Construction of reverse genetic platform of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain JXA1
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摘要:目的
为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。
方法运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上，并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入FseI酶切位点，作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救，并对拯救的病毒进行生物学特性分析。
结果构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性；成功拯救了病毒，命名为rJXA1；成功引入了拯救病毒的遗传标记；拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似，二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。
结论成功构建了JXA1株反向遗传平台，为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。
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关键词:
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒 /
- JXA1 /
- 反向遗传技术 /
- 感染性克隆 /
- 病毒拯救
Abstract:ObjectiveTo provide a basis for studying the structural function and pathogenic mechanism of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).
MethodFragments of the whole genome of HP-PRRSV JXA1 strain were cloned into the modified low copy vector pOKq with reverse genetics technique. The CMV promoter and BGH termination signal peptide were added into the terminals of the viral genome. The FseI restriction site, as a genetic marker locus, was introduced at the 510th nucleotide of the whole genome of the virus by mutation. DNA-launched approach was used for viral rescue and the biological properties of rescued viruses were analyzed.
ResultThe full-length cDNA clone of the constructed PRRSV JXA1 strain was infectious. The virus was successfully rescued and named rJXA1. The genetic marker was successfully introduced into the rescued virus. The rescued virus and parental virus had similar growth curves with reaching the maximum titer at 72 h after infection.
ConclusionThe reverse genetic platform of the JXA1 strain has been successfully constructed, which will lay a foundation for further research on the pathogenesis, gene function and vaccine development of PRRSV.
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疏浚土是指河流、湖泊、港口航道等疏浚工程中产生的固体废弃物，是由沉积在水体底部的泥沙、各种矿物和有机质等通过长期的生物、化学、物理的共同作用而形成的混合物[1]。截至2019年，全球每年疏浚土产量超6亿m3，但回收利用不足1%，如何合理处置疏浚土成为了一个全球性的环境问题[2]。我国每年因港口、航道建设等人为活动及地理因素等原因产生的疏浚土体量庞大，若处理不当，不仅会浪费大量土地资源，也会对生态环境造成严重的负担[3-4]。科学、合理地处置疏浚土，对减少处置过程中可能造成的二次污染意义重大。研究表明，经过合理处置后的疏浚土能应用于建筑、岸滩养护、土地利用、吹填造陆等领域[5-8]。然而新近吹填的疏浚土以细颗粒为主，黏粒和粉粒含量高，成分中含有较多保水性强的矿物成分，导致其含水量高，透气透水性较差，直接制约了其资源化利用，在最终处置前需先进行脱水减量化处理以达到减容、脱水目的[9]。对于排泥区的疏浚土，如何有效降低疏浚土的含水量、缩短疏浚土沉降固结时间，是科学处理疏浚土、提高疏浚土资源化利用率的关键问题。
