Effect of intercropping Alpinia katsumadai on soil fungal community within a teak (Tectona grandis) plantation
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摘要:目的
柚木Tectona grandis 是热带珍贵树种之一，生长周期长，与药用植物套种是一种额外获得短期收益、达到“以短养长”的方法。因土壤微生物群落在土壤健康和质量方面有着重要作用，本文旨在探明柚木套种药用植物对土壤微生物群落的结构和功能影响，为柚木人工林科学经营和绿色发展提供理论参考。
方法以柚木林下套种草豆蔻Alpinia katsumadai 为研究对象，未套种草豆蔻的柚木为对照，通过采集两者根际土壤，利用高通量测序技术分析其真菌群落特征，从多样性指数、群落结构和组成、共现性网络来分析林药套种下土壤真菌群落的变化及差异。
结果柚木套种草豆蔻处理相比未套种的土壤真菌群落多样性无显著变化，多样性指数(Chao1、Shannon、Observed_species 和PD_whole_tree)差异不显著；但群落结构有显著不同，非度量多维尺度(NMDS)分析和主成分(PCA)分析显示柚木套种草豆蔻与未套种处理群落组成分离明显，线性判别分析(LEfSe) 显示两者富集最多的类群不同；套种处理土壤真菌网络结构更加集中和复杂(网络节点数和正向边比例上升，模块化指数增加)，子囊菌门和担子菌门分别为套种和未套种土壤真菌群落的中心响应类群。
结论柚木林下套种草豆蔻对土壤真菌群落结构有显著影响，套种草豆蔻提升了柚木根际真菌群落的网络复杂性和集中程度，形成了更紧密的土壤微生物环境，研究结果可从微生物角度为柚木人工林套种及提升生产力提供理论指导。
Abstract:ObjectiveTeak (Tectona grandis) is one of the precious tree species in the tropics, it has a long growth cycle. Intercropping with medicinal plants is an effective way to achieve additional short-term benefits and to achieve the goal of “raising the short with the long”. Since soil microbial community plays an important role in soil health and quality, the purpose of this study is to investigate the effects of intercropping teak with medicinal plants on the structure and function of soil microbial community, and provide theoretical references for the scientific management and green development of teak plantations.
MethodThis study investigated the effects of intercropping Alpinia katsumadai with teak in a forest plantation. A non-intercropped teak forest was used as a control. Soil samples were collected from the rhizospheres of both treatments and analyzed for fungal community characteristics using the high-throughput sequencing technology. The changes and differences in soil fungal communities under intercropping were analyzed based on diversity indices, community structure and composition, and co-occurrence networks.
ResultThe diversity of soil fungal communities in teak intercropped with A. katsumadai did not change significantly compared to non-intercropped forests. The diversity indices (Chao1, Shannon, Observed_species, and PD_whole_tree) did not differ significantly. However, the community structure was significantly different. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) and principal component analysis (PCA) showed that the community composition of teak intercropped with A. katsumadai was clearly separated from that of non-intercropped forests. Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis showed that the most enriched taxa in the two treatments were also different. Soil fungal network structure in the intercropped treatment was more concentrated and complex (the number of network nodes, the proportion of positive edges and the modularity index increased). Ascomycota and Basidiomycota were the central response taxa for soil fungal communities in intercropped and non-intercropped forests, respectively.
ConclusionIntercropping with A. katsumadai significantly influences the soil fungal community structure in teak plantations. Intercropping A. katsumadai enhances the network complexity and centrality of the rhizosphere fungal community in teak, forming a more compact soil microbial environment. The research results can provide a theoretical guidance for teak plantation interplanting and improving productivity from the perspective of microorganisms.
