Prevalence and genotyping of Giardia duodenalis in adult goats in Sichuan partial areas
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摘要:目的
了解四川省部分地区成年山羊贾第虫Giardia duodenalis感染情况以及感染虫种基因型。
方法在四川省12个养殖场采集了342份成年山羊的新鲜粪便，采用多位点基因分型技术，通过巢式PCR扩增bg、tpi和gdh基因位点，对阳性样品的PCR产物进行了测序分析。
结果342份成年山羊粪样中贾第虫的总感染率为14.91%(51/342)。所有阳性样品感染的虫种基因型均为集聚体E。51份阳性样品在bg、tpi和gdh这3个基因位点分别成功鉴定出4(E5、E8、E17、E18)、2(E2、E4)和2(E3、E4)种基因亚型，并且在bg位点发现了2种新的基因亚型(E17、E18)。
结论四川省部分地区成年山羊存在较为严重的贾第虫感染，虫种类型主要为集聚体E，且具有一定的遗传多样性。
Abstract:ObjectiveTo investigate the infection states of Giardia duodenalis and the infected G. duodenalis genotype in adult goats in Sichuan partial areas.
MethodThe fecal samples of 342 adult goats were collected from 12 different farms of Sichuan, and subjected to nested PCR to amplify bg, tpi and gdh gene loci through multilocus genotyping technique. PCR products of positive samples were sequenced and further analyzed.
ResultThe infection rate of G. duodenalis in 342 adult goat fecal samples was 14.91% (51/342) and the infected G. duodenalis genotype in all positive samples was assemblage E. Fifty-one positive samples were respectively identified four (assemblage E5, E8, E17 and E18), two (assemblage E2 and E4), and two (assemblage E3 and E4) subtypes in bg, tpiand gdhgene loci. Two novel genotypes (assemblage E17 and E18) were detected at bg locus.
ConclusionThere are serious G. duodenalisinfection in adult goats in Sichuan partial areas. The infected G. duodenalisgenotype is mainly assemblage E which has the genetic diversity at a certain level.
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Keywords:
- adult goat /
- Giardia duodenalis /
- multilocus genotyping technique /
- assemble E
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十二指肠贾第虫Giardia duodenalis，又名贾第虫、蓝氏贾第鞭毛虫G. lamblia、肠贾第虫G. intestinalis，是一种人兽共患肠道致病寄生虫，其宿主广泛，可感染哺乳动物(包括人)、鸟类及两栖动物等[1-2]。贾第虫主要通过粪口途径传播，动物可通过食入被污染的食物和水而感染[3]，感染后主要表现为消化系统症状：胃胀、呕吐、消化不良及急性或慢性腹泻。此外，其危害程度对不同动物也有所不同，主要取决于宿主的免疫、营养状况及有无同时感染其他寄生虫等[4-5]。
目前，根据基因型和宿主特异性，将贾第虫划分为8个集聚体：集聚体A~H[6-7]。山羊是贾第虫感染的常见宿主之一，其感染的基因型包括集聚体A、B和E，其中集聚体E是优势集聚体[8-10]。集聚体A和B对人也具有感染性，是常见的人兽共患集聚体[10-11]。近年来有研究表明，人也能感染集聚体E[12-14]，因此山羊感染贾第虫具有人兽共患传播的风险。
