境，此时由于其他微生物与厌氧氨氧化菌竞争基质，导致厌氧氨氧化污泥活性下降，处理效率降低。第8天开始厌氧氨氧化污泥逐渐适应了高氨氮环境，氨氮去除率开始升高，电压也达到463 mV。但在第9天由于有机酸累积出现污泥膨胀，丝状菌的快速生长抢占了厌氧氨氧化菌的生存空间[33]，这些丝状菌和厌氧氨氧化菌利用氨氮作为能源，同时产生细胞和生物聚集物，导致污泥体积膨胀，这期间丝状菌成为主要菌群，因此氨氮去除率没有进一步上升，但能维持在62.00%左右，并一直持续到系统稳定运行阶段。
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图 3 出水中氨氮(A)和NO2−−N(B)质量浓度的变化Figure 3. Mass concentration changes of ammonium nitrogen (A) and NO2−-N (B) in discharged wastewater由图3A可见，阴极室(小球藻)出水氨氮浓度与前1 d阳极室出水呈现相近的规律，说明小球藻在阴极室对阳极室出水的氨氮没有进一步去除。有研究[34]表明小球藻具备处理高氨氮废水的能力，但在本研究中并未发现；主要原因是小球藻在400 mg/L的氨氮质量浓度下可正常生长，不需要过长的适应时间，而本试验系统稳定运行阶段阳极出水的氨氮质量浓度最低也达到了602.75 mg/L，超过了小球藻正常生长时氨氮的质量浓度范围，小球藻在高氨氮环境下需要较长适应时间，适应完成后小球藻才能高效利用废水中的氨氮进行生长，而本试验阴极室(小球藻)废水停留时间仅为1 d。Wang等[34]利用小球藻处理氨氮质量浓度为678.24 mg/L的沼液，小球藻的生物量在0—198 d一直在下降，直到198 d后才完全适应，进入指数生长期。因此，延长阴极室废水停留时间，进一步提高氨氮去除率，是后续DFMC技术优化的研究重点。
此外，本试验整个过程阴极与阳极出水均检测不到NO3−−N，说明厌氧氨氧化污泥与小球藻均没有生成NO3−−N，与预期厌氧氨氧化处理结果[33]相符。而NO2−−N质量浓度变化规律与氨氮质量浓度变化规律正好相反，结果如图3B所示。1—2 d厌氧氨氧化污泥开始适应并转化NO2−−N，在3—9 d厌氧氨氧化污泥将NO2−−N转化为氨氮和N2[34]，转化效率几乎达到100%，第10天后转化效率降低至89.59%，这也可能是受到了污泥膨胀的影响，污泥中丝状菌的膨胀导致厌氧氨氧化菌的活性降低，但丝状菌的生长同样也需要NO2−−N的补给，因此NO2−−N质量浓度的上升幅度不大[33]；在之后的运行中NO2−−N去除率趋于平稳，维持在83.44%~93.85%，平均88.62%。阴极室出水NO2−−N质量浓度的变化规律与阳极室相似，但随着处理时间增加，NO2−−N转化效率逐渐下降，这是因为高氨氮环境抑制了小球藻的活性[35]。其次，与NO2−−N相比，小球藻更倾向于利用氨氮，因为氨氮可直接被小球藻利用生成氨基酸和其他含氮生物分子，而小球藻利用NO2−−N则需要额外的能量消耗[36-37]。所以在氨氮浓度较高且小球藻活性受限的情况下，NO2−−N不会成为小球藻的首选利用对象，从而导致NO2−−N处理效率降低。
2.3 双生物微生物燃料电池可溶性化学需氧量去除性能
SCOD能够反映厌氧氨氧化污泥和小球藻对有机碳的利用程度。如图4所示，由于厌氧氨氧化污泥需要适应高SCOD，因此第1、2天SCOD去除率很低。第3天后出水SCOD明显下降，说明厌氧氨氧化污泥逐渐适应新环境。5—26 d厌氧氨氧化污泥对SCOD的去除率在45.39%~77.30%波动，平均63.72%，比Zhang等[33]报道的40.8%的SCOD去除率高22.92个百分点。其中，第9天污泥膨胀现象发生，阳极室出水的SCOD略有增高，但并未明显影响整个运行过程SCOD的去除率。
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图 4 出水中可溶性化学需氧量的变化Figure 4. Changes of soluble chemical oxygen demand in discharged wastewater阴极室(小球藻)出水SCOD变化曲线与阳极室(厌氧氨氧化污泥)出水曲线相近，且小球藻出水中SCOD均低于厌氧氨氧化污泥出水中SCOD，说明小球藻利用废水中的有机质进行生长繁殖。阴极室(小球藻)对SCOD的去除率在2.73%~18.20%波动，平均去除率为9.98%；当以阳极室出水SCOD为基础时，小球藻对SCOD的平均去除率可达27.74%，说明小球藻在较短停留时间对阳极室出水SCOD仍有较明显的降解效果。阴极室对SCOD的去除也说明小球藻可以适应经厌氧氨氧化污泥处理后的废水环境，意味着小球藻具有在这种环境下处理污染物的潜力，但换水频率过高会影响小球藻的生长，导致污染物降解效率下降。本研究结果表明小球藻需要更久的废水停留时间，以提高污染物的处理效率，后续可通过调整阴极室的体积，或者在阳极室和阴极室之间添加沉淀池来提高小球藻对废水的处理效果。