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Keywords:
- Intercropping of forest medicine /
- Fungus /
- Community structure /
- Teak /
- Co-occurrence network
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染色体作为生物遗传物质的载体，对当前生命遗传研究开展尤为重要。染色体消除技术(Chromosome elimination technology)近年来随着基因编辑技术的发展不断进步，在动物模型构建、家畜育种改良中的性别控制、特定染色体的功能研究以及人类非整倍体疾病治疗等领域具有重要的应用价值。目前通过该技术已成功在人、小鼠、斑马鱼等物种上实现了特定染色体的消除[1-3]，然而打靶效率低、非靶点的额外失活及操作过程的繁琐性大大制约了该技术的发展[3-5]。但随着新一代CRISPR/Cas9技术的出现，灵活的靶点选择、较高的编辑效率以及对于靶点多重切割的可能性使该技术的有效运用成为可能。
目前，研究者们已通过锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)技术、Cre/loxP系统、TKNEO基因敲入等多种方法实现了目标染色体的敲除[5-7]。ZFN技术通过人工改造的核酸内切酶(锌指蛋白单元)与特定的DNA序列结合赋予其精确的打靶功能[8]，但其脱靶效应、毒性及锌指结构的低适用性造成其基因操作效率低下[9]；Cre/loxP系统主要由Cre重组酶与2个loxP位点组成，由于loxP的位点不同会产生DNA链的插入、删除、易位等不同重组方式[10]，但该系统的使用需要引入特定表达元件且本身会对细胞产生毒性[4, 11]；TKNEO是胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)和新霉素抗性(Neomycin resistance，NEO)的融合编码基因，利用传统基因打靶技术敲入目标染色体进行药筛可产生自发性染色体缺失[3]，但其操作的繁琐性和不确定性使其并不具有广泛的适用性。
CRISPR/Cas9技术近年来已经成为了基因编辑的主要手段，其由大肠埃希菌Ⅱ型CRISPR/Cas系统改造而来，由于其引导RNA(Small guide RNA，sgRNA)序列的灵活性而能对多个位点进行灵活编辑，从而实现基因的定点敲入、敲除或其他多种修饰[12-16]。该系统主要由2个部分组成，Cas9蛋白和sgRNA，其中后者负责识别目标靶序列，前者依靠其自身含有的2个切割域完成对目标序列的切割，之后依靠细胞本身的2种修复机制(同源重组修复和非同源末端连接)实现目标序列的精确编辑[17-21]。最新研究表明，CRISPR/Cas9系统可通过产生多重DNA双链断裂(Double-strand breakage，DSB)引起Y染色体降解[22-23]，对这种方法，虽然部分细胞会因自身修复机制保持基因组的稳定性，但是仍有相当的几率可产生特定染色体消除的细胞，通过筛选出此种染色体消除的细胞系作为供体应用于动物克隆，可制备出特定染色体消除的动物，因此达到控制动物本身及其后代的性别进行偏移的目的。
本研究拟通过CRISPR/Cas9技术，在猪Y染色体内寻找能够被特异sgRNA识别的重复序列，进行多位点切割以实现目标染色体的降解。本研究旨在为特定染色体及其携带基因功能的研究提供一种新的工具，同时也为实现大型家畜性别控制提供一种新的技术方案。
1. 材料与方法
1.1 材料
本试验所用的CRISPR/Cas9载体HP180_px330_GFP及猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblast，PEF)由国家生猪种业工程技术研究中心保存。设计的sgRNA及相关引物由华大基因合成。质粒与基因组DNA抽提试剂盒、限制性内切酶BpiI、gRNA体外转录试剂盒GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit、荧光定量试剂盒PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix购自赛默飞公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；Cas9内切酶购自NEB公司；感受态细胞Trans5α、6×DNA Loading buffer、RNA loading buffer购自全式金生物。高糖DMEM 培养液、胰酶、胎牛血清均购自Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 寻找Y染色体特异靶向重复序列及sgRNA设计
在Ensembl获取整个Y染色体注释文件，在Linux下用awk命令提取注释文件中的所有基因，并在Ensembl上将每个基因与全基因组序列进行逐一比对，最终筛选出符合条件的多拷贝基因。
利用在线网站CCTop - CRISPR/Cas9 target online predictor( https://cctop.cos.uni-heidelberg.de/)对所选择靶基因进行sgRNA设计，确定最终序列与位点，并送至华大基因合成。
1.2.2 sgRNA体外切割验证