近年来，国内报道多种动物已感染贾第虫，如牛感染集聚体A、B和E，山羊感染集聚体A和E，绵羊感染集聚体A、B和E，狗感染集聚体A、C、和D，猫感染集聚体F，猪感染集聚体A、B、D、E和F，兔子感染集聚体B和E，啮齿类感染集聚体A、B和G，非人灵长类感染集聚体A、B和E，以及有些野生动物也被贾第虫感染[15]。对于山羊的贾第虫感染，已有多个国家进行了相关报道，如西班牙[13]、印度[14]和马来西亚[16]等，不同国家和地区的感染率存在较大差异。然而国内对山羊贾第虫感染的研究甚少，截至2017年12月，仅黑龙江[17]、安徽[18]、陕西和河南[12]等省份有研究，平均感染率为6.07%，只检测到集聚体A和E，以集聚体E为主[15]。国外研究发现，山羊还可感染集聚体B [14, 16]。目前，四川地区鲜见山羊感染贾第虫的相关报道。本研究采用多位点序列分型技术调查四川省部分地区成年山羊贾第虫感染情况，并对阳性样品进行基因型和亚型分析，为研究四川地区成年山羊贾第虫流行情况以及感染的集聚体类型研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 粪便采集
2017年6—8月，在四川省的12个养殖场(名山、经久、纳溪、邻水、水口、大林、松垭、北川、简阳、富顺、青川和双流)采样，采样养殖场地理分布如图1所示，样本量按山羊总数的20%采集，直肠采粪，共收集成年山羊(年龄均为1~2周岁)粪便342份，逐份标记，置于冰箱4 ℃条件下保存。
1.2 主要试剂
粪便DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.®Stool DNA Kit)购自美国MOBIO Bio-tek公司。2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技(北京)有限公司。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
1.3 粪便DNA提取
粪便样品于采样后24 h内经改良饱和蔗糖溶液漂浮处理，然后按粪便DNA提取试剂盒说明书操作，提取的DNA于–20 ℃条件下保存待检[19]。
1.4 巢式PCR扩增
基于β–贾第素(bg)基因位点对所有DNA进行巢式PCR扩增，引物合成与扩增条件参照文献[19-20]。对bg位点扩增所得的阳性样品再进一步扩增其磷酸丙糖异构酶基因位点tpi和谷氨酸脱氢酶基因位点gdh，鉴定基因亚型[20-21]。采用25 μL的反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。第2轮的PCR产物经10 g·L–1的琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性样品产物保存并送检测序。
1.5 测序及分析
阳性PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司双向测序。所得序列进行NCBI的Blast比对，并采用Clustal X与NCBI中的参考序列进行比对和校正，把序列上传至GenBank，得到相关序列的登录号为MG602956、57、58、59、60、61、62、63。采用Mega 6软件通过邻接法(Neighbor-joining method)构建系统发育树。
1.6 数据分析
利用SPSS 17.0进行卡方检验，P<0.05说明处理间具有差异显著性。
2. 结果与分析
2.1 成年山羊贾第虫感染情况
采集的342份粪样中，51份检测为贾第虫阳性，总感染率为14.91%(51/342)。除了松垭和大林2个养殖场以外，其他10个养殖场均检测出贾第虫感染，感染率在5.00%~37.50%，其中，青川养殖场感染率最高，阳性率为37.50%；4个养殖场感染率较高，均高于20%，分别是富顺、邻水、名山和双流养殖场，感染率分别为35.00%、28.57%、21.95%和20.00%(表1)。统计学分析结果表明，12个养殖场的感染率间无显著差异(χ2=1.333，df=9，P=0.998)。
表 1 四川12个养殖场成年山羊贾第虫感染情况Table 1. Infection states of Giardia duodenalis in adult goats from 12 different farms in Sichuan养殖场 样品数 阳性样品数 感染率/
%阳性样品编号1) 名山 41 9 21.95 YA15、18、21、26、29、33、37、38、39 经久 36 3 8.33 XC09、21、23 纳溪 26 2 7.69 LZ012、015 邻水 21 6 28.57 GA03、05、06、17、18、19 水口 40 2 5.00 QL27、28 大林 26 0 0 ··· 松垭 24 0 0 ··· 北川 23 1 4.35 BC07 简阳 20 1 5.00 JY13 富顺 20 7 35.00 ZG01、03、06、12、14、16、17 青川 40 15 37.50 GY05、08、17、18、20、23、25、26、27、28、29、32、35、37、40 双流 25 5 20.00 CD01、02、06、08、22 总计 342 51 14.91 1)“···”表示在该养殖场未检出阳性样品 2.2 基因序列分析
3个基因位点(bg、tpi和gdh)扩增后分别得到50、43和33条序列。序列分析显示，本次调查的成年山羊感染的贾第虫类型均为集聚体E。对bg位点扩增出的51份阳性样品序列鉴定的4个亚型构建进化树(图2)。JY13(MG602960)和CD02(MG602962)分别与已知的基因亚型E8(KY633465)和E5(KY769092)聚在一起，而ZG16(MG602961)和XC09(MG602962)形成独立的分支，为2个新的基因亚型；ZG16与E5、E8亲缘关系较近，而XC09与基因亚型E14(KJ917613)聚得更近。tpi位点进化树(图3)显示，BC07(MG602957)和CD01(MG602956)分别与已知的基因亚型E4(KP635102)和E2(KP635100)聚在一起。gdh基因位点构建的进化树(图4)显示，JY13(MG602959)与已知的基因亚型E3(KF843925)聚在一起，为同一基因亚型，而GY17(MG602958)则与基因亚型E4(KF843926)聚为一支。3个基因位点(bg、tpi和gdh)的进化树都支持本试验鉴定的成年山羊感染的贾第虫类型均为集聚体E的结论。