2.4 双生物微生物燃料电池除磷性能
磷是生物体生长的必需成分，是细胞膜和遗传物质的重要组成成分[38]，总磷浓度反映MFC中微生物的生长情况，浓度越低说明微生物越活跃。由图5可知，阳极室污泥出水中的总磷经历了1~4 d的适应期，第2天总磷质量浓度降至最低，为13.26 mg/L，并在第5、6天达到最高去除率，分别为74.99%与73.66%，与Huang等[39]的研究结果相近，这表明厌氧氨氧化污泥逐渐适应养殖废水，并且吸磷效果显著。但随后从第7天开始总磷去除率有所下降，这与第9天观察到明显的污泥膨胀现象有关，污泥膨胀对去除氨氮和SCOD的影响并不明显(图3A、4)，但对去除总磷的影响明显，在膨胀初期就导致总磷去除率下降了19.17个百分点。之后总磷去除率稳定在50.01%~57.19%，平均去除率达54.45%，高于Zha等[40]报道的35.46%。结合DMFC的产电数据(图2)，说明本试验构建的生物电池能够利用自身生物调节，克服污泥膨胀影响，成功产电并脱氮、除磷、降解有机物。此外，阴极室出水的总磷质量浓度曲线与阳极出水相似，且阴极出水总磷质量浓度与阳极出水相比基本没有降低，主要原因不仅在于养殖废水在阳极室排出时总磷质量浓度已超过小球藻生长所需的水平，还可能与小球藻的驯化时间有关。谭顺[41]研究发现，经过29 d驯化的小球藻对总磷的去除率可以接近100%，并且其去除速率也显著高于未经驯化的小球藻。由于高氨氮浓度的废水会抑制小球藻的生长[42]，小球藻需要足够的时间来完成环境适应过程。因此在未来研究中对小球藻进一步驯化培养，有望提高小球藻对SCOD、氨氮和总磷的去除效果，从而进一步提高DMFC的产电和污染物去除性能。
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图 5 出水中总磷质量浓度的变化Figure 5. Mass concentration changes of total phosphorus in discharged wastewater2.5 双生物微生物燃料电池pH变化
由于阳极室的废水在排出后立即进入阴极室，因此本试验分别测定了进水和最终出水(阴极室)的pH。由图6可见，1—8 d为污泥适应期，其中，1—4 d pH迅速上升，达到8.1，随后4—8 d pH变化稳定，保持在7.5~8.0。但在第9天时pH再次升高，超过了厌氧氨氧化污泥的pH最适生存值(7.5)[43]。这是因为第9天发生污泥膨胀，系统中的微生物群落不稳定而导致pH升高。另外，有研究表明，pH的变化是污泥发生膨胀现象的原因之一，pH低于6.5时会导致酸耐受能力低的微生物死亡，环境适应力较强的丝状菌会存活下来[44]，但在本研究中，污泥膨胀期间系统pH未低于6.5，因此pH不是导致阳极污泥膨胀的原因之一。本研究构建的DMFC利用自身调节功能，缓解了污泥膨胀，之后系统pH也无明显变化，稳定在9.5左右，同时系统产电−124~45 mV，SCOD、氨氮和总磷去除率分别为63.72%、62.07%和54.45%，标志着系统进入稳定运行阶段，也说明在DMFC系统中，厌氧氨氧化污泥能在较高pH(9.5)下稳定工作。
3. 结论
本试验构建了一个厌氧氨氧化污泥耦合小球藻的DMFC系统，DMFC能产生正负电压，其中最高正电压463 mV、最低负电压−353 mV，能通过自身生物调节克服污泥膨胀的不利影响，持续产电。DMFC系统稳定运行期间，氨氮去除率62.07%，NO2−−N去除率88.62%，总磷去除率54.45%，SCOD去除率63.72%，在pH为9.5的条件下能稳定运行。本试验证明利用厌氧氨氧化污泥耦合小球藻制备DMFC处理养殖废水是可行的，不仅能有效脱氮、除磷、降低有机物浓度，还能持续产电，是协同解决环境与能源问题的有效途径。系统的后续优化需要根据具体的废水特性、微生物菌群的适应性以及操作条件的调整等因素综合考虑。如何缓解并遏制污泥膨胀现象的发生以及提高微生物活性是增强系统当前处理效率的关键因素。污泥膨胀现象的缓解可以使DMFC更快进入稳定阶段，进而提高系统对污染物处理量；更活跃的微生物可以提高系统对污染物的处理效率，进一步提高电池的产电与降解性能；未来通过优化工艺条件(如阴极室延长废水停留时间、阳极室交替曝气避免有机酸累积等)，有望进一步提高DMFC的产电和处理污染物性能。
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图 1 鸡BMP6基因不同外显子PCR产物电泳结果
Figure 1. Electrophoresis result of PCR products for different exons of chicken BMP6 gene
