• 《中国科学引文数据库(CSCD)》来源期刊
  • 中国科技期刊引证报告(核心版)期刊
  • 《中文核心期刊要目总览》核心期刊
  • RCCSE中国核心学术期刊

广东潮土生物炭对不同水稻品种的土壤细菌群落的影响

丁玮, 阳树英, 刘洋, 张亚宁, 张波

丁玮, 阳树英, 刘洋, 等. 广东潮土生物炭对不同水稻品种的土壤细菌群落的影响[J]. 华南农业大学学报, 2022, 43(3): 42-49. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202108022
引用本文: 丁玮, 阳树英, 刘洋, 等. 广东潮土生物炭对不同水稻品种的土壤细菌群落的影响[J]. 华南农业大学学报, 2022, 43(3): 42-49. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202108022
DING Wei, YANG Shuying, LIU Yang, et al. Effects of fluvo-aquic soil biochar on soil bacterial communities of different rice varieties in Guangdong Province[J]. Journal of South China Agricultural University, 2022, 43(3): 42-49. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202108022
Citation: DING Wei, YANG Shuying, LIU Yang, et al. Effects of fluvo-aquic soil biochar on soil bacterial communities of different rice varieties in Guangdong Province[J]. Journal of South China Agricultural University, 2022, 43(3): 42-49. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202108022

广东潮土生物炭对不同水稻品种的土壤细菌群落的影响

基金项目: 国家重点研发计划子课题(2017YFD200803-01)
详细信息
    作者简介:

    丁玮,硕士研究生,主要从事农业生态方向研究,E-mail:dwjy2021@163.com

    通讯作者:

    阳树英,副教授,博士,主要从事农业生态方向研究,E-mail: ysyalxh@126.com

  • 中图分类号: S181;S154.1

Effects of fluvo-aquic soil biochar on soil bacterial communities of different rice varieties in Guangdong Province

  • 摘要:
    目的 

    探明生物炭对不同水稻品种的土壤细菌群落多样性、丰度及结构的影响,为生物炭在水稻生产中的应用提供科学依据。

    方法 

    2019年选取广东省江门县台山镇潮土型晚稻田,设置不施生物炭(对照,CK)、生物炭施加3.5 t/hm2(Tr1)、生物炭施加7 t/hm2(Tr2)为主区,选用6个不同的常规优质水稻品种‘黄华占’、‘五常香稻’、‘象牙香占’、‘湘晚籼17’、‘农香32’和‘玉针香’进行裂区试验,并进行16S rRNA基因V3-V4高通量测序技术分析。

    结果 

    生物炭Tr1、Tr2处理均显著提高了‘玉针香’的土壤细菌群落多样性,生物炭Tr2处理显著提高了‘玉针香’的土壤细菌群落丰富度,生物炭Tr1处理显著提高了‘黄华占’的土壤细菌群落丰富度。共获得细菌73门92纲174目298科682属456种,主要包含变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、硝化螺旋菌门Nitrospirae和酸杆菌门Acidobacteria等10个主要门类细菌,其中变形菌门为第1优势菌(相对丰度为30.0%~61.1%),以γ–、δ–、α–变形菌纲为优势亚群,某些水稻品种的变形菌门、拟杆菌门在Tr2处理较CK出现显著上升,广古菌门Euryarchaeota在Tr1处理较CK明显上升。生物炭处理引起了对应土壤细菌群落结构组成在属水平上的变化,食酸菌属Acidovorax、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、土地杆菌属Pedobacter等相对丰度较低或极低的土壤细菌类群更敏感,更容易受到生物炭的影响。与CK相比,生物炭Tr1处理对土壤细菌群落组成及分布存在影响。

    结论 

    生物炭处理可在一定程度上对稻田土壤细菌群落产生影响,水稻品种‘玉针香’和‘黄华占’的土壤细菌群落受生物炭施加影响变化较大,生物炭处理提高了‘玉针香’和‘黄华占’的土壤细菌群落多样性及丰富度,生物炭处理的差异主要体现在土壤细菌群落相对丰度上。

    Abstract:
    Objective 

    To discover the effects of biochar on soil bacterial community diversity, abundance and structure of different rice varieties, and provide a scientific basis for the application of biochar in paddy field.

    Method 

    Experiment of split-split plot was designed in the late rice field of Fluvo-aquic soil type in Taishan Town of Jiangmen County, Guangdong Province in 2019, treatments were designed with no biochar application(CK), biochar application of 3.5 t/hm2 (Tr1) and 7 t/hm2 (Tr2) as the main plots, six different conventional high-quality rice varieties, including ‘Huanghuazhan’, ‘Wuchangxiangdao’, ‘Xiangyaxiangzhan’, ‘Xiangwanxian’, ‘Nongxiang 32’ and ‘Yuzhenxiang ’, were designed as the subplots in each main plots. 16S rRNA gene V3-V4 high-throughput sequencing technology analysis was conducted.