对设计好的sgRNA体外转录进行切割，初步筛选出效率较高的进行载体构建。首先进行靶片段的PCR扩增。根据本试验靶基因的选择，使用Primer Premier 6进行相应靶点引物设计，合成目标靶片段。然后根据赛默飞公司的GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit说明书设计sgRNA体外转录模板引物，并最终进行Gene_ID为ENSSSCG00000043058、ENSSSCG00000046447的转录模板合成(以下简称为43058、46447)。其合成原理(图1)及相关引物(表1、表2)如下所示。
![图 1 sgRNA合成原理图]()
图 1 sgRNA合成原理图体外合成的gRNA由2条34~38 bp寡核苷酸与tracrRNA片段退火形成，其中Target-F由T7启动子和靶序列的16~20 bp组成，Target-R由tracrRNA片段的部分序列和与目标序列互补的19~20 bp组成Figure 1. Schematic diagram of sgRNA synthesisTwo 34−38 bp oligonucleotides are needed to assemble the synthetic gRNA with tracrRNA fragment, among them the Target-F is composed of the T7 promoter and 16−20 bp sequence of the target sequence, and the Target-R is composed of partial sequence of tracrRNA fragment and 19−20 bp sequence complementary to the target sequence表 1 靶片段扩增引物Table 1. Primers of target fragment amplification引物名称 Primer name 引物序列(5′→3′) Primer sequence 产物长度/bp Product length 43058target_F GTCCCATTTTCCAGGCCTTA 616 43058target_R GTTCAGAGGCACACAATGTG 46447target_F AGTTGAAGGCCACTTGGTCA 657 46447target_R ATGACAATTTGTCCTGGTGGCC 表 2 sgRNA体外转录模板合成引物Table 2. Primers for synthesis of sgRNA in vitro transcription template引物名称 Primer name 引物序列(5'→3') Primer sequence T43058-F1 TAATACGACTCACTATAGTCACTGGGGACTTGGACTT T43058-R1 TTCTAGCTCTAAAACCAAGTCCAAGTCCCCAGTG T43058-F2 TAATACGACTCACTATAGGTGCATCTTTAGGAGACAC T43058-R2 TTCTAGCTCTAAAACGTGTCTCCTAAAGATGCACC T46447-F1 TAATACGACTCACTATAGATGTGGCTGCAGAAACTCG T46447-R1 TTCTAGCTCTAAAACCGAGTTTCTGCAGCCACAT T46447-F2 TAATACGACTCACTATAGAAGAAGCGCTCTAGAACAGG T46447-R2 TTCTAGCTCTAAAACCCTGTTCTAGAGCGCTTCT 体外Cas9切割验证主要包含3个过程：Cas9-sgRNA的自发组装、Cas9-sgRNA复合体与靶片段的特异结合、Cas9-sgRNA对靶点进行特异切割。采用20 μL反应体系：体外转录sgRNA模板100 ng，靶片段250 ng，Cas9蛋白1 μL，10×Cas9 Reaction buffer 2 μL，最后加Nuclease-free water补足至20 μL。
在进行Cas9体外切割时，反应体系首先加入除靶片段外其他成分进行Cas9与sgRNA组装(组装时间30 min)，再加入相应靶片段孵育1 h，切割完毕后在反应体系中加入2 μL的蛋白酶K再次孵育20 min。最终切割产物加入6×DNA Loading Buffer进行20 g/L的凝胶电泳，分析电泳条带灰度计算切割效率。
1.2.3 CRISPR/Cas9载体构建
确定有效的sgRNA后进行真核细胞表达载体构建。首先使用限制性内切酶BpiI对载体HP180_px330_GFP(图2)双酶切使其线性化，合成的sgRNA经退火形成双链由T4连接酶在16 ℃条件下连接1 h，然后热应激转入Trans5α感受态细胞，于220 r/min、37 ℃培养1 h后涂布含氨苄青霉素的LB平板，隔夜培养后挑取单克隆，进行菌液PCR并送测序，测序正确菌液进行质粒抽提，用于PEF电转。
1.2.4 PEF培养与转染
试验所用细胞经鉴定为公猪细胞(使用引物F：TCATAGCTCAAACGATGGACGTG，R：ACACAATGAAAGCGTTCATGGGTC，扩增片段大小为92 bp)。PEF复苏后加入含体积分数为12%胎牛血清的高糖DMEM培养液，置于38 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。当复苏后的细胞融合度达到80%~90%时，用质量分数为0.05%的胰酶消化后进行细胞计数。取1×106 mL−1细胞悬液加入1.5 mL离心管，加入100 μL电转液及目的质粒以Lonza核转仪进行电转，电转程序A003。转染24 h后，荧光显微镜下拍照并观察转染细胞荧光信号强弱，判断转染效果。
