Responses of cellulase reaction systems of Pomacea canaliculata and Cipangopaludina chinensis to different pH and temperature
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摘要:目的
探讨福寿螺Pomacea canaliculata Lamarck和本地中国圆田螺Cipangopaludina chinensis Gray纤维素酶活性反应体系对不同pH和温度响应的差异.
方法采用酶学分析法（羧甲基纤维素法）测定不同反应温度和pH对福寿螺和田螺肝脏与胃纤维素酶活性的影响.
结果和结论福寿螺肝脏和胃纤维素酶的活性在不同pH和温度条件下均显著高于田螺, 其中, 不同pH（3.6~7.2）条件下福寿螺肝脏和胃纤维素酶活性分别是田螺的1.51~3.14和1.30~1.90倍; 不同温度（30~60℃）条件下福寿螺肝脏和胃纤维素酶活性分别是田螺的1.16~1.56和1.32~1.77倍.在pH3.6~7.2、温度30~60℃的范围内, 福寿螺和田螺肝脏、胃纤维素酶活性都呈先上升后降低的变化趋势, 不同温度条件下福寿螺纤维素酶活性的变化幅度大于田螺, 但2种螺纤维素酶活性随pH的变化差异不显著.福寿螺肝脏和胃纤维素酶适宜的pH范围分别为5.4~6.6和4.8~6.6, 适宜的温度范围均为40~55℃; 田螺肝脏和胃纤维素酶适宜的pH范围分别为5.4~6.0和4.8~6.6, 适宜的温度范围均为40~50℃.福寿螺对外界环境的适应性更强.
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of pH and temperature on cellulose enzyme activities of Pomacea canaliculata Lamarck and Cipangopaludina chinensis Gray.
MethodThe enzymatic analysis method(Carboxymethyl cellulose method) was used to research the influences of different reaction temperatures and pH values on cellulose enzyme activities in liver and stomach of P. canaliculata and C.chinensis.
Result and conclusionThe cellulose enzyme activities in liver and stomach of P. canaliculata were significantly higher than those of C. chinensis under different pH and temperature. The cellulose enzyme activities in liver and stomach of P. canaliculata at different pH values(3.6-7.2) were 1.51-3.14 and 1.30-1.90 times higher than those of C. chinensis, respectively. At different temperatures(30-60℃), the cellulose enzyme activities were 1.16-1.56 and 1.32-1.77 times higher than those of C. chinensis, respectively. At the settled pH(3.6-7.2) and temperature(30-60℃) conditions, the curves of cellulase activities were all rising followed by reducing. At different temperatures, the variation ranges of cellulase activities in liver and stomach of P. canaliculatas were wider than those of C. chinensis, while there was no significant differcence between P. canaliculata and C. chinensis at different pH values. The optimum pH range for cellulose enzyme activities in liver and stomach of P. canaliculata were 5.4-6.6 and 4.8-6.6, respectively; the optimum temperature range was from 40℃ to 55℃. Meanwhile, The optimum pH ranges for cellulose enzyme activities in liver and stomach of C. chinensis were 5.4-6.0 and 4.8-6.6, respectively; the optimum temperature ranged from 40℃ to 50℃. P. canaliculata has a better digestive ability and is more adaptive to the environment which may attribute to the easier invasion mechanism of P. canaliculata.
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Keywords:
- Pomacea canaliculata /