A: Exon 2; B: Exon 3 (1~7), exon 4 (8~14), exon 5 (15~21); C: Exon 6; D: Exon 7-1; E: Exon 7-2
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图 2 粤西卷羽鸡SNP位点测序检测结果
Figure 2. Detection results of SNP sites in Yuexi Frizzled Feather chicken by sequencing
表 1 BMP6基因的引物序列
Table 1 Primer sequences of BMP6 gene
引物名称
Primer name正向序列(5′→3′)
Forward sequence反向序列(5′→3′)
Reverse sequence产物长度/bp
Product
length退火温度/℃
Annealing
temperatureBMP6-Exon2 TCTTGAGGGAACAGGTGGCAG GCATCATCCCTCCCTAGG 314 60 BMP6-Exon3 GCATGTGTACGGTGTGGAAGA TGTCACCTTGTGCTCACCTAG 560 59 BMP6-Exon4 GAGCCTCTTGTCTCGGATGGA TTGCGCTGTTCTACCAGCT 769 60 BMP6-Exon5 TTCTAAGCCAGTCACTGTTACGC CATGAGTGACAGAGGATGGCT 502 60 BMP6-Exon6 GACACGAACATCAGTGTCCATGG CTCACTCACAAACTCACCTATGG 358 60 BMP6-Exon7-1 CAGCAAGACCTGTGCTAAAGC GCCAAGCCATCTTACACTTGC 880 60 BMP6-Exon7-2 CCTGTCATGATAGTACGCATCTT CAGTGGAAGCTAAGTGTTGTACT 825 58 
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表 2 粤西卷羽鸡BMP6基因突变位点信息
Table 2 Information of BMP6 gene mutation sites of Yuexi Frizzled Feather chicken
外显子
Exon碱基突变
Base mutation染色体位点1)
Chromosome positionmRNA位点
mRNA site编码氨基酸2)
Encoded amino acid突变类型
Mutation type3 T→C g.64185950 T1135C His 同义突变 Synonymous mutation 6 G→A g.64195411 G1441A Tyr 同义突变 Synonymous mutation 7 C→T g.64195613 C1549T Tyr 同义突变 Synonymous mutation G→A g.64195821 G1757A — T→A g.64195833 T1769A — T→C g.64196373 T2309C — T→C g.64196735 T2671C — 1)以NCBI数据库中鸡BMP6基因序列(GenBank：NC_052533.1) 外显子 1的第1个碱基为起始位点；2)“—”表示无氨基酸编码
1) Starting from the first base of exon 1 in the chicken BMP6 gene sequence (GenBank: NC: 052533.1) in the NCBI database; 2) “—” indicates no amino acid coding
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表 3 BMP6基因SNP位点遗传特性分析结果1)
Table 3 Genetic characteristics analysis results of SNP sites in BMP6 gene
SNP位点
SNP site基因型
Genotype频率
Frequencyn 等位
基因
Allele等位基
因频率
Allele
frequency杂合度
(He)
Heterozygosity有效等位
基因数(Ne)
Effective
allele
number多态信息
含量(PIC)
Polymorphism
information