    Result 

    Biochar Tr1 and Tr2 treatments significantly improved the bacterial community diversity of rice variety ‘Yuzhenxiang’, and biaochar Tr2 treatment significantly improved the bacterial community richness of rice variety ‘Yuzhenxiang’, and also biaochar Tr1 treatment significantly increased the bacterial community abundance of rice variety ‘Huanghuazhan’. A total of 73 phyla, 92 classes, 174 orders, 298 families, 682 genera and 456 species of bacteria were obtained, mainly including 10 main phyla of Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Nitrospirae, Acidobacteria, etc. Among them, the Proteobacteria are the first dominant bacteria (the proportion of relative abundance reaching 30.0%~61.1%), with γ-, δ-, and α-Proteobacteria as the dominant subgroups. Compared with CK, Proteobacteria and Bacteroidetes of some rice varieties showed a significant increase in Tr2 treatment, and Euryarchaeota increased significantly in Tr1 treatment. Biochar treatment caused changes in the structural composition of the corresponding soil bacterial community at the genus level. Soil bacterial groups with relatively low or extremely low abundance, such as Acidovorax, Sphingomonas and Pedobacter, were more sensitive and susceptible to the impact of biochar. The Tr1 treatment had an effect on the composition and distribution of soil bacteria compared with CK.

    Conclusion 

    Biochar treatment can affect the soil bacterial community in rice field to some extent, the soil bacterial communities of rice varieties of ‘Yuzhenxiang’ and ‘Huanghuazhan’ are mostly affected by biochar. Biochar treatment increases the soil bacterial community diversity and richness of rice varieties of ‘Yuzhenxiang’ and ‘Huanghuazhan’, and the difference between biochar treatment is mainly reflected in the relative abundance of soil bacterial communities.

  • 静原鸡主要分布于宁夏彭阳县和甘肃静宁县,2006年被农业部认定为地方优良品种,已被列入国家级畜禽遗传资源保护名录[1],根据羽色的不同,分为白羽、麻羽和黑羽3个群体。由于长期处于气候高寒湿润、地形起伏、牧草及昆虫众多的生活环境和优越的地理位置,静原鸡具有耐粗饲、抗逆性强、氨基酸含量丰富、肉质细嫩、营养和滋补价值高等特点,尤其多不饱和脂肪酸(二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸)含量较高[2],符合现今人们对高品质鸡肉的要求,属鸡肉中优选的绿色食品[3]

    腺苷酸激酶(Adenylate kinase, AK)是一种普遍存在于动植物体内的单体酶,对生物的生长和维持至关重要[4],主要调节腺嘌呤核苷酸代谢,催化反应:ATP+AMP↔2ADP,在维持细胞能量平衡中起着不可或缺的作用[5]。在哺乳动物中,有几种AK亚型具有组织特异性分布和独特的亚细胞定位[6],其中AK1蛋白被认为是骨骼肌细胞质中的主要AK亚型[7]。猪心脏中胞质酶AK1蛋白的三维结构已经被Schulz等[8]和Sachsenheimer等[9]准确测定。有研究表明,AK1基因缺失的小鼠尽管肌肉形成正常,但由于ADP的异常积累会导致骨骼肌松弛延迟[10]。此外,还有研究发现AK1蛋白磷酸化可能是质膜线粒体和KATP通道之间传递信号所必需的[11]。目前关于AK1基因的研究集中在与溶血性贫血相关的罕见遗传疾病中,国内外将AK1作为肌苷酸影响基因及有关AK1基因结构及功能预测的研究鲜有报道。

    本研究通过对宁夏优良地方品种静原鸡AK1基因CDS区序列进行扩增、克隆、构建其真核表达载体,运用生物信息学分析方法预测其理化性质、亲水性/疏水性、跨膜结构域、磷酸化位点、亚细胞定位、磷酸化位点、B细胞抗原表位、基因共表达、CpG岛、蛋白的空间结构等,为后续深入研究AK1基因蛋白水平、代谢水平和细胞功能研究等的调控机理和表达模式提供科学依据,并为我国地方品种鸡的分子育种技术平台奠定基础。

    随机屠宰宁夏彭阳县朝那鸡繁育中心180日龄静原鸡公、母各15只(饲养管理条件相同),采集腿肌、胸肌于液氮罐中,带回实验室于−80 ℃保存备用。试剂:Trizo,Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒(上海翊圣生物公司),DNA loading buffer(百泰克),核酸染料(索莱宝),pMD18-T、DH5α、质粒小提中量试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根),T4连接酶(NEB),EcoRⅠ、BamHⅠ(宝生物有限公司)。

    通过传统Trizo(Invitrogen, USA)法提取静原鸡腿肌、胸肌的总RNA,并对其RNA的纯度、完整性、浓度进行检测。采用Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒合成cDNA后,于−20 ℃保存备用。