植物根系可从疏浚土中吸收水分，所吸收的水分90%以上会被自身的蒸腾作用所释放，再加上土壤的蒸发作用，疏浚土的含水量会随时间的推移而逐渐减少，从而达到“排水”效果[10-11]。排泥区内新近吹填的疏浚土淤泥表层承载力几乎为零，无法承载人机设备，也难以进行土地利用，与完全靠晾晒蒸发水分相比，在其表层种植植物能够加快其水分消耗，对疏浚土起到固结作用。研究表明，速生植物能够较快速地促进浅表层疏浚土(尤其是30~90 cm深度范围)的失水，进而加速疏浚土的固化，此外，部分植物还能够达到吸收疏浚土内的重金属、改良疏浚土养分含量等效果，利用特定的植物对疏浚土进行生态固化是可行的[12]。
皇竹草Pennisetum hydridum为多年生优质牧草，具有单株生物量大、速生、抗逆性强、高产等特性，广泛应用于畜禽饲料生产、生态治理、清洁能源等领域[13-14]。种植皇竹草能够加快疏浚土浅表层的失水速度，达到固化浅表层疏浚土的作用，同时，皇竹草的根系还能与土体结合起到加筋作用，增加疏浚土的承载力，具有减水、加固的效果[12，15]。然而，在什么样的含水量条件下最有利于皇竹草的生长和水分蒸腾，进而有利于疏浚土的生态固结，以往研究鲜见报道。本研究立足于疏浚土利用现状，以皇竹草为种植材料，通过盆栽试验研究疏浚土不同含水量条件下皇竹草的蒸腾耗水、生长、生理特性以及养分吸收情况的动态变化规律，为我国疏浚土生态固化及其资源化利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地位于广州市华南农业大学温室大棚(23°9′20″N，113°21′13″E)，属海洋性亚热带季风气候，全年水热同期，光热充足，试验年份(2021)年均温24 ℃，年降雨量1435.5 mm，年日照1879.0 h。
1.2 供试材料
供试疏浚土取自引江济淮工程(安徽段)江淮沟通段J011-1(瓦埠湖湖区航道)排泥区(32°19′51″N ，116°54′39″E)20~60 cm土层，风干土样后，过1 cm网筛备用。该疏浚土含水量较高；土样的重金属铜(Cu)、锌(Zn)、铅(Pb)、镉(Cd)、镍(Ni)质量分数分别为：20.22、48.57、20.43、0.17 和24.21 mg·kg−1，均符合《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB15618—2018)[16]的要求。疏浚土基本理化性质为：pH7.94、塑性指数20.2、容重1.32 g·cm−3、含水量270.64 g·kg−1、有机质1.54 g·kg−1、碱解氮24.43 mg·kg−1、速效磷9.16 mg·kg−1、速效钾74.02 mg·kg−1。
供试植物选用皇竹草(增润农业有限公司提供)，取长势相近的单茎杆节段在装有疏浚土的育苗袋内进行扦插培育，至其完全展开第3片成熟叶片(约20 d)后，选取长势相近的植株移栽至塑料栽植盆。每盆移栽1株皇竹草，盆内装5 kg(干质量)过筛后的疏浚土，取略大于盆口的锡箔纸平展铺于盆内土壤之上，边缘与盆壁粘合固定，以此防止土壤水分蒸发，盆底放置托盘。
1.3 试验设计
采用称重法测量土壤含水量，设置4个土壤含水量(w)处理：20%(T1)、30%(T2)、40%(T3)、50%(T4)，每个处理5次重复，试验开始时间为2021年8月，为期120 d。每2天以称重法补水，除水分处理差异外其余管护条件一致。
1.4 相关指标测定
1.4.1 土壤理化性质测定
疏浚土理化性质测定参照《土壤农化分析》[17]。其中，土壤容重、孔隙度和毛管持水量测定采用环刀法；土壤自然含水量测定采用烘干法；土壤pH测定采用pH计法(水土质量比为2.5︰1.0)；土壤有机质经石墨消解加热后采用铬酸钾容量法测定；全氮经浓硫酸消煮后采用凯氏定氮仪测定；全磷经NaOH熔融后采用钼锑抗比色法测定；全钾经NaOH熔融后采用火焰分光光度计法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；速效磷经HCl及H2SO4溶液浸提后，采用钼锑抗比色法测定；速效钾经CH3COONH4溶液浸提后，用火焰分光光度计法测定。
1.4.2 植物指标测定
植物相关指标的测定主要参照《现代植物生理学》[18]。植物株高采用卷尺测量。每30天择晴朗天气用LI-6400光合分析仪测定各处理植物顶部新展叶片的净光合速率(Net photosynthetic rate，Pn)、气孔导度(Stomatal conduction，Gs)、胞间CO2浓度(Intercellular CO2 concentration， Ci)和蒸腾速率(Transpiration rate，Tr)等指标，每株植物测5片叶，每个指标读取3次数据，取均值作为测定值；耗水量测定采用盆栽称重法，控水试验开始后，每个土壤含水量处理选择3盆作为观测对象(即每个处理3个重复)，每个月初连续4 d于早上08:00进行称质量并记录。
试验进行120 d后收苗。收苗时将整株植株挖出带回实验室，选取适量新鲜叶片和根系，经磷酸缓冲液冷冻研磨后，于4 ℃、12000 r/min条件下离心提取粗酶液，其中，可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量采用考马斯亮蓝染色法测定；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，EC1.15.1.1)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定；过氧化物酶(Peroxydase，POD，EC1.11.1.7)活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶(Catalase CAT，EC1.11.1.60)采用紫外吸收法测定。其余样品先用自来水洗净根部，再用去离子水冲洗，晾干后将植株的地上部及根部分别装入信封、编号，置于烘箱内105 ℃杀青30 min后，70 ℃烘至恒质量，用电子天平分别测得各部位干质量。植物各部位干样经浓硫酸–过氧化氢消煮获得待测液，全氮(TN)含量采用奈氏比色法测定；全磷(TP)含量采用钼锑抗比色法测定；全钾(TK)含量采用火焰分光光度计法测定。