1.2.5 流式分选及单细胞克隆团鉴定
细胞转染2~3 d后进行流式分选(Fluorescence activating cell sorter，FACS)。细胞分选前经质量分数为0.05%的胰酶消化，加入含体积分数为2%胎牛血清的 DPBS重悬，并在上机前经40 µm细胞筛过滤防止细胞团块的干扰。根据GFP标记激发波长488 nm分选出阳性细胞(5×104~10×104个)并进行极限稀释(梯度稀释降低细胞密度)培养，细胞培养形成单个细胞团后取部分细胞抽提DNA进行Y染色体性别决定区(Sex determination region of Y chromosome, SRY)基因鉴定。引物信息如表3所示。
表 3 靶基因及SRY基因PCR引物Table 3. PCR primers of target gene and SRY gene引物名称 Primer name 引物序列(5′→3′) Primer sequence 产物长度/bp Product length 43058_F CATTGTGATGCATGGGCGATTT 238 43058_R GAGACCTCAAGTCCAAGTCCC 46447_F ATGTGGCTGCAGAAACTCGT 169 46447_R ATTTGTCCTGGTGGCCTGAC SRY_F GTGGCTGGGATGCAAGTGGAAA 228 SRY_R GCCTTGGCGACTGTGTATGTGAA 1.2.6 实时定量荧光PCR检测Y染色体敲除效率
分选后待细胞融合度达到80%~90%提取基因组DNA，并设计相应靶基因及SRY定量引物(表3)观察其DNA含量是否显著降低。以基因组为模版检测目的基因在DNA水平的含量是否变化，并以基因组水平的β-actin为内参。反应体系与反应产物均按照相应试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser与PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix)说明进行。
1.2.7 核型鉴定
对SRY鉴定为阴性细胞继续扩繁培养，并传代至T25培养瓶，待细胞生长至融合度为70%~80%时进行核型分析，判断染色体核型是否缺失。核型分析由杭州卡优太谱生物科技公司进行。
2. 结果与分析
2.1 多拷贝基因查询及sgRNA设计结果
2.1.1 多拷贝基因查询结果
通过Ensembl的blast筛选出了35个位于Y染色体上的多拷贝基因，统计结果如表4所示。
表 4 猪Y染色体多拷贝基因信息1)Table 4. Muti-copy genes in Y chromosome of pig基因编号 Gene_ID 起始位置 Begin position 结束位置 End position 长度/bp Length 拷贝数 Copy number ENSSSCG00000041799 20570323 20570724 402 90 ENSSSCG00000045041 23748599 23749006 408 42 ENSSSCG00000043614 22488485 22488925 441 39 ENSSSCG00000043058 21558744 21559151 408 39 ENSSSCG00000050250 20115553 20117373 1821 32 ENSSSCG00000049276 20156946 20158766 1821 32 ENSSSCG00000041211 20259563 20261383 1821 32 ENSSSCG00000041323 20851299 20853119 1821 32 ENSSSCG00000051247 23675355 23677155 1821 32 ENSSSCG00000044850 22938437 22940148 1721 32 ENSSSCG00000035359 19637403 19639087 1685 32 ENSSSCG00000038218 20710734 20712418 1685 32 ENSSSCG00000031994 20902449 20904133 1685 32 ENSSSCG00000032210 21694455 21696139 1685 32 ENSSSCG00000033039 19929688 19931370 1683 32 ENSSSCG00000044818 21140962 21142262 1301 32 ENSSSCG00000039954 22859918 22861602 1685 31 ENSSSCG00000049743 23367269 23368953 1685 31 ENSSSCG00000042334 19885774 19887455 1682 31 ENSSSCG00000042971 21982938 21984619 1682 31 ENSSSCG00000045651 23897691 23899366 1676 31 ENSSSCG00000051215 20442628 20444448 1821 30 ENSSSCG00000041507 22640161 22641981 1821 30 ENSSSCG00000045761 24007552 24009372 