    根据GenBank上已公布的原鸡AK1基因序列,利用Primer 5.0软件设计特异性引物(表1),并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    表  1  静原鸡AK1基因CDS区引物序列
    Table  1.  Primer sequence for CDS region in AK1 gene of Jingyuan chicken
    基因
    Gene
    登录号
    Accession number
    引物序列(5′→3′)1)
    Primer sequence
    产物长度/bp
    Product length
    退火温度/℃
    Annealing temperature
    AK1 M37901 F:TCCTCCACCCAGACAGCA
    R:ACGGGAAAGAGCCAAACA
    741 57.6
    AK13 M37901 F:ccg GAATTCTCCTCCACCCAGACAGCA
    R:cgc GGATCCACGGGAAAGAGCCAAACA
    759 62.7
     1) 带有下划线的序列为酶切位点,AK13上、下游引物分别插入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点
     1) Underlined sequences are restriction sites, and forward and reverse primers of AK13 contained EcoR Ⅰ and BamHⅠ restriction sites respectively
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    PCR扩增总体系为20 μL:cDNA样品1 μL,上、下游引物各0.5 μL,Taq PCR Master Mix 11 μL,ddH2O 7 μL。AK1基因CDS区PCR扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,退火40 s,72 ℃延伸45 s,共31个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR产物通过10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测后,使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行回收。

    将回收纯化好的目的片段与pMD18-T载体4 ℃下连接并过夜。将连接好的带有pMD18-T载体的目的片段转化到DH5α感受态细胞中,冰浴30 min,42 ℃热激90 s,冰浴3 min,加入无抗液体LB培养基,混匀后置于37 ℃摇床150 r/min振荡培养45 min,涂布于含氨苄抗性的LB平板培养基上,37 ℃条件下培养12~16 h,随机挑取5个单菌落放入含氨苄抗性的LB液体培养基220 r/min震荡培养8 h,菌液PCR扩增。收集菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

    引物设计合成见“1.2.2”,扩增回收同“1.2.3”,选择pEGFP-N1真核表达载体进行质粒提取。利用EcoRⅠ、BamHⅠ对AK1基因与pEGFP-N1质粒进行双酶切,双酶切体系为50 μL,具体加入量分别为:11 μL ddH2O,5 μL 10×Buffer,2 μL EcoRⅠ,2 μL BamHⅠ,30 μL重组质粒(目的片段)。37 ℃酶切6 h后使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收pEGFP-N1载体片段和AK1目的片段,AK1基因与pEGFP-N1载体的酶切回收片段经过T4连接酶连接后转化。AK1-pEGFP-N1载体进行双酶切鉴定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

    采用BioEdit软件对AK1基因的核苷酸序列进行比对,分析碱基组成、氨基酸数目及组成;相对分子质量和等电点运用在线网站expasy的protparam程序( http://web.expasy.org/protparam/)进行分析;蛋白质亲水性运用在线网站expasy的protscale程序( https://web.expasy.org/protscale/)进行分析;蛋白质三级结构运用在线网站swiss-model( http://swissmodel.expasy.org/)进行预测;蛋白质跨膜结构域运用在线网站TMHMM-2.0( http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)进行预测;磷酸化位点运用在线网站NetPhos( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行预测;B细胞抗原表位运用在线网站immuneepitope的bcell程序( http://tools.immuneepitope.org/main/bcell/)进行分析;蛋白质二级结构运用在线网站psipred( http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)进行预测;基因共表达和GO功能注释分析通过在线网站string( https://string-db.org/)进行分析;CpG岛运用在线网站novopro( http://www.novopro.cn/tools/cpg_islands.html)进行预测;基因的亚细胞定位通过在线网站psort Ⅱ( https://psort.hgc.jp/form2.html)进行预测。

    静原鸡胸肌、腿肌总RNA通过10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1所示,可清晰看到3个条带,无明显降解。核酸蛋白仪检测RNA的D260 nm/D280 nm在1.8~2.2之间,完整性较好(RIN≥6.5),可用于后续试验。

    图  1  静原鸡不同组织总RNA提取
    1、2:胸肌;3、4:腿肌;M:Trans2K Plus DNA Marker
    Figure  1.  Total RNA extraction from different tissues of Jingyuan chicken
    1, 2: Chest muscle; 3, 4: Leg muscle; M: Trans2K Plus DNA Marker

    PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测,经凝胶成像仪检测发现扩增片段条带整齐明亮且无引物二聚体等杂带,表明引物特异性较好,扩增条件合适。CDS区扩增产物条带长度大小约为741 bp,与预期目的片段长度大小相符(图2),可以进行回收纯化;回收后产物连接pMD18-T载体进行克隆,菌液PCR鉴定片段大小与预期目的片段一致。

    图  2  静原鸡AK1基因PCR扩增电泳图
    M: DL2000 DNA Marker;1~5:扩增片段
    Figure  2.  Electrophoresis of PCR amplification of AK1 gene in Jingyuan chicken
    M: DL2000 DNA Marker; 1–5: Amplified fragments

