Fast and nondestructive gender detection of Bombyx mori chrysalis in the cocoon based on near infrared transmission spectroscopy
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摘要:目的
利用近红外漫透射光谱快速无损鉴别家蚕Bombyx mori种茧茧壳内蚕蛹的雌雄，以提高育种效率、降低人工成本。
方法以芙9、9芙、湘7和7湘4个蚕品种为研究对象，采集比较了样本在可见和近红外区间的漫透射光谱，建立比较了各品种偏最小二乘判别分析(PLSDA)、后向传播神经网络(BPNN)以及支持向量机分类(SVM)判别模型，通过分类器特性(ROC)曲线研究了各模型的鲁棒性，采用差值法和遗传算法提取了特征波长。
结果芙9、9芙、湘7和7湘品种利用450~900 nm光谱建模的雌雄鉴别准确率分别为95.20%、95.65%、88.80%和87.50%，利用900~1 700 nm 光谱建模的准确率分别为100%、96.00%、92.22%和94.21%；采用PLSDA、BPNN和SVM模型都能够对蚕蛹雌雄做出较好的无损鉴别，3种模型真雌性率分别为95.96%、95.83%和100%，真雄性率分别为98.98%、96.04%和82.18%，准确率分别为97.46%、95.94%和90.86%，进一步通过ROC曲线分析，PLSDA模型效果最优，BPNN模型次之；手动提取20个波段建立PLSDA模型，鉴别真雌性率为93.75%，真雄性率为95.45%，准确率为94.57%。
结论近红外波段900~1 700 nm的漫透射光谱比可见–近红外波段450~950 nm含有更丰富的蚕蛹雌雄分类信息；3种鉴别模型中，PLSDA模型效果最优；提取特征波段后，准确率能达到生产需要。
Abstract:ObjectiveTo identify the gender of Bombyx mori chrysalis in the cocoon by rapid and non-destructive method based on near infrared transmission spectroscopy, improve breeding efficiency and reduce labor cost.
MethodWe used four silkworm varieties including Fu 9, 9 Fu, Xiang 7 and 7 Xiang, and compared their diffuse transmission spectra between 450-950 nm and 900-1700 nm. Partial least squares discrimination analysis (PLSDA), back propagation neural network (BPNN) and support vector machine (SVM) discrimination models were established and compared among different varieties. The robustness of the models was studied through the receiver operating characteristic(ROC) curve. Characteristic wavelengths were extracted by difference method and genetic algorithm.
ResultThe identification accuracy rates for Fu 9, 9 Fu, Xiang 7 and 7 Xiang varieties were 95.20%, 95.65%, 88.80% and 87.50% respectively using 450-950 nm spectra, and were 100%, 96.00%, 92.22% and 94.21% respectively using 900-1 700 nm spectra. Using PLSDA, BPNN and SVM models resulted in good identification of male and female silkworm pupae, the true female rates were 95.96%, 95.83% and 100%, the true male rates were 98.98%, 96.04% and 82.18%, and the accuracy rates were 97.46%, 95.94% and 90.86%, respectively. Based on the analysis of ROC curve, the PLSDA model was the optimal, followed by the BPNN model. Twenty bands were extracted manually as the equipment input, and the true female rate, true male rate and accuracy rate were 93.75%, 95.45% and 94.57% respectively based on the PLSDA model.
ConclusionDiffuse transmission spectra in the near infrared (900-1 700 nm) contains more classification information of male and female pupae compared with the visible-near infrared (450-950 nm). The PLSDA model is the optimal one among three models. After extracting the characristic bands, the accuracy rate can meet the requirements of actual production.
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Keywords:
- Bombyx mori /
- silkworm chrysalis /
- gender /
- near infrared spectroscopy /
- diffuse transmission /
- band /
- nondestructive detection
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有机废弃物厌氧处理可减轻或消除环境污染，而且可以得到清洁能源———沼气; 同时，厌氧发酵过程中产生的沼液含有丰富的以速效养分存在的氮、磷、钾等大量营养元素和铜、锌、铁、锰等微量元素[1-3]，养分利用率高，是不可多得的多元速效液体肥料的原料[4-5].但是，要想把沼液加工成液体肥料并销售，就必须去除沼液中的渣质性物质，并控制其所散发的异味.渣质性物质属于固体颗粒物，可以采用滤料或筛网过滤等物理方法去除，但沼液恶臭气味无法得到有效控制[6].虽然，沼液散发的异味对农田中的作物并不一定有明显的毒害作用，但人会不愉快[7].沼液散发恶臭气味的问题不解决，就达不到商品液体肥料的质量安全要求.