1821 29 ENSSSCG00000041750 23944189 23946009 1821 29 ENSSSCG00000050201 21301627 21303492 1821 29 ENSSSCG00000048908 19541113 19542933 1821 27 ENSSSCG00000045241 21443949 21445655 1707 26 ENSSSCG00000046033 23455676 23457401 1726 24 ENSSSCG00000036112 22537239 22541180 3942 3 ENSSSCG00000043960 23320436 23322365 1930 2 ENSSSCG00000031258 21822265 21828538 6274 * ENSSSCG00000051413 21205077 21216797 11721 * ENSSSCG00000046447 22138546 22177691 39146 * ENSSSCG00000042484 23810416 23850459 40244 * 1) “*”代表基因序列太长，不存在完全拷贝片段，拷贝数统计不完整，但存在部分序列多拷贝，因此也可作为多拷贝基因的一种；加粗Gene_ID为靶基因 1) “*” represents that the gene sequence is too long, there is no complete copy fragment, and the copy number statistics are incomplete, but there are multiple copies of some sequences, so it can also be used as a kind of multi copy gene；Bold gene ID represents the target gene 通过再次与NCBI数据库进行比对，以及基于靶点基因组测序的真实结果与sgRNA设计的实际情况，我们最终选择了网站预测评分较高、符合测序结果且在Y染色体上重复拷贝数靠前(多位点DSB)的Gene_ID为ENSSSCG00000043058、ENSSSCG00000046447的基因进行了sgRNA设计。这2个基因在全基因组的比对结果如图3所示。
![图 3 ENSSSCG00000043058和ENSSSCG00000046447在猪染色体上的位置示意图]()
图 3 ENSSSCG00000043058和ENSSSCG00000046447在猪染色体上的位置示意图所选择的靶基因仅存在于Y染色体上并有多个拷贝，有利于实现Y的多位点切割Figure 3. Locations of ENSSSCG00000043058 and ENSSSCG00000046447 on pig chromosomeThe selected target genes only exist on the Y chromosome and have multiple copies, which is conducive to the realization of Y multipoint cutting2.1.2 sgRNA设计结果
对ENSSSCG00000043058和ENSSSCG00000046447位点进行sgRNA设计(表5)。在sgRNA及其互补序列末端分别加上与BpiI酶切HP180_px330_GFP质粒互补的黏性末端，由华大基因合成相应的Oligo。
表 5 sgRNA靶点位置和序列Table 5. Location and sequence of sgRNA targetsgRNA Y染色体位置 Position on Y chromosome 靶点序列 Target sequence 43058sg1 21558841~21558860 TCACTGGGGACTTGGACTTG 43058sg2 21558795~21558814 ATGGAGGATTCTGAACCAGT 46447sg1 22254580~22254599 GATGTGGCTGCAGAAACTCG 46447sg2 22254625~22254644 AAGAAGCGCTCTAGAACAGG 2.2 sgRNA体外切割结果
以野生型PEF DNA为模板进行PCR扩增，产物进行凝胶电泳分析后切胶回收得到sgRNA体外转录模板。根据GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit试剂盒的体系与方法进行sgRNA的转录模板合成(图4A)与体外sgRNA转录(图4B)，转录产物经纯化后电泳验证条带完整性(长度100 bp)，电泳结果与预期一致。
![图 4 靶片段模板DNA扩增与sgRNA体外转录结果]()