    AK1基因CDS区加酶切位点扩增产物条带长度大小约为759 bp,与预期目的片段长度大小相符(图3),可以进行回收纯化及菌液扩增。

    图  3  静原鸡AK1基因加酶切位点PCR扩增电泳图
    M:DL2000 DNA Marker;1~5:扩增片段
    Figure  3.  Electrophoresis of PCR amplification of AK1 gene with restriction site in Jingyuan chicken
    M: DL2000 DNA Marker; 1–5: Amplified fragments

    重组质粒AK1-pEGFP-N1经EcoRⅠ和BamHⅠ 37 ℃双酶切6 h后,经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测得到4 033和759 bp的2个片段(图4),一个为质粒pEGFP-N1本身的片段,为4033 bp,一个为目的基因AK1的片段,约为759 bp,酶切结果说明AK1基因与pEGFP-N1载体正确重组。将菌液通过甘油保存后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

    图  4  静原鸡AK1-pEGFP-N1载体酶切电泳图
    M:DL2000 DNA Marker;1~7:扩增片段
    Figure  4.  Restrictive enzyme digestion and electrophoresis of AK1-pEGFP-N1 vector in Jingyuan chicken
    M: DL2000 DNA Marker; 1–7: Amplified fragments

    测序后对静原鸡AK1基因序列进行校正、拼接,AK1基因CDS区全长585 bp,共编码194个氨基酸(图5)。核苷酸组成分析(图6)发现AK1基因CDS区鸟嘌呤(G)核苷酸数量占比最多(33.68%),胸腺嘧啶(T)核苷酸占比最少(16.41%),腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)数目相当,且G+C含量(60.00%)高于A+T含量(40.00%)。编码区DNA单链和双链相对分子质量分别为177991 和356652 。

    图  5  AK1基因编码区全长序列与对应的氨基酸序列
    Figure  5.  The full length coding sequence of AK1 gene and corresponding amino acid sequence
    图  6  AK1基因CDS区核苷酸组成
    Figure  6.  Nucleotide composition in CDS region of AK1 gene

    静原鸡AK1基因编码蛋白质的各种氨基酸中赖氨酸(Lys)数目占比最多(11.3%),天冬酰胺(Asn)和半胱氨酸(Cys)数目占比最少(1.0%)(表2)。氨基酸残基中正电荷残基总数(Arg+Lys)为32个,负电荷残基总数(Asp+Glu)为29个。理化性质分析结果显示,静原鸡AK1蛋白的原子组成为C962H1566N262O291S7,相对分子质量为21683,理论等电点为8.68,不稳定指数为21.56,脂肪指数为85.88。

    表  2  AK1基因编码蛋白的氨基酸组成
    Table  2.  The composition of amino acid coded by AK1 gene
    氨基酸
    Amino Acid
    数量
    Number
    频率/%
    Frequency
    Ala 10 5.2
    Arg 10 5.2
    Asn 2 1.0
    Asp 11 5.7
    Cys 2 1.0
    Gln 6 3.1
    Glu 18 9.3
    Pro 6 3.1
    Thr 13 6.7
    Val 15 7.7
    Gly 19 9.8
    His 4 2.1
    Ile 9 4.6
    Leu 20 10.3
    Lys 22 11.3
    Met 5 2.6
    Phe 5 2.6
    Ser 9 4.6
    Tyr 8 4.1
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    使用在线分析网站对静原鸡AK1基因编码蛋白对水分子的亲和力进行研究的结果(图7)表明,第15位缬氨酸(Val)疏水性最强(最高分数1.933),第105位谷氨酸(Glu)亲水性最强(最低分数−2.589),总体亲水性均值小于0(−0.469),说明该蛋白具有较强的亲水区域。

    图  7  静原鸡AK1蛋白的疏水性/亲水性分析
    Figure  7.  Hydrophobic/hydrophilic analysis for AK1 protein in Jingyuan chicken

    采用在线软件TMHMM-2.0的预测结果表明静原鸡AK1基因的编码蛋白不存在跨膜结构域,不是跨膜蛋白。CpG岛预测显示,AK1基因编码蛋白存在2个CpG岛。

    静原鸡AK1蛋白可能存在7个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,分别位于氨基酸序列上第20、39、50、52、88、137、189位,8个苏氨酸(Thr)磷酸化位点,分别位于第3、24、36、87、136、146、153、179位,3个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,分别位于第35、118、155位(图8)。

    图  8  静原鸡AK1蛋白磷酸化位点
    Figure  8.  The phosphorylation sites of AK1 protein in Jingyuan chicken

    利用immuneepitope在线软件预测AK1基因编码蛋白的抗原表位(图9),结果发现静原鸡AK1蛋白存在10个B细胞抗原表位,分别位于1、17~25、38、48~56、85~88、97~111、122~124、134~147、155~158、176~181位氨基酸残基。

    图  9  AK1蛋白B抗原表位预测
    Figure  9.  Prediction of B epitope of AK1 protein

    二级结构预测结果(图10)显示,静原鸡AK1蛋白含有8.76%的伸展链,46.91%的α–螺旋,44.33%的无规则卷曲。三级结构预测结果仍以α–螺旋和无规则卷曲为主(相似性为86.39%)(图11)。