contentχ2 g.64185950 T>C CC 0.333 40 C 0.604 0.478 1.917 0.364 2.106 CT 0.542 65 T 0.396 TT 0.125 15 g.64195411 G>A AA 0.383 46 A 0.633 0.465 1.868 0.357 0.703 AG 0.500 60 G 0.367 GG 0.117 14 g.64195613 C>T CC 0.325 39 C 0.583 0.486 1.946 0.368 0.474 CT 0.517 62 T 0.417 TT 0.158 19 g.64195821 G>A AA 0.017 2 A 0.171 0.284 1.396 0.243 0.936 AG 0.308 37 G 0.829 GG 0.675 81 g.64195833 T>A AA 0.033 4 A 0.517 0.499 1.998 0.375 105.025* AT 0.967 116 T 0.483 TT 0 0 g.64196373 T>C CC 0.525 63 C 0.742 0.383 1.620 0.310 2.058 CT 0.433 52 T 0.258 TT 0.042 5 g.64196735 T>C CC 0.383 46 C 0.621 0.471 1.889 0.360 0.010 CT 0.475 57 T 0.379 TT 0.142 17 1) PIC≥0.5为高度多态，0.25≤PIC<0.5为中度多态，PIC<0.25为低度多态；以χ2检验Hardy-Weinberg平衡，df=2，χ$_{0.05}^{2} $=5.99，χ$_{0.01}^{2} $=9.21；“*”表示P<0.05，偏离Hardy-Weinberg平衡
1) PIC≥0.5 is highly polymorphic, 0.25≤PIC<0.5 is moderately polymorphic, PIC<0.25 is lowly polymorphic; Hardy-Weinberg equilibrium is tested by χ2, df=2, χ$_{0.05}^{2} $=5.99, χ$_{0.01}^{2} $=9.21; “*” indicates P<0.05 and deviation from Hardy-Weinberg equilibrium
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表 4 粤西卷羽公鸡BMP6基因SNP位点各基因型的生长性状1)
Table 4 Growth traits of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather cock
SNP位点
SNP site基因型
Genotypen 体质量/g
Body weight胫长/cm
Tibia length龙骨长/cm
Keel length胫围/cm
Tibia girthg.64185950 T>C CC 17 1740.16±35.00a 9.06±0.08a 10.14±0.10a 5.02±0.05a CT 33 1716.82±30.55a 8.93±0.09a 10.16±0.10a 5.02±0.04a TT 10 1706.39±71.64a 8.71±0.10a 10.09±0.14a 4.92±0.13a g.64195411 G>A AA 20 1699.59±37.49a 8.78±0.08a 10.16±0.10a 5.01±0.06a AG 33 1715.61±31.84a 8.99±0.09a 10.16±0.09a 4.98±0.04a GG 7 1813.54±52.25a 9.06±0.14a 10.00±0.22a 5.09±0.08a g.64195613 C>T CC 16 1786.34±30.94a 9.06±0.10a 10.09±0.12a 5.09±0.05a CT 35 1709.30±30.93a 8.94±0.08ab 10.15±0.09a 4.96±0.04a TT 9 1654.97±65.51a 8.65±0.10b 10.22±0.17a 5.02±0.12a g.64195821 G>A AG 18 1765.67±33.84a 8.96±0.11a 10.27±0.12a 4.99±0.05a GG 42 1702.85±28.41a 8.92±0.07a 10.09±0.08a 5.01±0.04a g.64195833 T>A AT 57 1718.29±23.52a 8.92±0.06a 10.13±0.07a 5.00±0.03a g.64196373 T>C CC 34 1720.02±30.76a 8.88±0.08a 10.26±0.08a 4.97±0.05a CT 23 1716.21±37.06a 9.00±0.10a 9.96±0.11a 5.04±0.04a g.64196735 T>C CC 21 1774.43±27.32a 9.07±0.08a 10.06±0.10a 5.05±0.05a CT 28 1687.00±39.45a 8.87±0.11a 10.10±0.10a 4.96±0.05a TT 11 1709.33±43.23a 8.82±0.06a 10.40±0.13a 5.01±0.08a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)