图 4 靶片段模板DNA扩增与sgRNA体外转录结果M：DL2000 DNA marker；1和2分别代表扩增靶片段43058和46447，长度分别为616和657 bp；3、4、5和6代表转录产物43058sg1、43058sg2、46447sg1和46447sg2，长度均为100 bpFigure 4. Amplification of target fragment template DNA and in vitro transcription of sgRNAM:DL2000 DNA marker; 1 and 2 represent the amplified target fragment 43058 and 46447 respectively, and the lengths are 616 and 657 bp respectively; 3, 4, 5 and 6 represent transcripts 43058sg1, 43058sg2, 46447sg1 and 46447sg2 respectively, and the lengths all are 100 bp将扩增好的靶片段、sgRNA按照一定比例与Cas9混合，按照方法中的步骤进行反应得到切割产物，43058sg1的理论切割产物长度为525和91 bp，43058sg2的理论切割产物长度为444和172 bp，46447sg1的理论切割产物长度为498和159 bp，46447sg2的理论切割产物长度为453和204 bp。凝胶电泳分析表明43058sg2与46447sg2均达到了预期的切割效果，并且43058sg2实现了接近完全的靶基因切割(图5)。灰度分析表明，46447sg2的体外切割效率也达到了58%(图6)，最终我们选择 43058sg2和46447sg2进行载体构建。
![图 5 设计的sgRNA体外切割电泳图]()
图 5 设计的sgRNA体外切割电泳图M：DL7000 DNA marker；1、4：未转染细胞对照；2、3、5、6为设计的43058sg1、43058sg2、46447sg1以及46447sg2的实际切割产物Figure 5. Electrophoregram of in vitro cleavage of designed sgRNAM: DL7000 DNA marker; 1, 4: Control of untransfected cells; 2, 3, 5, 6 are the actual cutting products of designed 43058sg1, 43058sg2, 46447sg1 and 46447sg2 respectively2.3 HP180_px330_GFP载体构建结果
HP180_px330_GFP骨架上有预留的BpiI双酶切位点，其线性化后与退火形成具有黏性末端的双链sgRNA，在连接酶作用下形成闭合环状结构。其测序结果如图7所示，结果与设计的sgRNA结果一致，表明载体构建成功。
![图 7 HP180_px330_GFP质粒测序结果]()
图 7 HP180_px330_GFP质粒测序结果绿色下划线部分为BpiI双酶切位点，红色箭头标注部分为针对各靶位点构建的识别序列Figure 7. HP180_ px330_ GFP plasmid sequencing resultsThe underlined part in green is BpiI double digestion site, and the marked part in red arrow is the recognition sequence constructed for each target site2.4 细胞性别鉴定及细胞转染检测
2.4.1 性别鉴定
对试验所用PEF进行SRY鉴定，电泳结果显示目的细胞为雄性(图8)。
![图 8 SRY基因检测结果]()
图 8 SRY基因检测结果M：DL700 DNA marker；1：空白水对照；2：阴性对照母猪DNA；3：试验所用公猪细胞Figure 8. SRY gene assay resultM：DL700 DNA marker;1: Blank water control; 2: DNA of negative control sow; 3: Boar cells used in the experiment2.4.2 细胞转染
将构建的CRISPR/Cas9载体通过细胞核转染导入雄性PEF中。由于载体带有增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)表达单元，可通过观察EGFP的表达评估载体的转染效率。对已电转的细胞培养24 h后观察荧光信号，确定已构建好的载体成功电转进入细胞。结果(图9)表明质粒已成功表达。
![图 9 PEF电转后荧光表达效果图]()
图 9 PEF电转后荧光表达效果图A、B分别为2次重复试验的转染效果示意图；A1、B1为细胞明场图片，A2、B2分别为A1、B1同视野的EGFP表达图Figure 9. EGFP expression after PEF electroporationA and B are cell transfection results of two repeated experiments；A1 and B1 are transfected cells imaged in bright field, and A2 and B2 are EGFP expression images of the same vision as A1 and B1, respectively2.5 FACS分选阳性细胞及单克隆鉴定结果
通过FACS分选EGFP阳性细胞，我们发现对照组与试验组GFP信号存在显著差异，其中对照组未检测到GFP信号，而阳性对照的细胞转染效率达到了71%，这与荧光观察结果类似。通过培养EGFP阳性细胞，获得单细胞克隆团。接着我们对单克隆细胞团提取微量DNA，进行相应的SRY检测，发现1/3的细胞克隆未检测到SRY信号(图10)，显示这些细胞的Y染色体存在缺失的可能。
![图 10 单克隆细胞团SRY基因鉴定示意图]()