在沼液中已检测出21种易挥发有机物，包括有机胺、含硫有机物、苯系物、卤代烃和烷烃等[2, 8]，其中部分物质具有较强的异味.本文针对沼液中挥发性有机物(Volatile organic compounds，VOCs)的成分特点，研究了去除VOCs的方法，确定各方法中的最佳条件及VOCs的去除率，并进行了去除VOCs沼液的营养成分分析和肥效验证.
1. 材料与方法
1.1 材料
沼液取自吉林省九台市农户自家沼气池，产气原料为畜禽粪便、秸秆和废弃物等.沼液发酵45 d，新鲜沼液从沼气池中取出，去除沼液中的砂粒、粪便颗粒和秸秆等杂物.将过滤后的沼液样品密闭，作为供试沼液备用.
试剂:硫酸，氢氧化钠，过氧化氢，三氯甲烷，石油醚(沸程为60~90℃)为分析纯试剂.氮气，纯度为99.999%.
仪器: CF-YG10型臭氧机(北京山美水美环保高科技有限公司)，SPY5型震荡机(上海市离心机械研究所有限公司)，6890N气相色谱仪配FID检测器(美国Aglient公司)，UDK142型自动凯氏定氮仪(意大利VELP公司)，M410型火焰光度计(英国Sherwood Scientific公司)，1901型紫外可见分光光度计、TAS-990型原子吸收分光光度计由北京普析通用仪器有限责任公司生产.
1.2 方法
1.2.1 不同处理去除沼液中的VOCs
加热处理:取沼液样品200 mL于500 mL三角瓶中，恒温水浴对沼液进行加热(不加塞密封)，温度分别为30、40、50、60、70℃，恒温加热180 min后，取样测定沼液中的VOCs.
化学试剂处理:取沼液样品200 mL于500 mL三角瓶中，将硫酸、氢氧化钠和过氧化氢分别配制成0.1 mol·L-1的溶液，加入到沼液样品中，加入量设定为1、5、10、15、20 mL，将三角瓶加塞密封，在磁力搅拌器的搅拌下持续180 min后，取样测定沼液中的VOCs.
活性炭处理:取沼液样品200 mL于500 mL三角瓶中，加入干燥粒径为1 mm的活性炭，加入量设定为4、6、8、10和12 g，加塞密封后在25℃恒温水浴中振荡180 min后，过滤后取样测定沼液中的VOCs.
通气处理:取沼液样品3 L，在液面下的不同高度布置10个球形散气石以保证气体与沼液充分混合.通入气体分别为氮气、空气和臭氧.气体通入量为2.4 L·min-1; 通气为间歇式，第1次通气20 min，停10 min，从第2次至第5次充气时间均为10 min，间隔10 min.取样测定沼液中的VOCs.
有机溶剂萃取:取沼液样品200 mL于500 mL三角瓶中，加三氯甲烷25 mL，加塞密封，室温下振荡30 min，转移至分液漏斗中，静止至分层，弃去有机相，全部沼液再加20 mL三氯甲烷按照上述步骤继续萃取.然后用石油醚代替三氯甲烷重复上述步骤后，取样测定沼液中的VOCs.
通臭氧与有机溶剂萃取组合处理:取通臭氧处理后的沼液样品200 mL再进行有机溶剂萃取.
以上每个处理均重复3次.对照处理:取沼液样品10 mL于20 mL顶空瓶中，采用顶空－气相色谱法测定VOCs[8].
1.2.2 沼液中营养元素成分分析及肥效验证
分别测定沼液样品和通臭氧+有机溶剂萃取处理后的沼液中的N、P、K、Cu、Zn、Fe、Mn等养分指标.
肥效验证采用田间小区试验.供试土壤为黑土，土壤主要理化性质:有机质37.51 g·kg-1、总氮3.17 g·kg-1、有效磷48.65 mg·kg-1、速效钾176.37 mg·kg-1、pH 6.14.供试蔬菜为大白菜(北京大牛心)和甜椒(中椒4号).小区面积为8.0 m2.设置3个处理:处理1施用沼液样品，处理2施用通臭氧+有机溶剂萃取处理的沼液，处理3施用井水(对照)，各处理施用量均为4.37 L·m-2，进行常规田间管理.每个处理重复3次.
大白菜播种时间为2012年7月25日，按照5穴·m-2播种; 8月15日定植，每穴1株; 分别于8月19日、9月4日、9月19日分3次施入沼液或井水，第1次施用量为1.25 L·m-2，第2、3次均为1.56 L·m-2; 10月5日收获，测定产量及维生素C的含量.