    图  10  静原鸡AK1蛋白质二级结构
    Figure  10.  The secondary structure of AK1 protein in Jingyuan chicken
    图  11  静原鸡AK1蛋白质预测三级结构
    Figure  11.  The predicted tertiary structure of AK1 protein in Jingyuan chicken

    通过string数据库对AK1基因进行共表达分析,发现在原鸡中AK1AMPD1PKM2存在共表达,共表达系数分别为0.116和0.063。PKM2AMPD1共表达系数为0.067,AMPD1AMPD3共表达系数为0.082。在其他有机体中AK1AMPD3AMPD1NTPCRPNPT1CD39L1PKM2APRTADSLADKTPK1均存在共表达。

    通过在线工具psortⅡ预测AK1基因编码产物的亚细胞定位,其分布在细胞质的可能性为52.2%,分布在细胞骨架的可能性为17.4%,分布在细胞核中的可能性为13.0%,分布在线粒体、过氧化物酶体、内质网中的可能性分别为8.7%、4.3%、4.3%。由此推断,AK1基因编码产物主要在细胞质中发挥生物学作用。

    通过string数据库对AK1基因进行GO富集分析,发现AK1基因参与4个分子功能GO条目,参与11个生物学过程GO条目,参与1个细胞组分GO条目(表3)。

    表  3  AK1基因的GO注释分析
    Table  3.  GO annotation analysis of AK1 gene
    项目
    Item
    GO条目
    GO term
    描述
    Description
    基因数1)
    Gene number
    错误发现率
    False discovery rate
    生物学过程
    Biological process
    GO:0009167 嘌呤核糖核苷单磷酸代谢过程
    Purine ribonucleoside monophosphate metabolic process
    4(41) 2.78×10−6
    GO:0009165 核苷酸生物合成的过程
    Nucleotide biosynthetic process
    4(40) 2.78×10−6
    GO:0009150 嘌呤核糖核苷酸的代谢过程
    Purine ribonucleotide metabolic process
    4(49) 2.78×10−6
    GO:0009168 嘌呤核糖核苷单磷酸生物合成过程
    Purine ribonucleoside monophosphate biosynthetic process
    3(25) 7.56×10−6
    GO:0009152 嘌呤核糖核苷酸的生物合成过程
    Purine ribonucleotide biosynthetic process
    3(29) 8.98×10−6
    GO:0017144 药物代谢过程
    Drug metabolic process
    3(68) 7.47×10−5
    GO:0006188 肌苷酸生物合成过程
    IMP biosynthetic process
    2(7) 8.04×10−5
    GO:0046040 肌苷酸代谢过程
    IMP metabolic process
    2(9) 1.20×10−4
    GO:0006165 二磷酸核苷磷酸化
    Nucleoside diphosphate phosphorylation
    2(14) 2.40×10−4
    GO:0009142 核苷三磷酸生物合成过程
    Nucleoside triphosphate biosynthetic process
    2(21) 4.20×10−4
    GO:0046034 ATP代谢过程
    ATP metabolic process
    2(31) 8.40×10−4
    分子功能
    Molecular function
    GO:0003824 催化活性
    Catalytic activity
    5(642) 2.00×10−3
    GO:0016301 激酶活性
    Kinase activity
    2(98) 7.50×10−3
    GO:0005524 ATP结合
    ATP binding
    3(202) 7.50×10−3
    GO:0016787 水解酶活性
    Hydrolase activity
    2(271) 3.13×10−2
    细胞组分
    Cellular component
    GO:0005829 细胞溶质
    Cytosol
    3(264) 1.43×10−2
     1) 括号内的数值表示富集到这个条目的所有基因数,括号外的数值表示差异显著的基因数
     1) The value in brackets represents the number of all genes enriched to this GO term, and the value outside brakets represents the number of significantly different genes
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    随着生命科学的发展,为揭示复杂的基因组信息结构及遗传语言的根本规律就出现了生物信息学,生物信息学为大数据“插上翅膀”,不仅给生命科学、农学、遗传学、细胞生物学和生物医学带来巨大的推动力且具有诱人的前景,它已经渗透到人类基因组研究的各个层面,如基因组、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、疾病潜在靶点基因预测以及系统发育分析的研究[12-13]