图 10 单克隆细胞团SRY基因鉴定示意图M：DL700 DNA marker；1~24代表单克隆细胞团编号Figure 10. SRY gene identification of monoclonal cell clustersM: DL700 DNA marker; 1−24 represent the number of monoclonal cell clusters2.6 实时定量荧光PCR检测目的基因及SRY基因
由于选用的目的基因在PEF上并不表达mRNA，因此采用qPCR检测目的基因(内参基因选择β-actin)和SRY基因的DNA含量。我们抽提EGFP阳性细胞的基因组DNA，进行qPCR分析目的基因(43058和46477)和SRY在DNA水平的含量。qPCR结果显示在进行靶基因敲除后，靶基因含量均显著降低。其中靶基因43058和46447分别下降了约20%和30%(P<0.05)，对应的SRY也下降了7%和11%。46447敲除效果相对于43058的基因敲除效果更为显著，不仅靶基因敲除效率较高，SRY基因DNA水平也下降较多(图11)。
![图 11 EGFP阳性细胞中靶基因和SRY基因相较于正常雄性细胞的DNA水平检测]()
图 11 EGFP阳性细胞中靶基因和SRY基因相较于正常雄性细胞的DNA水平检测“*”“**”“***”分别表示差异达到0.05、0.01和0.001的显著水平(t检验)Figure 11. Detection of DNA levels of target genes and SRY gene in EGFP-positive cells compared with normal male cells“*” “**” “***” indicate significant differences at 0.05, 0.01 and 0.001 levels respectively (t test)2.7 核型分析结果
核型鉴定结果显示上述流式分选得到的EGFP阳性细胞存在染色体缺失现象，表明设计的sgRNA在细胞水平上能够实现整个Y染色体的删除。在鉴定的12个单细胞核型中，有1个完全缺失Y染色体(图12)。
![图 12 EGFP阳性细胞核型分析结果示意图]()
图 12 EGFP阳性细胞核型分析结果示意图Figure 12. Diagram of karyotype assay result of EGFP-positive cells3. 讨论与结论
CRISPR/Cas9近年来由于其基因编辑的灵活性和高效率而被广泛应用。其通过DSB导致的非保守非同源末端连接修复途径造成目的基因的敲除效果，但是该种途径常常造成异常的插入缺失，甚至破坏染色体和基因组的完整性[24-26]。而以天然的(或定向的)DNA模板的同源重组修复(Homologous recombination repair，HDR)途径则可以对目的基因位点进行精确修饰而产生意向的目的基因型[14, 27]，本研究利用CRISPR系统的高效切割能力对Y染色体上多个重复基因位点进行切割，通过产生多重DSB损伤基因组和DNA修复的稳定性，引起Y染色体降解。实现整条染色体删除是建立在CRISPR/Cas9系统能对多个位点进行同时编辑的基础上的，虽然早期的研究已经证明能够产生大片段的缺失，但这对于整条染色体的消融还远远不够。2015年，Yang等[28]首先通过靶向内源性逆转率病毒(PERVs)的62个重复位点在猪上实现了PERVs的全基因组降解；随后，研究人员进一步利用CRISPR/Cas9对靶点切割的多重性，成功在ES细胞、体内细胞和受精卵中删除了Y染色体，并对其他常染色体(7号、14号)及X染色体进行了特异性消除[22-23]。实现该技术的关键是在Y染色体上寻找能够被sgRNA特异识别的靶向序列，这些序列在其他常染色体或X染色体上不能被识别，通过对其进行多重切割从而实现整条染色体的消融。因此在选择靶点时，单一数据库的比对结果不能很好地反映个体染色体组的真实情况，最终选择靶基因是在Ensembl比对的基础上重新与NCBI、Sanger测序结果进行比对，选择多个数据库共有序列并与个体基因组序列结合，增加靶点的可靠性。
不同于一般的sgRNA效率检测采用T7E1酶切和测序验证，由于本试验靶点为Y上的多拷贝重复序列，这些片段在Y上广泛分布且保守性不强，可能会存在一些SNP或者突变，导致扩增未编辑前的靶基因产物时出现套峰现象，和编辑后的测序结果无法区分。因此在这里只能通过体外切割进行sgRNA的效率检测。最终以ID为ENSSSCG00000043058、ENSSSCG00000046447的基因为靶点设计sgRNA，通过对Y上不同靶点，即散在重复和簇状聚集的靶基因的打靶，探索了不同打靶位点对编辑效率的影响，结果表明簇状聚集的打靶效果要明显优于散在重复序列，这与Zuo等[22]和Adikusuma等[23]的研究结果一致，其原因可能是长臂偶然断裂造成的染色体截断或易位导致的。另外由于我们选择的基因为非蛋白编码基因，所以在定量分析时最终选择以DNA为模板。在检测靶点DNA含量变化的同时我们也对SRY含量进行了定量，结果均表明其表达量随靶基因降低而降低，虽然这种变化并不明显，但从侧面说明了整条Y染色体降解的可能性。核型分析的结果也表明部分单细胞克隆在染色体水平确实存在着Y染色体的丢失，表明通过多位点断裂造成整条染色体的缺失是可行的。
本研究通过寻找能够特异性识别Y染色体的多拷贝重复序列设计sgRNA，并通过体外切割、qPCR、细胞转染、核型分析等手段证明了该系统在体外体内都有较高的切割效率，可成功实现整条染色体的消除，为未来染色体功能及动物性别控制研究提供了新的方向。