1.5 数据处理
采用以下公式对相关指标进行计算：
$$ 根冠比=根部干质量/地上部干质量， $$ (1) $$ \begin{split} &氮(磷/钾)吸收量({\rm{mg}} \cdot 株^{-1})=\\ &\quad\quad 氮(磷/钾)含量 \times 植物干质量， \end{split} $$ (2) $$ \begin{split} &耗水速率({\rm{g}}\cdot {\rm{m}}^{-2}\cdot {\rm{h}}^{-1})=\\ &\quad \quad 耗水量/(单株叶面积 \times 时间)。 \end{split} $$ (3) 利用极差法对各指标数值进行标准化，标准化公式为：
$$ X=\left(x-x_{\min }\right) /\left(x_{\max }-x_{\min }\right)， $$ (4) 式中，X为标准化后的数据，x为指标的原始数据，xmin和xmax分别为指标原始数据的最小值和最大值。每个处理的指标值与各主成分中对应的特征值的平方根相乘，逐一累加各指标得分，再分别与对应权重相乘，求和得到总得分。得分高低反映不同处理效果的优劣，得分高表示处理效果良好，反之则较差。
运用Excel 2016进行数据录入及整理，运用Origin 2022软件进行绘图，运用SPSS 27.0软件进行数据统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比较对相关指标进行差异显著性检验(α=0.05)；利用主成分分析法对疏浚土不同含水量对皇竹草的生长、生理情况的影响进行综合评价。图表中数据均为平均值±标准误差(n=3)。
2. 结果与分析
2.1 皇竹草生长和养分含量
2.1.1 生长状况
皇竹草在疏浚土不同含水量下均有一定程度的生长。如图1所示，种植120 d后，皇竹草的株高、叶片数、叶面积、地上部和地下部干质量均随疏浚土含水量增加呈现出先升后降的趋势，根冠比则呈现出相反的趋势，其中，T2处理下皇竹草的株高、叶片数、叶面积、地上部干质量和地下部干质量均为最大值，且株高、叶面积和地上部干质量均显著高于其余处理(P<0.05)，而根冠比则最小，显著小于其余处理(P<0.05)；T1、T3、T4这3个处理之间的株高、叶片数、地上部和地下部干质量无显著差异(P>0.05)。
![图 1 疏浚土不同含水量对皇竹草生长状况的影响]()
图 1 疏浚土不同含水量对皇竹草生长状况的影响各图中，同一指标柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 1. Effects of different dredged soil water contents on the growth status of Pennisetum hydridumIn each figure, different lowercase letters on the bars of the same index indicated significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.1.2 养分吸收量
皇竹草地上部和地下部的N、P、K吸收量与单株的N、P、K吸收量变化趋势相同，均随疏浚土含水量的增加呈先升后降趋势，均在T2处理达到最大值并显著高于其他处理(图2)，单株N、P和K吸收量的最大值分别为2460.45、503.09和7158.2 mg，分别是4个处理中最小值的2.75 (T4)、3.21 (T4)和2.37(T1)倍。
![图 2 疏浚土不同含水量对皇竹草养分元素吸收量的影响]()
图 2 疏浚土不同含水量对皇竹草养分元素吸收量的影响各图中，同一指标柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 2. Effects of different dredged soil water contents on nutrient uptake of Pennisetum hydridumIn each figure, different lowercase letters on the bars of the same index indicated significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.2 皇竹草蒸腾耗水和叶片光合特性
2.2.1 蒸腾耗水量
疏浚土不同含水量处理下，皇竹草日耗水量整体上随生长时间的增加而增加；耗水速率随含水量梯度增加呈先升后降趋势(图3)。在试验周期内，T1处理的皇竹草日耗水量显著低于其他处理(P<0.05)。在11月，T2处理每盆皇竹草的日耗水量为376 g，显著大于其他处理(P<0.05)，分别是T1、T3、T4处理的2.43、1.43、1.68倍。根据计算，T2处理的耗水速率最大，为74.92 g·m−2·h−1。
![图 3 疏浚土不同含水量对皇竹草耗水量和耗水速率的影响]()
图 3 疏浚土不同含水量对皇竹草耗水量和耗水速率的影响各折线上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 3. Effects of different dredged soil water contents on water consumption and water consumption rate of Pennisetum hydridumDifferent lowercase letters on each line indicated significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.2.2 叶片光合特性