甜椒采用苗床育苗、小区定植的方式进行栽培.于2012年4月15日育苗，定植前的苗期管理措施均相同; 于6月15日按照5株·m-2的密度在小区定植，分别于6月25日、7月14日、8月3日分3次施入沼液或井水，第1次施用量为1.25 L·m-2，第2、3次均为1.56 L·m-2; 于7月31日、8月10日和8月28日分3次收获; 测定产量，并取第3次收获样品测定维生素C的含量.
1.2.3 样品分析
前处理方法:取体积为20 mL的顶空瓶，准确加入10.0 mL沼液，加入2.0 g NaCl，混匀，盖塞，50℃恒温水浴平衡10 min，用气体进样针取0.5 mL顶空瓶中气体供气相色谱仪分析[8].
色谱分析条件: DB-MTBE石英毛细管色谱柱(30 m×0.53 mm×3 μm，Aglient公司)，载气为高纯氮气(纯度 > 99.999%)，载气流量为2 mL·min-1; 进样口温度100℃，柱箱温度为80℃，FID检测器温度为250℃; 氢气流量为40 mL·min-1; 空气流量为450 mL·min-1; 不分流进样[8].出峰时间定性，峰面积定量.
有效N、P、K含量分别采用蒸馏后滴定、钒钼黄比色、火焰光度法测定[9]342，水溶性Cu、Zn、Fe和Mn均采用原子吸收分光光度法测定[9]395.
蔬菜中维生素C采用2，6-二氯靛酚滴定法测定[9]469-473.
1.3 数据处理
采用DPS软件3.01进行数据分析，采用新复极差法进行差异显著性检验.
去除率=(未除VOCs处理的峰面积－去除VOCs处理的峰面积)/未除VOCs处理的峰面积×100%.
2. 结果与分析
2.1 不同处理对去除沼液中VOCs的影响
如图 1所示，随沼液加热温度的上升，对沼液中VOCs的去除率不断上升.当温度从30℃升温至50℃，VOCs去除率提高24.7%;温度从50℃升温至70℃，VOCs去除率提高8.2%，增幅较小.当温度达到70℃时，VOCs的去除率最高，但仅为57.7%，还不能满足沼液中VOCs的去除要求.
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图 1 热处理对沼液中VOCs的去除影响Figure 1. Effects of heat treatments on the VOCs removal from biogas slurry通过向沼液中分别加入硫酸、氢氧化钠、过氧化氢，研究酸性、碱性试剂和氧化剂对沼液中VOCs的去除影响.随着化学试剂用量的增加，VOCs去除率逐渐升高(图 2).在加入量1~10 mL阶段，随着试剂量的增加，去除率上升迅速，超过10 mL后，VOCs的去除率逐渐趋于平衡，且最高值分别为36.4%、39.2%和39.3%，不能满足沼液中VOCs的去除要求.
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图 2 化学试剂对沼液中VOCs的去除影响Figure 2. Effects of different chemical reagents on the VOCs removal from biogas slurry如图 3所示，随着活性炭用量的增加，沼液中VOCs去除率逐渐升高，当200 mL沼液活性炭用量达到12 g时，VOCs的去除率达69.9%，效果较好.
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图 3 活性炭吸附对沼液中VOCs的去除影响Figure 3. Effects of activated carbon adsorption on the VOCs removal from biogas slurry分别向沼液中通入氮气、空气和臭氧，并对沼液进行曝气处理，沼液中VOCs的去除结果见图 4.通臭氧、空气和氮气的VOCs去除率分别为81.7%、67.3%和53.0%.氮气仅具有吹脱作用，而空气和臭氧均具有氧化性，除了挥发作用，还能通过氧化挥发性有机物促使沼液中VOCs含量迅速降低.扣除吹脱作用的影响，通臭氧和空气处理的纯粹氧化作用对沼液中VOCs的去除率分别为28.7%和14.3%.通臭氧和空气处理明显优于通氮气处理，处理效果臭氧要优于空气.
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图 4 氮气、空气、臭氧对沼液中VOCs的去除效果Figure 4. Effects of nitrogen, air and ozone on the VOCs removal from biogas slurry根据“相似相溶”原理，三氯甲烷和石油醚萃取可以分别去除中等和弱极性的有机物质，从而减少沼液中的VOCs.沼液经有机溶剂萃取、静止分层、弃去有机相之后，沼液中VOCs峰面积为1 629，而VOCs原样品处理的峰面积为12 930，VOCs去除率达到87.4%，效果较为理想.
将前述去除沼液中VOCs效果较好的通臭氧处理和有机溶剂处理按顺序进行组合，VOCs的峰面积降至762(图 5)，总去除率达到94.1%，明显高于2种单项处理技术.