    腺苷酸激酶(AK)普遍存在于生物体,催化腺嘌呤核苷酸的相互转化:Mg2++ATP+AMP=Mg2++2ADP,在不同哺乳动物组织中已经鉴定出6种1型AK同工酶(AK1)[14],它们的主要功能是维持细胞的能量稳态,处理与细胞能量利用相关的代谢信号,并为核酸合成提供核苷酸[15-16]。AK1是一种小型胞质酶,在骨骼肌、红细胞和脑等高周转率细胞中表达,其活性依赖于Mg2+或Mn2+离子,在没有AK1的情况下腺嘌呤核苷酸大量减少[17]。鸡AK1基因约为6000碱基对,由7个外显子组成,Suminami等[18]在鸡AK1和牛线粒体腺苷酸激酶(AK2)之间的点阵图发现,AK1基因可能是通过缺失1个或多个外显子从AK2基因进化而来的。有研究表明鸡AK1的一级结构与猪AK1的一级结构有85%的相似性,因此,提出猪AK1的二级和三级结构[19]也将适用于鸡AK1,而且发现AK1外显子4相对应的区域与AK2A构象的相似性最高,已知该区域有助于ATP结合和催化功能[20]。本研究发现静原鸡AK1基因CDS区共编码194个氨基酸,理论等电点为8.68(>7),不稳定指数为21.56(<40),脂肪指数为85.88,推断该蛋白是碱性稳定蛋白[21],蛋白的稳定性会直接影响生物的生命活动和细胞周期,因此,AK1蛋白具有稳定的细胞周期和生命活动。AK1蛋白总体亲水性均值为−0.469(<0),说明该蛋白是可溶性蛋白。信号肽和跨膜结构域预测发现,AK1蛋白不存在信号肽和跨膜结构,说明该蛋白不是一个膜蛋白,不能通过膜受体来发挥作用,对其进行纯化可能较为简单。磷酸化位点分析发现AK1蛋白存在8个苏氨酸(Thr)磷酸化位点、7个丝氨酸(Ser)磷酸化位点和3个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,这些位点可以调节一些细胞的代谢和信号转导,该蛋白可能需要通过翻译后的磷酸化和去磷酸化影响细胞生长、分化以及基因表达[22],这与Carrasco等[11]发现AK1磷酸化可能是在质膜线粒体和KATP通道之间传递信号所必需的的研究结果一致。蛋白二三级结构预测发现AK1蛋白以α–螺旋和无规则卷曲为主,且二级结构为混合模型[23],因此可能通过影响蛋白质肽链中配体和受体结合的活性[24],进而影响蛋白的功能。赵骁等[25]等研究发现如果β–转角和无规则卷曲在蛋白中占比居多,则会出现抗原表位较多的现象,因此,AK1蛋白抗原表位预测发现其具有10个B细胞抗原表位。基因共表达分析发现,在原鸡中AK1AMPD1PKM2存在共表达,而AMPD1PKM2都是肌苷酸(Inosinc acid, IMP)从头合成途径的关键基因,因此AK1可能存在与AMPD1PKM2相似的功能,可将AK1基因作为与IMP相关的功能基因进行研究。CpG岛常位于基因转录调控区附近,静原鸡AK1基因存在2个CpG岛,这为后期AK1基因转录区CpG岛甲基化状态的研究十分重要。亚细胞定位发现AK1蛋白位于细胞质中,与基因进行GO细胞组分分析和Choo等[26]研究结果一致,由此推断该蛋白主要在细胞质中发挥生物学作用。

    综上,本研究通过生物信息分析对前期转录组筛选的静原鸡不同部位与IMP相关的关键差异基因AK1进行分析并通过分子生物学的方法构建其真核表达载体AK1-pEGFP-N1。

    静原鸡AK1基因CDS区全长585 bp,AK1蛋白含有194个氨基酸,是具有较强的亲水区域的非跨膜蛋白,AK1蛋白可能存在7个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,8个苏氨酸(Thr)磷酸化位点,3个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,并且具有10个B细胞抗原表位,2个CpG岛,预测其在细胞质中发挥作用,与AMPD1PKM2ADSL存在共表达,AK1蛋白二级结构和三级结构均以α–螺旋和无规则卷曲为主(相似性为86.39%)。

  • 图  1   土壤样本稀释曲线

    Figure  1.   Soil sample rarefaction curve

    图  2   生物炭不同施加量处理在门水平上对土壤细菌相对丰度的影响

    Figure  2.   Effects of different biochar application amounts on the relative abundance of soil bacteria at phylum level

    图  3   生物炭不同施加量处理在属水平上对土壤细菌相对丰度的影响

    Figure  3.   Effect of different biochar application amounts on the relative abundance of soil bacteria at the genus level

    图  4   土壤细菌群落结构的非度量多维尺度(NMDS)分析

    Figure  4.   Non-metric multi-dimensional scaling (NMDS) analysis of soil bacterial community structure

    图  5   门水平上的土壤细菌相对丰度聚类分析

    Figure  5.   Cluster analysis of relative abundance of soil bacteria at phylum level

    表  1   基于OTU的土壤细菌群落多样性指数1)