如图4所示，随着时间推移，T1处理的皇竹草叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)均呈现下降趋势；T2处理的叶片Pn和Tr均逐渐上升，Gs先升后降，Ci逐渐下降；T3处理的叶片Pn、Gs和Tr均呈先升后降趋势，Ci呈上升趋势；T4处理的叶片Pn逐渐下降，Gs、Tr和Ci基本呈先升后降趋势。随着皇竹草的生长，T2处理的光合特性指标的优势逐渐突显，其叶片Pn，Gs、Ci在8、9月份均是4个处理中的最大值，到11月份收苗时依然保持优势，其叶片Pn、Gs和Tr均最大并显著大于其他处理，分别为25.47 μmol·m−2·s−1、0.17 mol·m−2·s−1和2.71 mmol·m−2·s−1；而叶片Ci到10月份后T3处理逐渐超过T2处理成为4个处理的最大值(245.42 mmol·mol−1)，显著大于其他处理(P<0.05)。
![图 4 疏浚土不同含水量对皇竹草光合特性的影响]()
图 4 疏浚土不同含水量对皇竹草光合特性的影响各图中，相同月份柱子上方的的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 4. Effects of different dredged soil water contents on photosynthetic characteristics of Pennisetum hydridumIn each figure, different lowercase letters on the bars of the same month indicated significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.3 皇竹草生理特性
随着疏浚土含水量的增加，皇竹草叶片和根系的SP含量均呈现出先升后降的趋势，叶片和根系POD活性、叶片CAT活性的趋势与之相反，叶片和根系的SOD活性、根系CAT活性则呈现出先降后升再降的趋势，叶片和根系SP含量的最大值、叶片SOD活性的最小值、叶片和根系POD及CAT活性的最小值均出现在T2处理(图5)。各处理中，T2的皇竹草叶片SP含量最大(20.25 mg·g−1)，显著大于其他3个处理(P<0.05)，其叶片SOD活性最小(299.57 U·g−1)，显著小于其他3个处理(P<0.05)；T4处理的叶片POD活性和CAT活性最大，分别为251.27 U·g−1·min−1和222.28 U·g−1·min−1，均显著(或不显著)大于其他3个处理。T2处理的皇竹草根系SP含量(20.29 mg·g−1)显著大于其他处理(P<0.05)，分别是T1、T3和T4处理的1.96、1.79和1.91倍；T4处理根系SOD活性(111.88 U·g−1)显著小于其他处理(P<0.05)；根系POD活性和CAT活性的最小值均出现在T2处理，分别为45.59和54.10 U·g−1·min−1。
![图 5 疏浚土不同含水量对皇竹草叶片和根系生理的影响]()
图 5 疏浚土不同含水量对皇竹草叶片和根系生理的影响各图中，相同部位柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 5. Effects of different dredged soil water contents on leaf and root physiology of Pennisetum hydridumIn each figure, different lowercase letters on the bars of the same plant part indicated significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.4 疏浚土含水量对皇竹草生长和生理影响的综合评价
基于耗水量、耗水速率、净光合速率、气孔导度等26个指标，通过主成分分析法综合评价疏浚土含水量对这些指标的影响。由表1可知，前3个主成分的特征值均大于1，分别为18.33、2.96和1.73，贡献率分别为70.51%、11.37%和6.63%，总贡献率为88.51%，可见，由前3个主成分的指标解释含水量对皇竹草生长、生理等指标的不同影响是可靠的。其中，主成分1、2和3对应的较大特征向量指标分别为生长特性、光合特性和生理指标。
表 1 主成分分析成分矩阵Table 1. Matrix of principal component analysis component指标
Index主成分 Principal component 1 2 3 耗水量 Water consumption 0.942 0.240 0.199 耗水速率 Water consumption rate 0.535 0.554 0.411 净光合速率 Net photosynthetic rate 0.941 0.239 0.064 气孔导度 Stomatal conduction 0.878 0.288 0.258 胞间CO2浓度 Intercellular CO2 concentration 0.369 0.648 0.629 蒸腾速率 Transpiration rate 0.955 0.202 −0.051 根系可溶性蛋白含量 Root soluble protein content 0.955 0.008 −0.119 根系超氧化物歧化酶活性 Root superoxide dismutase activity 0.022 −0.910 0.257 根系过氧化物酶活性 Root peroxidase activity −0.589 0.419 −0.220 根系过氧化氢酶活性 Root catalase activity −0.910 −0.031 0.306 叶片可溶性蛋白含量 Leaf soluble protein content 0.968 −0.176 −0.121 叶片超氧化物歧化酶活性 Leaf superoxide dismutase activity −0.869 −0.193 0.125 叶片过氧化物酶活性 Leaf peroxidase activity −0.635 0.526 −0.422 