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表 5 粤西卷羽母鸡BMP6基因SNP位点各基因型的生长性状1)
Table 5 Growth traits of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather hen
SNP位点
SNP site基因型
Genotypen 体质量/g
Body weight胫长/cm
Tibia length龙骨长/cm
Keel length胫围/cm
Tibia girthg.64185950 T>C CC 23 1425.72±27.56a 7.99±0.07a 9.47±0.08a 4.60±0.04a CT 32 1467.16±24.99a 8.10±0.07a 9.44±0.08a 4.60±0.03a TT 5 1378.20±103.47a 8.19±0.33a 9.33±0.24a 4.59±0.13a g.64195411 G>A AA 26 1437.28±29.46a 8.13±0.10a 9.55±0.10a 4.58±0.03a AG 27 1443.81±29.07a 8.04±0.06a 9.31±0.08b 4.60±0.04a GG 7 1468.47±49.26a 7.94±0.07a 9.51±0.09ab 4.63±0.05a g.64195613 C>T CC 23 1440.44±30.21a 8.10±0.06a 9.37±0.08a 4.63±0..04a CT 27 1446.68±25.40a 8.08±0.09a 9.43±0.09a 4.56±0.04a TT 10 1444.10±62.31a 7.96±0.15a 9.64±0.15a 4.61±0.07a g.64195821 G>A AG 19 1418.37±28.84a 8.26±0.10a 9.46±0.11a 4.57±0.03a GG 39 1453.69±25.32a 7.96±0.06a 9.43±0.07a 4.61±0.03a g.64195833 T>A AT 59 1444.87±19.20a 8.06±0.05a 9.44±0.06a 4.59±0.03a g.64196373 T>C CC 29 1456.64±26.20a 8.17±0.09a 9.59±0.08a 4.62±0.04a CT 29 1425.49±28.87a 7.97±0.05b 9.29±0.07a 4.57±0.04a g.64196735 T>C CC 24 1427.00±29.48a 8.03±0.07ab 9.40±0.08a 4.61±0.04a CT 29 1491.68±19.47a 8.17±0.08a 9.50±0.09a 4.61±0.04a TT 7 1303.53±79.57a 7.74±0.06b 9.35±0.20a 4.47±0.09a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)
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表 6 粤西卷羽公鸡BMP6基因SNP位点各基因型的屠宰性能1)
Table 6 Slaughter performance of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather cock
SNP位点
SNP site基因型
Genotypen 活质量/g
Live
weight屠宰率/%
Dressing
percentage半净膛率/%
Half-bore
weight rate全净膛率/%
Full-bore
weight rate腹脂率/%
Abdominal fat
weight rate胸肌率/%
Breast muscle
weight rate腿肌率/%
Leg muscle
