Antimicrobial resistance and integron-gene cassette detection of Escherichia coli isolates from diarrhea dogs
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摘要:目的
了解腹泻犬源大肠埃希菌Escherichia coli的耐药性以及整合子携带情况。
方法采用K-B纸片扩散法对30株分离自腹泻犬的大肠埃希菌进行19种抗菌药物的敏感性试验;PCR检测菌株中是否携带Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合酶基因,对携带有整合酶基因的阳性菌株进一步检测sul1、qacEΔ1基因以及可变区基因盒携带情况。
结果30株分离株对19种抗菌药物表现出不同程度的耐药性,共产生18种耐药谱,对阿莫西林、氨苄西林、四环素和多西环素的耐药性较高,耐药率分别为90.00%、83.33%、66.67%和63.33%;对其余药物耐药性较低,耐药率低于14.00%;11株分离株含有Ⅰ型整合酶基因且均携带sul1和qacEΔ1基因,未检出Ⅱ型和Ⅲ型整合酶基因;Ⅰ型整合子阳性菌株中,有2株扩增出1 879 bp的耐药基因盒:dfrA12+orfF+aadA2。
结论本次检测的腹泻犬源大肠埃希菌对抗菌药物呈不同水平的耐药性;基因盒介导的耐药性与菌株的耐药表型存在部分相关性,大肠埃希菌的耐药性与Ⅰ型整合子存在一定关系。
Abstract:ObjectiveTo investigate the antimicrobial resistance of Escherichia coli from diarrhea dogs and the distribution of integron-gene cassettes in E. coli.
MethodThe Kirby-Bauer disc diffusion method was used to test the susceptibility of 30 strains of E.coli against 19 antimicrobial agents. PCR was used to detect the integrase genes(class I, II, III) in E.coli isolates. We further detected if E.coli isolates carrying integrase genes also carried the sul1, qacEΔ1 genes and gene cassettes in variable regions.
ResultThirty isolates showed different levels of resistance to 19 antimicrobial agents with 18 kinds of resistant spectrum. E.coli isolates had high resistance to amoxicillin, ampicillin, tetracycline and doxycycline with drug resistance rates of 90.00%, 83.33%, 66.67% and 63.33%, respectively, while had low resistance to the other antimicrobials with drug resistance rates below 14.00%. Eleven out of 30 isolates were found to carry class I integrase, sul1 and qacEΔ1 genes, and class II or class III integrase gene was not detected. Among the isolates carrying class I integrase gene, the dfrA12+orfF+aadA2 gene cassette of 1 879 bp length was successfully amplified from two isolates.
ConclusionE.coli isolates from diarrhea dogs show different levels of resistance to antimicrobial agents. Antimicrobial resistance that mediated by gene cassettes is partially related to the resistant phenotype of E.coli. Class I integron shows a certain relationship with the antimicrobial resistance of E.coli.