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图 2 bg基因位点序列系统进化分析“▲”：本试验所得序列；CD02、ZG16、JY13和XC09分别表示双流、富顺、简阳和经久养殖场阳性样品的编号Figure 2. Phylogenetic analysis based on bg gene sequence of Giardia duodenalis![]()
图 3 tpi基因位点序列系统进化分析“▲”：本试验所得序列；CD01和BC07分别表示双流和北川养殖场阳性样品的编号Figure 3. Phylogenetic analysis based on tpigene sequence of Giardia duodenalis![]()
图 4 gdh基因位点序列系统进化分析“▲”：本试验所得序列；JY13和GY17分别表示简阳和青川养殖场阳性样品的编号Figure 4. Phylogenetic analysis based on gdh gene sequence of Giardia duodenalis本研究中51份贾第虫阳性样品在3个基因位点(bg、tpi和 gdh)分别检测到4、2和2种基因亚型(表2)。在bg位点，50条序列分为4种基因亚型：2个已知的基因亚型E5、E8，2个新的基因亚型E17、E18，共有47条序列是E5亚型，占比94.00%，因此E5是bg位点主要的基因亚型。tpi位点的43条序列中检测到2种基因亚型，分别为E2和E4，都是已知的基因亚型，共有41条序列是E2亚型，占比95.35%，因此E2是tpi位点主要的基因亚型。gdh位点的33条序列鉴定出2种基因亚型，分别是E4和E3，均为已知基因亚型，共有32条序列是E4亚型，占比96.97%，E4是gdh位点主要的基因亚型。
表 2 在bg、tpi和gdh基因位点对51株贾第虫分离株的基因亚型分析Table 2. Subtype analyses of 51 Giardia duodenalisisolates based on bg, tpi and gdhgene loci养殖场 阳性样品编号 基因亚型1) bg tpi gdh 北川 BC07 ··· E4 ··· 双流 CD02、06、08、22 E5 E2 E4 CD01 E5 E2 ··· 邻水 GA03、17、19 E5 E2 E4 GA06、18 E5 ··· E4 GA05 E5 ··· ··· 青川 GY17、18、20、26、27、29、35、37 E5 E2 E4 GY05、08、23、28、40 E5 E2 ··· GY25、32 E5 ··· ··· 简阳 JY13 E8 E4 E3 纳溪 LZ012、015 E5 E2 E4 水口 QL27 E5 E2 E4 QL08 E5 E2 ··· 经久 XC09 E17# E2 E4 XC21 E5 E2 ··· XC23 E5 ··· ··· 名山 YA15、26、29、37、38、39 E5 E2 E4 YA21 E5 ··· ··· YA18、33 E5 E2 ··· 富顺 ZG01、03、06、12、17 E5 E2 E4 ZG14 E5 ··· ··· ZG16 E18# E2 ··· 1) “#”表示本试验得到的新亚型；“···”表示在该位点未检出贾第虫基因亚型；bg位点参考序列：E5上海奶牛分离株(KY769092)，E8青海藏羊分离株(KY633465)；tpi位点参考序列：E2河南绵羊分离株(KP635100)，E4河南绵羊分离株(KP635102)；gdh位点参考序列：E3河南奶牛分离株(KF843925)，E4河南奶牛分离株(KF843926) 3. 讨论与结论
本研究采用多位点基因分型法对四川省部分地区成年山羊贾第虫感染情况及感染的贾第虫聚集体类型进行研究。结果显示，试验调查地区成年山羊贾第虫总感染率为14.91%，高于陕西[12]、安徽[18]和黑龙江[17]省部分地区，但低于河南[12]省部分地区，表明我国成年山羊贾第虫感染情况存在明显的地区差异，这种差异可能与不同地区的地理条件和管理因素有关。
近年来，贾第虫基因型分类鉴定常采用的基因包括：小亚单位rRNA(SSU rRNA)基因、tpi、gdh和bg等。对不同的基因位点，检测出的基因型可能不同[22]。此外，以往大多研究[23-25]都是基于某一、两个位点进行测序分析，比多位点序列分型敏感度低且易漏检。多位点基因分型技术检测贾第虫感染具有较好的敏感度，同时可用于贾第虫虫种的鉴定、亚型鉴定以及遗传进化分析，还有助于追溯病原[26]。本研究采用多位点(bg、tpi、gdh)基因分型法对51份阳性样品进行分析，感染的贾第虫均为集聚体E，这与安徽省部分地区报道的贾第虫感染基因型一致[18]。黑龙江省部分地区感染的贾第虫基因型主要为集聚体A、B、E，以集聚体E为主[17]，河南和陕西省部分地区感染的基因型为集聚体A、E，以及集聚体A、E的混合感染[12]。四川省部分地区成年山羊感染的贾第虫基因型与我国其他地区存在差异，具体原因需进一步研究。