叶片过氧化氢酶活性 Leaf catalase activity −0.817 0.360 0.015 株高 Plant height 0.914 −0.098 0.014 叶片数 Number of blade 0.329 −0.507 −0.043 叶面积 Leaf area 0.969 0.119 0.109 地上部干质量 Aboveground dry mass 0.979 −0.003 −0.151 地下部干质量 Underground dry mass 0.949 −0.182 0.128 根冠比 Root shoot ratio −0.579 −0.354 0.634 地上部N吸收量 Aboveground N uptake 0.960 −0.037 −0.196 地上部P吸收量 Aboveground P uptake 0.972 −0.077 −0.157 地上部K吸收量 Aboveground K uptake 0.965 0.008 −0.198 地下部N吸收量 Underground N uptake 0.937 −0.232 −0.059 地下部P吸收量 Underground P uptake 0.969 −0.042 0.002 地下部K吸收量 Underground K uptake 0.956 −0.099 0.236 特征值 Eigenvalue 18.33 2.96 1.73 贡献率/% Contribution rate 70.51 11.37 6.63 累积贡献率/% Cumulative contribution rate 70.51 81.88 88.51 对3个主成分进行加权平均以求得不同处理的综合评价得分，计算结果显示，T1、T2、T3和T4 处理综合得分分别为−2.61、4.81、−0.42、−1.79，从而得知不同疏浚土含水量对皇竹草的生长、生理等影响效果的排序为：T2 >T3 >T4 >T1(表2)。
表 2 主成分分析综合得分Table 2. Composite score of principal component analysis处理
Treatment主成分得分 Principal component score 综合得分
Comprehensive score排序
Sort1 2 3 T1 −3.26 −2.11 −1.03 −2.61 4 T2 6.86 −0.01 −0.39 4.81 1 T3 −0.73 −0.3 2.02 −0.42 2 T4 −2.86 2.41 −0.59 −1.79 3 3. 讨论与结论
3.1 皇竹草生长对疏浚土含水量的响应
水是植物生命循环的物质基础，土壤水分含量直接影响植物的长势和营养繁殖能力[19]。干旱胁迫会造成植物蒸腾速率下降，抑制其光合作用，造成细胞结构受损，影响植物的正常生长；水淹胁迫会对植物产生低氧胁迫，降低其水分输送效率，造成植物的生理性干旱[20-21]。植物的株高、叶片数量、叶面积、单株干质量、养分吸收量等指标是植物生长状况的基本特征，能较好地衡量植物的物质积累和长势情况，是评价植物抗胁迫能力的可靠标准[22-24]。本试验中，随着疏浚土含水量的增大，皇竹草的生长指标呈现出先升后降的趋势，其株高、叶片数、叶面积、单株干质量和养分吸收量的最大值均出现在T2处理，这在一定程度上说明皇竹草在T1、T3、T4处理的疏浚土中受到的水分胁迫较T2更大，使其生长受到抑制，且其抑制程度随胁迫程度的升高而加剧。这可能是因为干旱胁迫(T1)损害了植物的光合器官并改变了叶片结构，植物的光合作用能力降低，植物会减少对茎叶的生物量分配，其体内积累的养分含量也随之减少，进而对其生长产生了负面影响[25-26]。此外，当植物处于水淹胁迫(T3、T4)时，氧气供应不足会使根系产生乳酸，引起细胞失活，进而阻碍根系内部矿质营养的运输，造成植物养分吸收量的减少[27]。
3.2 皇竹草蒸腾耗水和叶片光合特性对疏浚土含水量的响应
蒸腾作用是植物水分的主要耗散途径，植物的耗水特性受其周围环境条件及自身生理状况共同影响，耗水量和耗水速率作为植物内部的水分生理指标能够较好地反映出植物的耗水能力[11, 28-29]。植物耗水量是植物水分散失的表征指标，是植物适应环境水分变化的重要评价指标。但即便是同一植物，耗水量也会因苗龄、叶片生物量、叶面积等的不同而出现差异，仅用耗水量这一指标不足以代表植物的耗水能力。耗水速率是植物单位时间内的耗水量与叶片单位面积的比值，是衡量植物耗水能力的重要指标[30]。研究表明，植物处于不同土壤含水量时，其耗水量和耗水速率在一定程度上随水分胁迫程度的增加而减少[31-32]。植物能够通过自身的代谢活动来维持体内的水分平衡以缓解水分胁迫造成的伤害。本试验中，在不同疏浚土含水量条件下，皇竹草日耗水量整体上随生长时间的增加而增加，随疏浚土含水量的增加先增后降；耗水速率也随疏浚土含水量梯度增加呈先升后降趋势，这是因为土壤含水量过多或过少会对植物产生水淹胁迫或干旱胁迫，受到干旱胁迫时，植物会通过选择性地关闭叶片气孔、蜷缩叶片等方式减弱蒸腾，减少水分的散失，降低植物体的耗水量和耗水速率；在遭受水淹胁迫初期，植物能够通过加强自身蒸腾作用来增加叶片水分散失量以减轻胁迫危害，但当水淹胁迫达到一定程度后，植物体难以通过自身代谢平衡好体内水分，其生长受到抑制，进而造成耗水量和耗水速率的下降[33-34] ，这与苹果Malus pumila–大豆Glycine max间作系统、葡萄Vitis vinifera、小麦Triticum aestivum在不同土壤水分条件下的表现一致[35-37] 。