weight rateg.64185950 T>C CC 5 1 658.54a 0.90a 0.82a 0.71a 0.013a 0.11a 0.18a CT 22 1 637.76a 0.89a 0.81a 0.70a 0.012a 0.11a 0.20a g.64195411 G>A AA 13 1 635.90a 0.91a 0.83a 0.71a 0.015a 0.11a 0.19a AG 13 1 621.65a 0.89a 0.81a 0.70a 0.013a 0.11a 0.20a g.64195613 C>T CC 9 1 711.99a 0.89a 0.81a 0.71a 0.010a 0.11a 0.19a CT 17 1 610.45a 0.89a 0.82a 0.70a 0.012a 0.11a 0.20a g.64195821 G>A AG 13 1 643.43a 0.89a 0.82a 0.71a 0.015a 0.11a 0.19a GG 17 1 648.28a 0.90a 0.82a 0.70a 0.010a 0.11a 0.20a g.64195833 T>A AT 29 1 645.82a 0.89a 0.82a 0.70a 0.012a 0.11a 0.20a g.64196373 T>C CC 19 1 625.11a 0.90a 0.82a 0.71a 0.015a 0.11a 0.20a CT 11 1 682.57a 0.89a 0.81a 0.70a 0.007a 0.11a 0.19a g.64196735 T>C CC 11 1 718.33a 0.89a 0.81a 0.71a 0.010a 0.11a 0.18a CT 14 1 601.74b 0.90a 0.82a 0.70a 0.013a 0.11a 0.20a TT 5 1 611.86ab 0.89a 0.82a 0.70a 0.014a 0.11a 0.20a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)
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表 7 粤西卷羽母鸡BMP6基因SNP位点各基因型的屠宰性能1)
Table 7 Slaughter performance of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather hen
SNP位点
SNP site基因型
Genotypen 活质量/g
Live
weight屠宰率/%
Dressing
percentage半净膛率/%
Half-bore
weight rate全净膛率/%
Full-bore
weight rate腹脂率/%
Abdominal fat
weight rate胸肌率/%
Breast muscle
weight rate腿肌率/%
Leg muscle
weight rateg.64185950 T>C CC 10 1 318.85a 0.87a 0.78a 0.68a 0.030a 0.12a 0.19a CT 18 1 380.92a 0.87a 0.80a 0.71a 0.027a 0.14a 0.23a g.64195411 G>A AA 13 1 345.03a 0.88a 0.80a 0.71a 0.024a 0.13a 0.25a AG 12 1 349.35a 0.87a 0.78a 0.69a 0.029a 0.12a 0.18a GG 5 1 417.44a 0.88a 0.81a 0.71a 0.029a 0.15a 0.19a g.64195613 C>T CC 11 1 368.40a 0.87a 0.79a 0.70a 0.034a 0.13a 0.18a CT 14 1 353.41a 0.88a 0.80a 0.70a 0.022b 0.13a 0.25a TT 5 1 352.92a 0.88a 0.80a 0.69a 0.024ab 0.13a 0.19a g.64195821 G>A AG 8 1 342.86a 0.86a 0.79a 0.70a 0.025a 0.12a 0.18a GG 21 1 359.04a 0.88a 0.80a 0.69a 0.029a 0.14a 0.23a g.64195833 T>A AT 30 1 358.83a 0.87a 0.79a 0.70a 0.027a 0.13a 0.21a g.64196373 T>C CC 13 1 369.73a 0.87a 0.80a 0.69a 0.027a 0.12a 0.18a CT 15 1 340.58a 0.87a 0.78b 0.70a 0.025a 0.14a 0.24a g.64196735 T>C CC 11 1 345.33a 0.87a 0.79a 0.70a 0.032a 0.13a 0.18a CT 15 1 366.59a 0.88a 0.80a 0.70a 0.021a 0.13a 0.25a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)
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