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图 1 柚木林下套种草豆蔻示意图
Figure 1. Diagram of intercropping Alpinia katsumadai within a Tectona grandis forest palntation
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图 2 林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤真菌多样性指数
Figure 2. Rhizosphere soil fungal diversity index of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)
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图 3 林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤物种在门水平的组成
Figure 3. Rhizosphere soil species composition of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK) at phylum level
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图 4 林药套种(T)与未套种(CK)担子菌门和子囊菌门相对丰度归一化指数
Figure 4. Normalized index of relative abundance of Basidiomycota and Ascomycota of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)
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图 5 林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤非度量多维尺度法(NMDS) 分析和主成分分析(PCA)
Figure 5. Nonmetric multidimensional scaling (NMDS) analysis and principal component analysis (PCA) of rhizosphere soil of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)
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图 6 林药套种(T)与未套种(CK)根际土壤线性判别(LEfSe)分析
Figure 6. Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis of rhizosphere soil of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)
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图 7 林药套种(T)和未套种(CK)根际土壤真菌在门水平的共现性网络分析
Figure 7. Network analysis of rhizosphere soil fungi co-occurrence for forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK) at phylum level
表 1 研究样地基本概况
Table 1 Basic information of the research plot
坡度/(°)
Slope海拔/m
Altitude树高/m
Height胸径或地径/cm
DBH or ground
diameter柚木
Tectona grandis0 61 12.6 33.5 草豆蔻
Alpinia katsumadai0 61 2.27 2.03 
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表 2 林药套种(T)和未套种(CK)根际土壤真菌共现网络拓扑结构特征
Table 2 Topological characteristics of fungal co-occurrence networks in rhizosphere soil of forest medicine intercropping (T) and non-intercropping (CK)
处理
Treatment边
Edge节点
Note正向边比例/%
Positive edge proportion负向边比例/%
Negative edge proportion平均度
Average degree图密度
Graph density模块化
ModularityT 367 192 69.88 30.12 3.904 0.021 1.336 CK 332 188 48.77 51.23 3.458 0.018 0.830
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