光合作用是衡量植物对环境胁迫响应的常用指标[38]。水是参与光合作用的重要物质，皇竹草土壤中含水量的梯度能够显著调节皇竹草叶片的光合作用效率，进而影响植物体的自养呼吸[39-40]。本试验中，随着疏浚土含水量的增加，皇竹草的Pn、Gs和Tr整体上均有所增大，在T2处理达到峰值后逐渐下降，这是因为随着疏浚土含水量的增加，植物受到的水分胁迫加剧，植物体通过关闭气孔抑制CO2的流通，进而影响了Ci和Tr，降低了Pn，使得植物体的光合作用能力下降[41]。在T1处理下，皇竹草的Pn、Gs、Ci、Tr均随着生长时间的增加而下降，这是因为轻度干旱胁迫时植物体通过降低气孔导度应对胁迫，进而造成Pn、Ci、Tr的降低，这与Zhang等[42]对黄柏Phellodendron chinense在干旱胁迫下的光合作用表现一致。在T3、T4处理下，皇竹草的Pn、Gs、Tr在生长初期逐渐上升，而在生长后期逐渐下降并趋于平稳，这是由于前期植物刚受到水分胁迫时以提升Pn和Ci来加强耗水缓解胁迫，随着胁迫的延续，其叶片气孔关闭，CO2消耗受阻，Ci上升，Tr下降，这与张蓉等[43]通过灌浆处理对生育期前后冬小麦光合速率的影响的研究结果一致。
3.3 皇竹草叶片和根系生理特征对疏浚土含水量的响应
可溶性蛋白是维持细胞基本结构和功能、保护酶活性的渗透调节物质，是衡量植物抗性的指标之一[44]。植物受到水分胁迫后能够通过产生更多的蛋白质或将细胞内部分不溶性蛋白转变为可溶性蛋白来缓解胁迫危害[45]。本试验中，皇竹草叶片和根系的可溶性蛋白含量均随疏浚土含水量的增加而先增后减，这可能是由于皇竹草在疏浚土含水量T1处理时受到轻度干旱胁迫，在疏浚土含水量T3、T4处理时逐渐受到水淹胁迫，植株通过提高蛋白酶活性来加快蛋白水解、减少蛋白质合成，从而维持细胞渗透势，造成可溶性蛋白含量减少[46]。在水分胁迫下，植物体内会产生过量的活性氧和自由基，这会造成膜脂过氧化，随着植物的生长，植物细胞能够通过提高SOD、POD、CAT等的活性来清除过量的活性氧和自由基，进而增强植物在水分胁迫下的抗性[47]。本试验中，随着疏浚土含水量的增加，皇竹草叶片和根系的SOD、POD、CAT活性大体上呈现出先降后升的趋势，与SP含量的趋势相反，这可能是因为与T2处理相比，皇竹草在T1、T3、T4处理时受到的胁迫更大，进而诱导植物提高SOD、POD、CAT的活性以缓解水分胁迫对植物的伤害，这与长春花Catharanthus roseus [48]、菠菜Spinacia oleracea [49]在不同水分条件下过氧化酶的活性表现一致。
3.4 基于主成分分析综合评价疏浚土含水量对皇竹草的影响
在不同土壤含水量下，植物对不同水分条件的适应能力受多种因素的综合影响，仅通过单一指标来评价植物的抗性具有片面性[50]。本试验运用主成分分析方法考察皇竹草26个生长指标之间的相关性，利用线性变化将多个变量整合，提取出包括整体信息的几个且独立的新变量进行综合评价[51]。由主成分分析结果可知，综合得分最高的是T2处理，这说明皇竹草在30%(w)土壤含水量的条件下适应能力最强，其蒸腾耗水和生长发育表现最好。在排泥区疏浚土的含水量为20%~50%(w)时均可考虑选用皇竹草作为栽植植物，在含水量为30%(w)时皇竹草的栽植效果最佳，其蒸腾耗水及生长适应能力发挥最好，可将其作为排泥区疏浚土指示植物。
3.5 结论
1)皇竹草在4种疏浚土含水量条件下均能生长并进行养分吸收，在30%(w)的疏浚土含水量条件下其生长及养分吸收效果最好。
2)在不同含水量处理中，日耗水量均随皇竹草生长而增加。在30%(w)疏浚土含水量时，皇竹草蒸腾耗水量最大，叶片光合特性最佳。
3)在各处理中，30%(w)含水量处理的皇竹草叶片和根系可溶性蛋白含量最大，过氧化物酶和过氧化氢酶活性最小，叶片及根系生理性能表现最优。
4)主成分分析结果表明，不同疏浚土含水量(w)对皇竹草生长和生理等综合效应排序为：30%>40%>50%>20%，表明疏浚土含水量为30%(w)时，最有利于皇竹草生长和蒸腾耗水。
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图 1 JXA1毒株全长cDNA克隆的构建策略
Figure 1. The strategy for construction of the full-length cDNA clone of JXA1 strain
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图 2 JXA1株各基因片段的PCR扩增与构建
M1：DL2000 DNA marker；M2：DL5000 DNA marker；M3：DL10000 DNA marker；1：CMV片段；2：BGH片段；3：A1片段；4：B片段；5：C片段；6:A3片段；7：A3片段酶切产物；8：D1片段；9：D1和BGH融合片段；10：A2片段；11~12：CMV、A1和A2融合片段；13：pOK-CMV-A1-A2的酶切产物；14~18：菌液PCR鉴定；N：阴性对照
Figure 2. PCR amplification and construction of each gene fragment of JXA1 strain
M1: DL2000 DNA marker; M2: DL5000 DNA marker；M3：DL10000 DNA marker; 1: CMV fragment; 2: BGH fragment; 3 A1 fragment; 4: B fragment; 5: C fragment; 6: A3 fragment; 7: Enzyme digestion of A3 fragment; 8: D1 fragment; 9: D1 and BGH fusion fragment; 10: A2 fragment; 11−12: CMV, A1 and A2 fusion fragment; 13: Enzyme digestion of pOK-CMV-A1-A2; 14−18: PCR identification of the bacterial liquid; N: Negative control
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图 3 pOK-JXA1菌液PCR鉴定
M：250 bp DNA ladder (Dye plus)；1~8：pOK-JXA1菌液PCR扩增产物；N：阴性对照
Figure 3. PCR identification of pOK-JXA1 bacterial liquid