- Cipangopaludina chinensis /
- cellulase /
- reaction system /
- pH /
- temperature /
- stomach /
- liver
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福寿螺Pomacea canaliculata，又名大瓶螺、苹果螺、金宝螺，两栖淡水贝类，隶属软体动物门腹足纲前鳃亚纲中腹足目瓶螺科瓶螺属，原产于南美洲亚马逊河流域[1]. 1981年被引入我国大陆饲养，因人们对该螺的生物学特性、营养价值、市场前景以及危害性认识不足，盲目引进，加上管理不严和不当，最终导致福寿螺散逸至野外及农田.由于其繁殖率高、适应性广、扩散较快，迅速蔓延于河、沟、渠及其他水域附近，加之其食量大、食性杂，可危害水稻[2]、蔬菜、莲藕[3]等多种作物和水生植物，破坏入侵水域的鱼类和贝类资源[4]，给农业生产带来极大危害，对农业生态系统[5]、生物多样性造成严重破坏.此外，福寿螺还是引起人类嗜酸性脑膜炎的广州管园线虫Angiostrongylus cantonensis的中间寄主[6]. 2000年福寿螺被列为世界100种恶性外来入侵物种之一，2003年国家环保局首批公布福寿螺为入侵我国的16种外来物种之一.田螺(又称螺蛳)隶属于软体动物门腹足纲中腹足目田螺科圆田螺属，包括中国圆田螺Cipangopaludina chinensis和中华圆田螺Cipangopaludina cathayensis.其肉嫩味鲜，营养丰富，药食俱佳，但近年来，因其生存环境遭受破坏，其数量越来越少[7].福寿螺作为一种入侵性物种，具有适应能力强、繁殖能力强、食量大、生长迅速[8]等特性.福寿螺食性杂、食量大等生物学特性可能与其本身的消化能力存在一定的关系.目前，有关福寿螺消化酶的研究主要集中在纤溶酶的分离纯化及活性分析[9]、基因的克隆和表达[10]、纤维素酶的开发与应用[11]等方面，国内外关于田螺的研究主要集中于养殖技术[12]、对其体内的寄生虫———管圆线虫的调查[13]，而有关田螺消化酶的研究较少.徐建荣等[14]研究了福寿螺消化道纤维素酶的活性，发现其活性较高.段旭等[15]研究表明，松墨天牛和中国圆田螺体内均有将纤维素降解为单糖的完整纤维素酶系，且松墨天牛体内纤维素酶系中各组分的活性均较中国圆田螺高.马力通等[16]认为提取中华圆田螺纤维素酶工艺的最佳反应条件为缓冲液pH 4.8、浸提时间12 min、离心时间24 min.目前有关福寿螺和田螺纤维素酶的研究较少，其反应体系的比较研究鲜见报道.本文研究福寿螺和田螺肝脏和胃的纤维素酶在不同反应温度和pH条件下的变化规律，以期从消化酶之一的纤维素酶反应体系的差异寻求其消化能力对环境条件适应性的差异，进而为解释福寿螺食性强、入侵能力强提供必要的理论依据.
1. 材料与方法
1.1 材料
2013年9月从广州郊区水沟、稻田和水库中采集2龄或3龄(螺厣上有2圈清晰的同心环纹定为2龄螺，有3圈为3龄螺[17])的福寿螺和田螺样本带回实验室，挑选出大小均匀一致的个体作为试验材料.其中，福寿螺的螺高(31.46±2.47) mm，湿质量(5.10±0.45) g; 田螺的螺高(28.21±1.02) mm，湿质量(4.05±0.29) g.
1.2 样品的准备
试验在华南农业大学农学院实验室进行，将福寿螺和田螺的外壳清洗干净后在室内水盆中饲养，试验前让螺空腹24 h.试验时尽量将螺所携带水分吸干，置于冰浴中，解剖，取出肝脏和胃，剔除多余脂肪及内容物，用滤纸吸干，每处理10只螺，重复3次，共30只螺.称取(0.2±0.005) g的组织，加入9倍质量的去离子水匀浆; 匀浆液离心15 min(10 000 r·min-1、4℃)，取上清液，置于4℃冰箱中保存待用(存放时间不超过24 h).
1.3 酶活性和蛋白质含量的测定
纤维素酶活性的测定采用羧甲基纤维素法(CMC法)，具体操作步骤及计算参见王琳[18]的方法.已有研究表明，软体动物纤维素酶反应适宜的温度为45℃[19]、适宜的pH为5.4[20]，反应时间为8 min[18].本试验设置:温度为45℃，反应时间为8 min，pH为3.6~7.2(每0.6设1个梯度)共7个处理; pH 5.4，反应时间为8 min，温度为30~60℃ (每5℃设1个梯度)共7个处理，用恒温水浴控制温度.酶比活力以一定温度和pH下，1 min内从1 mg组织蛋白中水解产生葡萄糖的量(μmol)表示.
采用考马斯亮蓝G- 250法测定蛋白质含量.
1.4 数据分析
数据均以平均数±标准差表示.采用SPSS17.0软件进行统计分析，独立样本t检验分析差异显著性.
2. 结果与分析
2.1 福寿螺和田螺消化系统的纤维素酶活性对pH的响应
由图 1a可见，在相同的温度(45℃)处理下，福寿螺和田螺肝脏的纤维素酶活性随pH的升高(pH3.6~7.2)呈现先升后降的规律. pH3.6~7.2时，福寿螺肝脏的纤维素酶活性显著高于田螺(P<0.05)，是田螺的1.51~3.14倍.福寿螺肝脏的纤维素酶活性在pH 4.8~6.6范围出现较高值，pH 5.4时纤维素酶活性达到最高; 田螺肝脏的纤维素酶活性随pH的变化较平稳，波动幅度小，pH适宜范围在5.4~6.0，pH 5.4时达到最高.
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图 1 福寿螺和田螺的纤维素酶活性对pH变化的响应*、**分别表示相同pH，福寿螺和田螺之间差异达0.05、0.01的显著水平(t检验).Figure 1. The responses of cellulase activities of golden apple snail and local field snail to pH change从图 1b可以看出，在相同温度(45℃)处理下，福寿螺和田螺胃的纤维素酶活性随pH的升高呈现先升后降的规律.在pH 3.6~7.2时，福寿螺胃纤维素酶活性显著高于田螺(P<0.01)，是田螺的1.30~1.90倍.福寿螺胃的纤维素酶活性在pH 4.8~6.6范围内活性较高，pH 6.0时纤维素酶活性达到最高; 田螺胃的纤维素酶活性变化幅度不大，pH适宜范围在4.8~6.6，在pH 5.4时出现最高值.