2.2 组合技术对沼液肥效的影响
表 1数据显示，通臭氧+有机溶剂萃取组合技术去除沼液中VOCs后，主要植物营养指标的含量无显著变化，无机养分物质含量几乎没有损失，能够很好地保证肥效.
表 1 去除VOCs对沼液中植物营养元素含量的影响1)Table 1. Effects of VOCs removal on plant nutrient in biogas slurry
图 6可以看出:与对照相比，施用沼液后大白菜和甜椒的产量均有所增长，大白菜的增产达到35%，甜椒的增产高于27%，说明沼液有提高土壤肥力和促进作物增产的积极作用.但无论是否对沼液去除VOCs，土壤肥力和作物增产均未见显著性差异，说明VOCs去除对沼液的肥效没有明显影响.
由图 7可以看出:施用沼液样品和通臭氧+有机溶剂萃取处理与井水对照相比，大白菜和甜椒2种蔬菜中维生素C的含量未见显著性差异.表明沼液去除VOCs后，对蔬菜品质没有影响.
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图 7 沼液对2种蔬菜中维生素C含量的影响Figure 7. Effects of biogas slurry on vitamin C contents of vegetables3. 讨论与结论
研究表明，加热有助于沼液中VOCs的挥发，但耗能较多[10]; 化学试剂可能会引起沼液化学成分的变化并影响作物生长[11-13]; 活性炭的吸附是无选择性的，对沼液中植物营养元素同样具有明显的吸附而影响肥效[14]，本文研究表明，上述这3种处理的VOCs去除率均较低.
氮气是一种惰性气体，一般不与有机物发生反应，若将氮气通入沼液中，沼液中的易挥发性物质就会随氮气从液相中挥发[15]，但效果较差; 若用臭氧替换氮气，臭氧除了有助于沼液中VOCs的挥发，还具有氧化作用.研究表明，通臭氧可有效降低沼液中VOCs含量，而且臭氧并不会影响到沼液中的矿质元素含量，不影响沼液的肥效[16]; 另外，臭氧还具有杀死少量虫卵和有害微生物的功能，可在一定程度上降低沼液有害成分的浓度[17].目前，臭氧机的使用已经进入民用阶段[18]，其价格较为便宜且使用成本不高，从去除效果和生产成本考虑，用臭氧去除沼液中的VOCs是较为理想的技术措施.
有机溶剂对沼液中的矿质元素含量影响很小，对VOCs去除效率较高.因此，有机溶剂萃取也是生产中可以采纳的方法.萃取所用的有机溶剂与沼液分离之后，可进行蒸馏处理之后循环利用，既降低成本，又降低对环境的污染风险.由于三氯甲烷的水溶性和毒性都略大于石油醚，萃取过程中，一定是三氯甲烷萃取后再进行石油醚萃取，这样残余在沼液中的三氯甲烷就会被石油醚溶解，进入有机相，残留在沼液中有机溶剂的量会大大减少.
沼液先进行通臭氧处理之后再进行有机溶剂萃取处理，有机溶剂的用量会大幅度降低; 2种处理技术按顺序组合在一起，沼液中VOCs去除率高达94.1%，去除效果十分明显.此组合技术只是将沼液中的易挥发性有机物质转移出沼液，其中的无机营养元素不会被臭氧破坏，也不会被有机溶剂溶解，肥效验证试验很好地证明了这一点.该组合技术能够在保证肥效的前提下有效地去除沼液中的VOCs，实现有效去除异味的目标，为沼液液体肥进入商品流通环节提供技术支持.