M: 250 bp DNA ladder (Dye plus); 1−8: PCR amplification of pOK-JXA1 bacterial liquid; N: Negative control
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图 4 拯救病毒产生的细胞病变
A：拯救病毒rJXA1产生的CPE；B：亲本病毒JXA1产生的CPE；C：对照细胞
Figure 4. Cytopathic effect (CPE) produced in the rescued viruses
A: CPE produced in the rescued virus rJXA1; B: CPE produced in the parental virus JXA1; C: Control cell
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图 5 拯救病毒的遗传标记位点RT-PCR鉴定
M：250 bp DNA ladder (Dye plus)；1~3：rJXA1-P3的3个重复的扩增产物；N：阴性对照
Figure 5. Identification of genetic marker of the rescued virus by RT-PCR
M: 250 bp DNA ladder (Dye plus); 1−3: Amplification products of three replicates of rJXA1-P3; N: Negative control
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图 6 拯救病毒的间接免疫荧光鉴定
A：亲本病毒；B：拯救病毒；C：空白对照
Figure 6. Identification of the rescued virus through indirect immunofluoresence assay
A: Parental virus; B: Rescued virus; C:Blank control
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图 7 rJXA1在Marc-145细胞中引起的细胞病变
A：第1代；B：第3代；C：第6代；D：第9代；E：第12代；F：空白对照
Figure 7. Cytopathic effect (CPE) induced by rJXA1 in Marc-145 cells
A: The first generation; B: The third generation; C: The sixth generation; D: The ninth generation; E: The 12th generation; F: Blank control
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图 8 拯救病毒和亲本病毒的生长曲线
Figure 8. The growth curves of the rescued virus and parental virus.
表 1 构建JXA1株全长感染性克隆设计的引物序列
Table 1 Primer sequences used for construction of the full-length infectious clone of JXA1 strain
引物名称 Primer name 引物序列(5′→3′)1) Primer sequence 产物长度/bp Product length CMV-F AGTC GCGGCCGCCGATGTACGGGCCAGATATAC 757 CMV-R ATAGAGCCAACACCTATACGTCA A1-F TGACGTATAGGTGTTGGCTCTAT 528 A1-R TAGGGGTGAGTTGGCCGGCCCTGTA A2-F ATCTACAGGGCCGGCCAACTCAC 2 193 A2-R CGGCGGTGTCTCGAGAATCATCT A3-F CAAAGATGATTCTCGAGACACC 3 096 A3-R AAGGCATAGGTGCTTAAGT B-F CATCCGTTACAGGTGGTAATG 2 951 B-R AGCACAGCTGTCCATGAGTATTGC C-F GAAGACAACCATCACAGACTCAC 2 713 C-R AAACCTCATGCTGGTGGCATT D1-F AGGACTGGGAGGATTACAATGAT 3 341 D1-R GTGCCAAAGAATGCCAGCCCATCATG BGH-F CATGATGGGCTGGCATTCTTTGGCAC 533 BGH-R GGGATCGA GGTACCCAGAAGC 1)下划线部分为酶切位点
1) The underlined portion is the restricted enzyme digestion site
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[1] NEUMANN E J, KLIEBENSTEIN J B, JOHNSON C D, et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J]. J Am Vet Med Assoc, 2005, 227(3): 385-392. doi: 10.2460/javma.2005.227.385
[2] LI B, LIU R F, LIU S Y, et al. The genomic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from 1996 to 2009[J]. Vet Microbiol, 2010, 146(3/4): 226-237.