    Table  1   Diversity index of soil bacterial community based on OTU

    品种
    Variety
    处理
    Treatment
    香农指数
    Shannon index
    辛普森指数
    Simpson index
    Chao1指数
    Chao1 index
    ACE指数
    ACE index
    黄华占
    Huanghuazhan(Hua)
    CK 8.966±0.05abA 0.989±0.006aA 3480.75±517.08bA 3 563.55±537.94bA
    Tr1 9.706±0.45aA 0.995±0.002aA 4179.17±316.40aA 4 339.96±213.84aA
    Tr2 8.091±1.24bA 0.969±0.022aA 3490.21±836.31bB 3 586.29±830.62bA
    农香32
    Nongxiang32(N)
    CK 8.921±0.30aA 0.979±0.004aA 3866.23±347.77aA 3 951.35±380.68aA
    Tr1 9.348±0.04aA 0.984±0.006aA 4044.71±157.98aA 4128.83±192.08aA
    Tr2 8.671±0.19aA 0.984±0.006aA 3468.91±569.14aB 3538.57±588.43aA
    五常香稻
    Wuchangxiangdao(Wu)
    CK 8.683±0.14aA 0.979±0.005aA 3816.22±187.40aA 3946.03±228.30aA
    Tr1 9.253±0.66aA 0.987±0.007aA 4191.22±353.26aA 4300.22±318.69aA
    Tr2 8.521±0.70aA 0.986±0.005aA 3235.06±789.02aB 3334.52±839.40aA
    湘晚籼17
    Xiangwanxian 17(X)
    CK 8.424±1.89aA 0.976±0.026aA 3518.03±797.80aA 3655.60±744.40aA
    Tr1 9.023±0.35aA 0.979±0.005aA 4045.54±289.53aA 4121.37±284.28aA
    Tr2 8.931±0.64aA 0.983±0.004aA 3832.92±747.80aAB 3947.94±753.74aA
    象牙香占
    Xiangyaxiangzhan(Ya)
    CK 8.651±1.24aA 0.975±0.021aA 3561.74±695.16aA 3598.91±691.79aA
    Tr1 8.988±0.09aA 0.972±0.004aA 4074.37±52.38aA 4234.22±5.95aA
    Tr2 8.956±0.54aA 0.987±0.005aA 3696.07±627.56aAB 3787.12±622.64aA
    玉针香
    Yuzhenxiang(Yu)
    CK 6.708±1.00bB 0.919±0.047bB 3024.95±367.96bA 3169.58±292.43bA
    Tr1 8.682±0.14aA 0.980±0.001aA 3637.90±127.86abA 3735.90±125.70abA
    Tr2 8.738±0.73aA 0.984±0.005aA 4746.21±1530.11aA 4073.96±257.00aA
     1) 表中数据为平均值±标准差,n=3;同列数据后的不同小写字母表示同一水稻品种在不同生物炭施加量处理下差异显著;同列数据后的不同大写字母表示同一生物炭施加量处理下不同水稻品种间差异显著(P<0.05,Duncan’s法)
     1) Data are means±standard deviations, n=3; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences of the same variety among different biochar treatments, different capital letters in the same column indicate significant differences among different rice varieties under the same biochar treatment(P<0.05, Duncan’s test)
    下载: 导出CSV
  • [1]

    VAN ZWIETEN L, KIMBER S, MORRIS S, et al. Efects of bio-char from slow pyrolysis of papermill waste on agronomic performance and soil fertility[J]. Plant Soil, 2010, 327: 235-246. doi: 10.1007/s11104-009-0050-x

    [2] 王丽渊, 丁松爽, 刘国顺. 生物质炭土壤改良效应研究进展[J]. 中国土壤与肥料, 2014(3): 1-6.
    [3] 荣飞龙, 蔡正午, 覃莎莎, 等. 酸性稻田添加生物炭对水稻生长发育及产量的影响: 基于5年大田试验[J]. 生态学报, 2020, 40(13): 4413-4424.
    [4]

    KENNEDY A C, SMITH K L. Soil microbial diversity and the sustainability of agricultural soils[J]. Plant and Soil, 1995, 170(1): 75-86. doi: 10.1007/BF02183056

    [5] 南丽丽, 谭杰辉, 郭全恩. 黄土高原半干旱区轮作休耕模式对土壤真菌的影响[J]. 生态学报, 2020, 40(23): 8582-8592.
    [6]

    PURAKAYASTHA T J, DAS K C, GASKIN J, et al. Effect of pyrolysis temperatures on stability and priming effects of C3 and C4 biochars applied to two different soils[J]. Soil and Tillage Research, 2016, 155(4): 107-115.

    [7]

    AMELOOT N, GRABER E R, VERHEIJEN F G A, et al. Interactions between biochar stability and soil organisms: Review and research needs[J]. European Journal of Soil Science, 2013, 64(4): 379-390. doi: 10.1111/ejss.12064

    [8] 张秀, 夏运生, 尚艺婕, 等. 生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响[J]. 中国环境科学, 2017, 37(1): 252-262. doi: 10.3969/j.issn.1000-6923.2017.01.032
    [9]

    SHANG J Y, ZHOU S Y, WANG Z H, et al. Effects of rainfall on the total number of bacteria and the composition of culturable bacteria in Qinhuangdao West Beach[J]. Microbiology China, 2016, 43(6): 1227-1234.