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Keywords:
- dog /
- Escherichia coli /
- resistance /
- Kirby-Bauer disc diffusion method /
- integron-gene cassette
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随着国民经济的发展,大米消费市场上优质常规稻米赢得了越来越多消费者的青睐,杂交稻米由于品质较差往往低价销售,这严重挫伤了广大农民种植杂交稻的积极性。育种家根据市场导向,利用我国在水稻杂种优势利用领域的深厚积蕴,不断育成达国标一级的杂交水稻品种[1-3]。但目前杂交水稻整体而言品质还难以和常规稻匹敌,特别是在整精米率、垩白和食味性状上[4]。杂交水稻品质育种重点是优质不育系的选育,21世纪初以来相继有优质不育系选育成功,其中2010年以来就有Y8-2S、荃9311A、长粳1A、N55S、辽73A、宁A等米质优良的不育系育成[5-10]。华南农业大学农学院杂交水稻育种课题组多年来致力于杂交水稻的研究,近年来选育了多个光温敏核不育系、质核互作不育系和恢复系用于杂交水稻配组,其中多个杂交水稻组合已通过省级品种审定。为了挖掘这些不育系和恢复系在品质育种中的配组潜力,探寻品质性状的遗传规律,本研究选用本课题组选育的4个新不育系与4个新恢复系,通过不完全双列杂交设计(NCII)进行遗传交配,组合于2014年在广州早、晚季种植,研究了各亲本品质性状的一般配合力(GCA)与特殊配合力(SCA),为优质杂交水稻的选育提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
采用三系新不育系:G软华A、G华珍A;两系新不育系:N11S、N727S;新恢复系:化感稻3号、华恢55、华恢521、华恢271。所有材料由华南农业大学农学院杂交水稻育种课题组提供。
1.2 方法
采用NCII遗传交配设计模型,共配制得16个杂交组合。于2014年把这些杂交组合的F1种子种植于华南农业大学教学农场,早季3月10日播种、晚季7月10日播种。田间试验按随机区组设计,3次重复,每个小区种植3行,每行10株,双苗植,种植规格16.7 cm×20.0 cm,田间管理为常规管理。待成熟后每小区收获中间行10株,室内放置3个月后考察米质性状。采用万深SC-E型米质判定仪测定垩白粒率、垩白度、米粒长、米粒宽和粒长宽比,直链淀粉含量测定参照焦桂爱等[11]的简易测定法,其他性状测定参照GB/T17891—1999。
配合力方差分析参照王懿波等[12]的方法稍作改动,方差分析时区组的自由度由r-1改为u×(r-1),r为单季区组数,u为季节数。特殊配合力效应方差计算参照莫惠栋[13]的方法进行。采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较。百分率数据均经过平方根反正弦转换,使用Excel和DPS数据处理系统[14]进行数据分析。
2. 结果与分析
2.1 品质性状配合力方差分析
表 1列出了16个组合10个品质性状的方差分析结果。季节间除粒长和粒宽外,其余8个品质性状的配合力方差均达显著或极显著差异,说明了这8个品质性状受季节影响较大,而粒长和粒宽则比较稳定。组合间各品质性状均达显著或极显著差异,表明各组合间存在真实的遗传差异。母本不育系粒宽、出糙率和精米率的一般配合力差异不显著,其余性状差异均达极显著水平;父本恢复系除垩白粒率、垩白度和粒长的一般配合力差异未达显著水平外,其余性状均达显著或极显著水平;特殊配合力除出糙率、精米率、整精米率和粒宽差异未达显著水平外,其余性状均达极显著水平。除母本胶稠度及父本垩白粒率、垩白度和粒长的一般配合力方差小于特殊配合力方差外,双亲其他性状的一般配合力方差均大于特殊配合力方差,表明多数性状主要受基因的加性效应影响。进一步分析不育系和恢复系的一般配合力方差贡献率,发现整精米率、垩白粒率、垩白度、粒长、粒宽、直链淀粉含量不育系的贡献率分别为80.65%、78.69%、77.97%、88.74%、60.18%、52.87%, 均大于恢复系;而出糙率、精米率、粒长宽比和胶稠度恢复系的一般配合力方差贡献率为61.90%、80.19%、71.98%、76.05%,均大于不育系。组合与季节的互作中,精米率、整精米率和粒宽3个品质性状未达显著差异,其他性状均达显著或极显著差异。值得注意的是本研究中粒宽在季节间和组合×季节互作中差异都不显著,说明本试验材料本身构成的小群体中的粒宽性状表达受环境影响较小。
表 1 10个品质性状配合力方差分析1)Table 1. ANOVA for 10 quality traits of tested combinations2.2 不育系的一般配合力效应和特殊配合力效应方差分析