2.2 福寿螺和田螺消化系统的纤维素酶活性对温度的响应
从图 2a可以看出，在pH 5.4时处理下，福寿螺和田螺肝脏的纤维素酶活性随温度(30~60℃)的升高均呈现先升后降的规律，且福寿螺肝脏纤维素酶活性极显著高于田螺(P<0.01)，酶活性平均值为田螺的1.16~1.56倍.福寿螺肝脏的纤维素酶活性在40~55℃范围内活性较高，45℃时纤维素酶活性达到最高; 田螺肝脏的纤维素酶活性变化幅度不大，其适宜温度范围为40~50℃，45℃时出现最高值.
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图 2 福寿螺和田螺的纤维素酶活性对温度变化的响应*、**分别表示相同温度下，福寿螺和田螺之间差异达0.05、0.01的显著水平(t检验).Figure 2. The responses of cellulase activities of golden apple snail and local field snail to temperature change从图 2b可以看出，在pH 5.4时，福寿螺和田螺胃的纤维素酶活性随温度(30~60℃)的升高呈现先升后降的规律，且福寿螺胃纤维素酶活性极显著高于田螺(P<0.01)，酶活性平均值是田螺的1.32~1.77倍.福寿螺胃纤维素酶活性在40~55℃范围内活性较高，45℃时纤维素酶活性达到最高; 田螺胃的纤维素酶活性变化幅度不大，适宜范围为40~50℃，在40℃时出现最高值.
3. 讨论与结论
消化酶活性反映了动物摄食、营养条件、生理状况的优劣，其活性的高低直接影响了动物对营养物质的消化和利用程度，甚至影响动物生长发育的速度[19].纤维素酶不仅能促进纤维素和半纤维素分解，还能破坏植物细胞的细胞壁，促使细胞内容物溶解，且在其他消化酶的配合下，缩短蛋白质、淀粉等大分子物质分解为易消化吸收的小分子物质的时间，增加其对食物的消化吸收.本研究结果表明，不同温度下，福寿螺肝脏的纤维素酶活性是田螺肝脏纤维素酶活性的1.16~1.56倍，福寿螺胃的纤维素酶活性是田螺胃的纤维素酶活性的1.32~1.77倍; 不同pH下，福寿螺肝脏的纤维素酶活性是田螺肝脏的纤维素酶活性的1.51~3.14倍，福寿螺胃的纤维素酶活性是田螺胃的纤维素酶性的1.30~1.90倍. Mcallister等[21]研究表明在动物饲料中添加纤维素酶，能促进饲料的营养价值、提高饲料的消化利用率、增加动物的日增质量、加快动物的生长.福寿螺肝脏和胃的纤维素酶活性都显著高于田螺，这有利于消化和利用食物，使其生长发育比田螺快.
在一定的温度范围内，酶活性随温度的升高而加快，但超过一定范围后，酶活性反而随温度的升高而降低甚至变性失活.本研究结果表明，在30~60℃，福寿螺和田螺肝脏和胃的纤维素酶活性均随着温度的升高呈现先上升而后下降的规律.福寿螺肝脏和胃的纤维素酶活性适宜范围为40~55℃，而田螺肝脏和胃的纤维素酶活性适宜范围为40~50℃.一定的pH范围内酶催化活性最强，pH高于或低于最适值，酶活性都会下降.本研究结果表明，在pH 3.6~7.2时，福寿螺和田螺肝脏和胃的纤维素酶活性均随着pH的升高呈现先上升而后下降的规律.福寿螺肝脏和胃的纤维素酶活性pH适宜范围都为4.8~6.6，田螺肝脏和胃的纤维素酶活性变化不大，适宜酸碱度皆为pH4.8~6.0，这与缢蛏纤维素酶活性的最适pH为5.2[20]、橄榄蚶纤维素酶活性的最适pH为6.0[22]研究相似.可见，福寿螺纤维素酶的最适温度和pH范围较田螺宽，这也可能是它适应环境的温度和pH范围较宽的原因.在相同的气候条件下，福寿螺由于消化酶活力强、适宜的温度和pH范围宽等原因，比田螺有生存优势[16].这样福寿螺入侵后与田螺竞争同一生态位时存在明显优势，能够迅速入侵成功.
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图 1 福寿螺和田螺的纤维素酶活性对pH变化的响应
*、**分别表示相同pH，福寿螺和田螺之间差异达0.05、0.01的显著水平(t检验).
Figure 1. The responses of cellulase activities of golden apple snail and local field snail to pH change
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