    [10] 雷旭, 李冰, 李晓, 等. 复合垂直流人工湿地系统中不同植物根际微生物群落结构[J]. 生态学杂志, 2015, 34(5): 1373-1381.
    [11]

    MUHAMMAD N, DAI Z M, XIAO K C, et al. Changes in microbial community structure due to biochars generated from different feedstocks and their relationships with soil chemical properties[J]. Geoderma, 2014, 226/227: 270-278. doi: 10.1016/j.geoderma.2014.01.023

    [12]

    DOAN T T, BOUVIER C, BETTAREL Y, et al. Influence of buffalo manure, compost, vermicompost and biochar amendments on bacterial and viral communities in soil and adjacent aquatic systems[J]. Applied Soil Ecology, 2014, 73: 78-86.

    [13]

    STEINER C, TEIXEIRA W G, LEHMANN J, et al. Long term effects of manure, charcoal and mineral fertilization on crop production and fertility on a highly weathered central Amazonian upland soil[J]. Plant and Soil, 2007, 291: 275-290.

    [14] 朱金山, 张慧, 马连杰, 等. 不同沼灌年限稻田土壤微生物群落分析[J]. 环境科学, 2018, 39(5): 2400-2411.
    [15]

    DEMPSTER D N, GLEESON D B, SOLAIMAN Z M, et al. Decreased soil microbial biomass and nitrogen mineralisation with Eucalyptus biochar addition to a coarse textured soil[J]. Plant and Soil, 2012, 354: 311-324.

    [16] 常栋, 马文辉, 张凯, 等. 生物炭基肥对植烟土壤微生物功能多样性的影响[J]. 中国烟草学报, 2018, 24(6): 58-66.
    [17] 周凤, 耿增超, 许晨阳, 等. 生物炭用量对(土娄)土微生物量及碳源代谢活性的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2019, 25(8): 1277-1289. doi: 10.11674/zwyf.18276
    [18]

    LESAULNIER C, PAPAMICHAIL D, MCCORKLE O S, et al. Elevated atmospheric CO2 affects soil microbial diversity associated with trembling aspen[J]. Environmental Microbiology, 2008, 10(4): 926-941. doi: 10.1111/j.1462-2920.2007.01512.x

    [19]

    HOEFEL D, MONIS P T, GROOBY W L, et al. Profiling bacterial survival through a water treatment process and subsequent distribution system[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(1): 175-186.

    [20]

    ANSOLA G, ARROYO P, SÁENZ DE MIERA L E, et al. Characterisation of the soil bacterial community structure and composition of natural and constructed wetlands[J]. Science of the Total Environment, 2014, 473/474(1): 63-71.

    [21]

    CHAUDHRY V, REHMAN A, MISHRA A, et al. Changes in bacterial community structure of agricultural land due to long-term organic and chemical amendments[J]. Microbial Ecology, 2012, 64(2): 450-460. doi: 10.1007/s00248-012-0025-y

    [22] 宋宇, 王鹏, 韦月平. 不同稻田共作模式对土壤细菌群落结构的影响[J]. 西北农业学报, 2020, 29(2): 216-223. doi: 10.7606/j.issn.1004-1389.2020.02.007
    [23] 周佳, 周灵芝, 劳承英, 等. 短期不同耕作方式对水稻根际土壤细菌群落结构多样性的影响[J]. 南方农业学报, 2020, 51(10): 2401-2411. doi: 10.3969/j.issn.2095-1191.2020.10.011
    [24] 毛立晖. 野生稻内生细菌群落结构和多样性的研究[D]. 南昌: 南昌大学, 2018.
    [25] 唐涛涛. 不同类型秸秆厌氧共代谢降解污泥中多环芳烃的效能及机制研究[D]. 贵阳: 贵州大学, 2019.
    [26] 冯慧琳, 徐辰生, 何欢辉, 等. 生物炭对土壤酶活和细菌群落的影响及其作用机制[J]. 环境科学, 2021, 42(1): 422-432.
    [27] 朱孟涛, 刘秀霞, 王佳盟, 等. 生物质炭对水稻土团聚体微生物多样性的影响[J]. 生态学报, 2020, 40(5): 1505-1516.
    [28] 伏云珍, 马琨, 李倩, 等. 马铃薯| | 玉米间作对土壤细菌多样性的影响[J]. 中国生态农业学报(中英文), 2020, 28(11): 1715-1725.
  • 期刊类型引用(1)

    1. 赵薇,曹国伟,周子航,王卫振,辛国省,蔡正云,顾亚玲,张娟. 鸡肉品质相关调控基因研究进展. 农业生物技术学报. 2022(02): 370-378 . 百度学术

    其他类型引用(1)

图(5)  /  表(1)
计量
  • 文章访问数:  207
  • HTML全文浏览量:  10
  • PDF下载量:  316
  • 被引次数: 2
出版历程
  • 收稿日期:  2021-08-16
  • 网络出版日期:  2023-05-17
  • 刊出日期:  2022-05-09

目录

/

返回文章
返回