[3] 童光志, 周艳君, 郝晓芳, 等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]. 中国预防兽医学报, 2007, 25(5): 323-327. doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2007.05.001 [4] ALBINA E. Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): An overview[J]. Vet Microbiol, 1997, 55(1/2/3/4): 309-316.
[5] TIAN K G, YU X L, ZHAO T Z, et al. Emergence of fatal PRRSV variants: Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J]. PLoS One, 2007, 2(6): e526. doi: 10.1371/journal.pone.0000526
[6] ZHAO K, YE C, CHANG X B, et al. Importation and recombination are responsible for the latest emergence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J]. J Virol, 2015, 89(20): 10712-10716. doi: 10.1128/JVI.01446-15
[7] Li Y F, WANG X L, BO K T, et al. Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the mid-eastern region of China[J]. Vet J, 2007, 174(3): 577-584. doi: 10.1016/j.tvjl.2007.07.032
[8] ZHOU Z, LI X D, LIU Q, et al. Complete genome sequence of two novel Chinese virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus variants[J]. J Virol, 2012, 86(11): 6373-6374. doi: 10.1128/JVI.00663-12
[9] ZHAO K, GAO J C, XIONG J Y, et al. Two residues in NSP9 contribute to the enhanced replication and pathogenicity of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. J Virol, 2018, 92(7): e02209-17.
[10] TRUONG H M, LU Z, KUTISH G F, et al. A highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus generated from an infectious cDNA clone retains the in vivo virulence and transmissibility properties of the parental virus[J]. Virology, 2004, 325(2): 308-319. doi: 10.1016/j.virol.2004.04.046
[11] 吴欣伟, 熊永忠, 秦宏阳, 等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株感染性克隆的构建[J]. 中国预防兽医学报, 2011, 33(2): 97-100. doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2011.02.04 [12] HUANG Y W, FANG Y, MENG X J. Identification and characterization of a porcine monocytic cell line supporting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) replication and progeny virion production by using an improved DNA-launched PRRSV reverse genetics system[J]. Virus Res, 2009, 145(1): 1-8. doi: 10.1016/j.virusres.2009.05.013
[13] 常亚飞, 刘永刚, 李爱东, 等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4传代致弱株HuN4-F30感染性克隆的构建及拯救病毒致病性分析[J]. 中国预防兽医学报, 2016, 38(7): 532-536. [14] LEE C, CALVERT J G, WELCH S K, et al. A DNA-launched reverse genetics system for porcine reproductive and respiratory syndrome virus reveals that homodimerization of the nucleocapsid protein is essential for virus infectivity[J]. Virology, 2005, 331(1): 47-62. doi: 10.1016/j.virol.2004.10.026
[15] RENUKARADHYA G J, MENG X J, CALVERT J G, et al. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction[J]. Vaccine, 2015, 33(33): 4069-4080. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.06.092
[16] SUHARDIMAN M, KRAMYU J, NARKPUK J, et al. Generation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by in vitro assembly of viral genomic cDNA fragments[J]. Virus Res, 2015, 195: 1-8. doi: 10.1016/j.virusres.2014.09.008
[17] 翟新验, 韩焘, 周智. 反向遗传学在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用[J]. 中国兽医杂志, 2014, 50(4): 52-53. doi: 10.3969/j.issn.0529-6005.2014.04.021 [18] ZHOU L, KANG R M, JI G S, et al. Molecular characterization and recombination analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in southwestern China during 2012-2016[J]. Virus Genes, 2018, 54(1): 98-110. doi: 10.1007/s11262-017-1519-y
[19] LV J, ZHANG J W, SUN Z, et al. An infectious cDNA clone of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus variant associated with porcine high fever syndrome[J]. J Gen Virol, 2008, 89(Pt 9): 2075-2079.
[20] 韩焘, 张硕, 吴佳俊, 等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株JXA1-R感染性克隆的构建与鉴定[J]. 中国兽医学报, 2016, 36(11): 1818-1822. [21] WANG L J, XIE W T, CHEN X X, et al. Molecular epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in central China since 2014: The prevalence of NADC30-like PRRSVs[J]. Microb Pathog, 2017, 109: 20-28. doi: 10.1016/j.micpath.2017.05.021
[22] ZHOU L, YANG B N, XU L, et al. Efficacy evaluation of three modified-live virus vaccines against a strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus NADC30-like[J]. Vet Microbiol, 2017, 207: 108-116. doi: 10.1016/j.vetmic.2017.05.031
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