一般配合力是指一个纯合亲本在其所有杂交组合中性状的平均表现,特殊配合力效应方差是指同一个亲本和多个测验系杂交后代的表现与平均值差异的变异度。根据一般配合力和特殊配合力效应方差,亲本的利用价值可以分为4类[15]:Ⅰ)一般配合力效应高,特殊配合力效应方差大;Ⅱ)一般配合力效应高,特殊配合力效应方差小;Ⅲ)一般配合力效应低,特殊配合力效应方差大;Ⅳ)一般配合力效应低,特殊配合力效应方差小。对于效应值越大越好的性状来说,第Ⅰ类亲本是利用价值最大的,既可以利用其一般配合力,又可以利用其特殊配合力;第Ⅱ类亲本可以利用其一般配合力;第Ⅲ类亲本利用其特殊配合力;第Ⅳ类亲本无利用价值。
从表 2不育系的分析中得出,出糙率、精米率、整精米率等碾磨品质性状中,出糙率的一般配合力效应表现最好的是G软华A,但其特殊配合力效应方差较低,属于第Ⅱ类亲本,可利用其一般配合力;精米率一般配合力效应差异不显著;整精米率一般配合力表现较好的是N727S和G软华A,这意味着其所配组合的稻米商品率较高,美中不足的是它们的特殊配合力效应方差小,属于第Ⅱ类亲本,主要利用其一般配合力。
表 2 不育系的一般配合力效应和特殊配合力效应方差1)Table 2. General combining ability(GCA) and variance of specific combining ability(SCA) for 4 male sterile lines外观品质性状包括垩白粒率、垩白度、粒长、粒宽、粒长宽比性状。垩白粒率和垩白度负效应越大越好,G软华A是表现最好的,一般配合力负效应最大,但其特殊配合力效应方差最小,类似于第Ⅱ类亲本,可利用其一般配合力。而G华珍A在垩白粒率和垩白度中的一般配合力效应为正值不符合育种要求,但其特殊配合力效应方差在这2个性状中都是最大,类似第Ⅲ类亲本,可以利用其特殊配合力与特定恢复系配制出垩白性状较好的组合。粒长、粒宽、粒长宽比性状中,虽然G软华A的粒长一般配合力效应最低,但其粒宽的一般配合力效应也是最低,最后导致长宽比一般配合力效应最高且与其他3个不育系有显著差异,这有利于用G软华A配制长粒型组合。
蒸煮品质性状直链淀粉含量和胶稠度中,由于珠三角地区人们喜食偏软、黏的米饭,直链淀粉含量一般配合力效应以负效应大为宜,胶稠度一般配合力效应则正效应较大为佳。G软华A的直链淀粉含量一般配合力负效应最大,与其他3个不育系有显著差异,且特殊配合力效应方差也是最大的,类似于第Ⅰ类亲本,利用价值最大。胶稠度中G华珍A的一般配合力正效应最大,与其他3个不育系有显著差异,特殊配合力效应方差较小,属于第Ⅱ类亲本,可利用其一般配合力,而G软华A的特殊配合力效应方差最大,表明G软华A可与特定的恢复系配出胶稠度高的组合。
2.3 恢复系的一般配合力效应和特殊配合力效应方差分析
从表 3恢复系分析中得出,出糙率、精米率、整精米率等碾磨品质性状的一般配合力正效应最大的是化感稻3号,但是其特殊配合力效应方差在这3个性状中都不大,属于第Ⅱ类亲本,主要利用其一般配合力。碾磨品质最重要性状整精米率的特殊配合力效应方差最大的是华恢521,表明可利用其特殊配合力与特定不育系配出高整精米率的组合。
表 3 恢复系的一般配合力效应和特殊配合力效应方差1)Table 3. General combining ability(GCA) and variance of specific combining ability(SCA) for 4 restorer lines外观品质性状中,垩白粒率一般配合力负效应最大的是华恢521,同时其特殊配合力效应方差也是最大的,类似于第Ⅰ类亲本,利用价值最大。但华恢521的垩白度一般配合力正效应也是最大,这说明了华恢521虽然垩白粒率低,却由于单粒垩白面积较大,最后导致整体的垩白度最高。垩白度一般配合力负效应较大的是化感稻3号和华恢55,但其特殊配合力效应方差较小,类似第Ⅱ类亲本,可利用其一般配合力配出垩白度较低的组合。粒长、粒宽和粒长宽比性状中,化感稻3号的粒长宽比一般配合力正效应最大,特殊配合力效应方差最小,属于第Ⅱ类亲本,主要利用其一般配合力。进一步分析发现化感稻3号的粒长一般配合力效应中等,粒宽一般配合力负效应最大,说明是粒宽小导致化感稻3号的粒长宽比高。
蒸煮品质性状中,直链淀粉含量一般配合力负效应最大的是华恢521,与另3个恢复系差异显著,但其特殊配合力效应方差不大,属第Ⅱ类亲本,主要利用其一般配合力,华恢55的特殊配合力效应方差最大,可利用其特殊配合力与特定不育系配出低直链淀粉含量的组合。胶稠度一般配合力正效应最大的是华恢521,特殊配合力方差也大,属于第Ⅰ类亲本,利用价值最大。华恢271的胶稠度一般配合力正效应与华恢521相当,但其特殊配合力效应方差很小,主要利用其一般配合力。
2.4 特殊配合力效应分析