bg、tpi和gdh这3个基因位点分别以E5、E2和E4基因亚型为主。在bg位点检测到的基因亚型E5与我国上海奶牛分离株(KY769092)[27]、加纳的山羊分离株(KY711415)[9]、韩国的犊牛分离株(KU86884)[28]以及埃塞俄比亚的牦牛和羔羊分离株(KP334150和KT92250)[29]完全一致，该亚型的宿主范围和地域分布比较广泛，可能是反刍动物的常见亚型之一。在tpi位点检测到的主要基因亚型E2，仅在我国的绵羊分离株(KP635100)[26]和西班牙的山羊分离株(EU189326)[13]中有报道，提示该亚型可能只感染羊，具有宿主特异性。在gdh位点检测到的基因亚型E4与我国河南的奶牛分离株(KF843926)序列完全一致[30]，目前未在其他宿主中检测到。另外在bg位点还检测到2个新的基因型E17和E18，表明四川地区贾第虫虫种可能具有一定的遗传多样性。
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图 2 bg基因位点序列系统进化分析
“▲”：本试验所得序列；CD02、ZG16、JY13和XC09分别表示双流、富顺、简阳和经久养殖场阳性样品的编号
Figure 2. Phylogenetic analysis based on bg gene sequence of Giardia duodenalis
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图 3 tpi基因位点序列系统进化分析
“▲”：本试验所得序列；CD01和BC07分别表示双流和北川养殖场阳性样品的编号
Figure 3. Phylogenetic analysis based on tpigene sequence of Giardia duodenalis
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图 4 gdh基因位点序列系统进化分析
“▲”：本试验所得序列；JY13和GY17分别表示简阳和青川养殖场阳性样品的编号
Figure 4. Phylogenetic analysis based on gdh gene sequence of Giardia duodenalis
表 1 四川12个养殖场成年山羊贾第虫感染情况
Table 1 Infection states of Giardia duodenalis in adult goats from 12 different farms in Sichuan
养殖场 样品数 阳性样品数 感染率/
%阳性样品编号1) 名山 41 9 21.95 YA15、18、21、26、29、33、37、38、39 经久 36 3 8.33 XC09、21、23 纳溪 26 2 7.69 LZ012、015 邻水 21 6 28.57 GA03、05、06、17、18、19 水口 40 2 5.00 QL27、28 大林 26 0 0 ··· 松垭 24 0 0 ··· 北川 23 1 4.35 BC07 简阳 20 1 5.00 JY13 富顺 20 7 35.00 ZG01、03、06、12、14、16、17 青川 40 15 37.50 GY05、08、17、18、20、23、25、26、27、28、29、32、35、37、40 双流 25 5 20.00 CD01、02、06、08、22 总计 342 51 14.91 1)“···”表示在该养殖场未检出阳性样品 
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表 2 在bg、tpi和gdh基因位点对51株贾第虫分离株的基因亚型分析
Table 2 Subtype analyses of 51 Giardia duodenalisisolates based on bg, tpi and gdhgene loci
养殖场 阳性样品编号 基因亚型1) bg tpi gdh 北川 BC07 ··· E4 ··· 双流 CD02、06、08、22 E5 E2 E4 CD01 E5 E2 ··· 邻水 GA03、17、19 E5 E2 E4 GA06、18 E5 ··· E4 GA05 E5 ··· ··· 青川 GY17、18、20、26、27、29、35、37 E5 E2 E4 GY05、08、23、28、40 E5 E2 ··· GY25、32 E5 ··· ··· 简阳 JY13 E8 E4 E3 纳溪 LZ012、015 E5 E2 E4 水口 QL27 E5 E2 E4 QL08 E5 E2 ··· 经久 XC09 E17# E2 E4 XC21 E5 E2 ··· XC23 E5 ··· ··· 名山 YA15、26、29、37、38、39 E5 E2 E4 YA21 E5 ··· ··· YA18、33 E5 E2 ··· 富顺 ZG01、03、06、12、17 E5 E2 E4 ZG14 E5 ··· ··· ZG16 E18# E2 ··· 1) “#”表示本试验得到的新亚型；“···”表示在该位点未检出贾第虫基因亚型；bg位点参考序列：E5上海奶牛分离株(KY769092)，E8青海藏羊分离株(KY633465)；tpi位点参考序列：E2河南绵羊分离株(KP635100)，E4河南绵羊分离株(KP635102)；gdh位点参考序列：E3河南奶牛分离株(KF843925)，E4河南奶牛分离株(KF843926)
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