表 4中同一亲本的不同组合间和同一组合的不同性状间特殊配合力相差很大,说明基因型互作的多样性。碾磨品质性状中,出糙率表现较好的组合是N727S/华恢521、G华珍A/华恢55;精米率表现较好的组合是N727S/华恢521;整精米率表现较好的组合是G华珍A/华恢521。外观品质性状垩白粒率和垩白度中,G华珍A/华恢271、N11S/华恢521和N727S/华恢521这3个组合的负效应大,表现较好。粒长、粒宽、粒长宽比性状中,粒长正效应较大的组合是N727S/华恢521和N11S/华恢521;粒宽负效应较大的组合是G软华A/华恢271和G华珍A/华恢521;粒长宽比正效应较大的组合是G软华A/华恢271、N11S/华恢521、N727S/华恢521,其中,G软华A/华恢271是因为其粒宽较小导致粒长宽比高,N11S/华恢521和N727S/华恢521是因为其粒长较大导致其粒长宽比高。蒸煮品质性状直链淀粉含量和胶稠度中,直链淀粉含量负效应较大的组合是G软华A/华恢271和N727S/华恢55;胶稠度正效应较大的组合是N11S/化感稻3号和G软华A/华恢521。通过追溯这些高特殊配合力组合亲本的一般配合力发现(表略),各亲本的一般配合力和其所配组合的特殊配合力没有明显的对应关系。
表 4 16个组合的品质性状特殊配合力Table 4. Specific combining ability(SCA) for quality traits of 16 combinations3. 讨论与结论
3.1 杂交籼稻品质性状的主要遗传规律
本研究表明大多数品质性状一般配合力方差和特殊配合力方差均达显著或极显著水平,说明这些性状受加性效应和非加性效应的共同控制,且一般配合力方差大于特殊配合力方差,说明多数性状受基因加性效应影响更大。在整精米率、垩白粒率、垩白度和直链淀粉含量等性状上不育系一般配合力方差贡献率高,表明提高整精米率、减少垩白、降低直链淀粉含量要以不育系的改良为突破口。在粒长宽比和胶稠度性状上恢复系一般配合力方差贡献率高,表明粒型性状和米饭回生的改良要以恢复系为突破口。这也揭示了米质改良的目标不同,突破口也不同,这与侧重不育系[16-19]和恢复系[20]的观点不同。大多数品质性状配合力与季节互作明显,表明配合力在不同的季节表现不一致,与伍箴勇等[21]和周勇等[22]的配合力在不同的生态区表现不一致的观点类似。
3.2 一般配合力和特殊配合力的关系
关于杂交水稻亲本的一般配合力与特殊配合力的关系有许多研究,但结果各异,多数研究者认为一般配合力与特殊配合力没有明显的对应关系[21, 23-24],但也有研究者认为一般配合力与特殊配合力表现基本一致[25]。本研究表明,亲本的一般配合力与其所配组合的特殊配合力相互独立,无对应关系。因此在改良水稻米质性状时,要重视一般配合力的选择,在特殊配合力效应方差大的亲本上广泛测交也是非常有必要的。
3.3 亲本利用价值评价
优质的稻米要求具有优良的碾磨品质、外观品质、蒸煮品质和食味品质,不能在某一项米质性状上有明显的缺陷。根据这一原则,G软华A在参试不育系中表现最好,容易配出米质优良的组合,实践中用G软华A已选配出4个杂交水稻品种,包括软华优128、软华优535、软华优699、软华优1179,已分别于2014、2015年通过广西或广东省品种审定,米质均达到国家《优质稻谷》3级以上;G华珍A则在胶稠度改良上有一定应用价值。在参试的恢复系中,没有一个恢复系能在所有的品质性状中都表现优良,或多或少都有缺陷。其中化感稻3号在出糙率、精米率、整精米率、垩白度和粒长宽比上表现较好。华恢521在垩白粒率、直链淀粉含量和胶稠度上一般配合力好且特殊配合力效应方差较大,易配出低垩白粒率和高胶稠度的组合。这些恢复系可通过与米质优良的不育系配组或者与性状互补的不育系配组得到米质较为理想的组合。本研究只是在广州做了早、晚2季的试验,而要想在更多地区推广应用这些材料还需要进一步的多点试验,这也是本课题组下一步要开展的工作。
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表 1 整合子–基因盒引物序列
Table 1 Primers used for integron-gene cassettes application
基因/基因盒 引物 序列(5′→3′) 产物大小/bp intI1 HS463a[14] CTGGATTTCGATCACGGCACG 471 HS464[14] ACATGCGTGTAAATCATCGTCG qacEΔ1-sul1 qacEΔ1-sul1F[15] ATCGCAATAGTTGGCGAAGT 800 qacEΔ1-sul1R[15] GCAAGGCGGAAACCCCGCC 基因盒插入区 HS458[14] GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG 可变 HS459[14] GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC intI2 intI2-F[16] CAAGCATCTCTAGGCGTA 1 056 intI2-R[16] AGTAGCATCAGTCCATCC intI3 intI3-F[16] CATCAAGCTGCTCGATCA 878 intI3-R[16] ACAACTCTTGCACCGTTC 表 2 30株大肠埃希菌对19种抗菌药物的药敏结果1)
Table 2 Susceptility results of 30 Escherichia coli isolates against 19 antimicrobial agents
抗生素分类 药物 总体耐药性/% 整合子耐药性/% 耐药率 中介率 敏感率 整合子携带阴性株 整合子携带阳性株2) 青霉素类 阿莫西林 90.00 3.33 6.67 100.00 72.73* 氨苄西林 83.33 16.67 0 84.21 81.82 四环素类 四环素 66.67 3.33 30.00 57.89 81.82 多西环素 63.33 20.00 30.00 52.63 81.82* 酰胺醇类 氯霉素 36.67 3.33 60.00 15.79 72.73** 氟苯尼考 33.33 3.33 63.33 21.05 54.55 磺胺类 复方新诺明 30.00 0 70.00 10.53 63.64** 氨基糖苷类 链霉素 23.33 13.33 63.33 10.53 45.45* 庆大霉素 13.33 0 86.67 5.26 27.27 卡那霉素 6.67 20.00 73.33 0 18.18* 新霉素 3.33 16.67 80.00 0 0 阿米卡星 3.33 0 96.67 0 9.09 喹诺酮类 环丙沙星 6.67 3.33 90.00 0 18.18* 诺氟沙星 6.67 3.33 90.00 0 18.18* 氧氟沙星 3.33 3.33 93.33 0 9.09 头孢类 头孢唑啉 3.33 0 96.67 0 9.09 头孢噻肟 3.33 0 96.67 0 0 头孢曲松 3.33 3.33 93.33 0 9.09 单环β–内酰胺类 氨曲南 3.33 0 96.67 0 9.09 1)共有30株分离株,整合子阴性株和阳性株分别为 11 和 19株;2)*和**分别表示整合子携带阳性株与整合子携带阴性株的耐药性在 0.05 和 0.01 水平差异显著(χ2 检验) 表 3 大肠埃希菌耐药菌株的耐药谱
Table 3 Resistance spectrum of Escherichia coli resistant strains
犬源大肠埃希菌
菌株编号耐药谱1) 犬源大肠埃希菌
菌株编号耐药谱1) 4、5、10、29、32、33 AML/DOX/AMP/TET 8 DOX/TET/SXT 1、9、13、25、37 AML/AMP 23 AML/DOX/AMP/SXT 2、11、36 AML/DOX/CHL/FFC/AMP/TET 28 DOX/TET 6、7 AML 14 GM 3 AML/DOX/STR/AMP/TET/SXT 34 AML/DOX/CHL/STR/
AMP/TET/SXT18 AML/DOX/CHL/STR/AMP/TET/SXT 38 AML/CHL/FFC/AMP/TET 21 AML/AMP/TET/DOX/CHL/FFC/SXT/STR/GM/KAN/CIP/NOR/AMK/CRO/CEZ/CTX/
AZM/OFX39 AML/CHL/FFC/STR/AMP/TET 27 AML/DOX/CHL/FFC/AMP/STR/TET/SXT 41 AML/GM/NEO/FFC/AMP 40 AML/AMP/TET/DOX/CHL/FFC/SXT/STR/GM/KAN/CIP/NOR 31 AML/CHL/FFC/AMP/TET/SXT 1)AML:阿莫西林;AMP:氨苄西林;TET:四环素;DOX:多西环素;CHL:氯霉素;FFC:氟苯尼考;SXT:复方新诺明;STR:链霉素;GM:庆大霉素;KAN:卡那霉素;CIP:环丙沙星;NOR:诺氟沙星;AMK:阿米卡星;CRO:头孢曲松;CEZ:头孢唑啉;CTX:头孢噻肟;AZM:氨曲南;OFX:氧氟沙星 表 4 大肠埃希菌耐药性和基因盒的携带情况
Table 4 Drug resistance and the carrying gene cassettes of Escherichia coli
菌株编号 耐药谱型1) 整合子类型 基因盒 21 AML/AMP/TET/DOX/CHL/FFC/SXT/STR/GM/KAN/CIP/NOR/AMK/CRO/CEZ/CTX/AZM/OFX Ⅰ dfrA12+orfF+aadA2 40 AML/AMP/TET/DOX/CHL/FFC/SXT/STR/GM/KAN/CIP/NOR Ⅰ dfrA12+orfF+aadA2 1)AMO:阿莫西林;AMP:氨苄西林;TET:四环素;DOX:多西环素;CHL:氯霉素;FFC:氟苯尼考;SXT:复方新诺明;STR:链霉素;GM:庆大霉素;KAN:卡那霉素;CIP:环丙沙星;NOR:诺氟沙星;AMK:阿米卡星;CRO:头孢曲松;CEZ:头孢唑啉;CTX:头孢噻肟;AZM:氨曲南;OFX:氧氟沙星 -
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