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图 1 茧壳内蚕蛹雌雄快速无损检测系统
Figure 1. The system of fast and nondestructive gender detection of silkworm chrysalis in the cocoon
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图 2 芙9样本在不同波段的漫透射光谱均值 (±SD)
Figure 2. The mean (±SD) of diffuse transmission spectrum of Fu 9 samples at different bands
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图 3 基于不同波段光谱数据输入时样本在潜变量的得分
Figure 3. The scores on latent variables based on spectroscopy data at different bands
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图 5 雌雄蚕茧光谱数据的差值(Δy)随波长的变化
Figure 5. The change in difference between male and female spectra data (Δy) with wavelengh
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图 6 差值法、遗传算法和全波段建模的ROC曲线
Figure 6. The ROC curves of difference method, genetic algorithm and full-waveband models
表 1 PLSDA、BPNN和SVM建模方法的效果比较
Table 1 Effect comparison of PLSDA，BPNN and SVM models
模型 样本数 真实值 预测值 真雌性率/% 真雄性率/% 准确率/% AUC1) 雌性 雄性 雌性 雄性 正确 错误 正确 错误 PLSDA 197 96 101 95 4 97 1 95.96 98.98 97.46 0.975 BPNN 197 96 101 92 4 97 4 95.83 96.04 95.94 0.959 SVM 197 96 101 96 18 83 0 100 82.18 90.86 0.910 1) AUC表示分类器特征曲线下的积分面积 
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表 2 差值法、遗传算法和全波段建模的比较
Table 2 Effect comparison of difference method, genetic algorithm and full-waveband models
方法 样本数 真实值 预测值 真雌性率/% 真雄性率/% 准确率/% AUC1) 雌性 雄性 雌性 雄性 正确 错误 正确 错误 差值法 736 384 352 360 24 336 16 93.75 95.45 94.57 0.972 7 遗传算法 736 384 352 292 92 223 129 76.04 63.35 69.97 0.738 2 全波段 736 384 352 367 17 338 14 95.57 96.02 95.79 0.978 2 1) AUC表示分类器特征曲线下的积分面积
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[1] 代芬, 吴玲, 叶观燕, 等. 基于近红外漫透射光谱信息的蚕茧雌雄检测[J]. 农业机械学报, 2015, 46(12): 280-283. [2] 封槐松, 李建琴. 我国蚕桑产业发展 “十二五” 回顾与 “十三五” 展望[J]. 中国蚕业, 2016, 37(1): 4-10. [3] 顾国达, 徐俊良. 论我国蚕丝业的多中心起源[J]. 浙江大学学报(人文社会科学版), 2003, 33(3): 42-47. [4] 顾国达, 李建琴. 2012年蚕桑产业发展趋势与建议[J]. 中国蚕业, 2012, 33(1): 1-4. [5] 李建琴, 顾国达. “一带一路” 对中国蚕丝业发展的战略意义[J]. 中国蚕业, 2015, 36(4): 1-7. [6] 潘沈元, 金同铭, 陆国权, 等. 蚕茧近红外反射光谱的模式识别[J]. 生物物理学报, 1995, 11(1): 53-59. [7] 潘沈元. 蚕茧近红外反射光谱的模式识别II. 光谱识别中特征值选取方法的探讨[J]. 生物物理学报, 1998, 14(2): 252-256. [8] 潘沈元, 陶鸣, 孙爱群, 等. 雌雄蚕蛹近红外反射光谱的差异及其模式识别[J]. 昆虫学报, 1996, 39(4): 360-365. [9] MARTEL A, BURGHAMMER M, DAVIES R J, et al. Silk fiber assembly studied by synchrotron radiation SAXS/WAXS and raman spectroscopy[J]. J Am Chem Soc, 2008, 130(50): 17070-17074.
[10] 刘桂花, 张中湖. 拉曼与近红外、中红外光谱在药品掺杂筛选应用中的前景分析[J]. 齐鲁药事, 2012, 31(11): 634-635. [11] LEFEVRE T, PAQUET-MERCIER F, LESAGE S, et al. Study by raman spectromicroscopy of the effect of tensile deformation on the molecular structure of Bombyx mori silk[J]. Vib Spectrosc, 2009, 51(1): 136-141.
[12] 金航峰. 基于光谱和高光谱图像技术的蚕茧品质无损检测研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2013. [13] 颜辉, 陈斌, 金尚忠. 基于NIR的主成分结合支持向量机鉴别蚕茧雌雄的研究[J]. 计算机与应用化学, 2008, 25(10): 1261-1264. [14] SHAFFER R E, SMALL G W, ARNOLD M A. Genetic algorithm-based protocol for coupling digital filtering and partial least-squares regression: Application to the near-infrared analysis of glucose in biological matrices[J]. Anal Chem, 1996, 68(15): 2663-2675.
[15] DELWICHE S R, HARELAND G A. Detection of scab-damaged red spring wheat kernels by near-infrared reflectance[J]. Cereal Chem, 2004, 81(5): 643-649.
[16] CHRISTY A A, KASEMSUMRAN S, DU Y, et al. The detection and quantification of adulteration in olive oil by near-infrared spectroscopy and chemometrics[J]. Anal Sci, 2004, 20(6): 935-940.
[17] BERARDO N, PISACANE V, BATTILANI P, et al. Rapid detection of kernel rots and mycotoxins in maize by near-infrared reflectance spectroscopy[J]. J Agr Food Chem, 2005, 53(21): 8128-8134.
[18] BERGHOLT M S, ZHENG W, LIN K, et al. Raman endoscopy for in vivo differentiation between benign and malignant ulcers in the stomach[J]. Analyst, 2010, 135(12): 3162-3168.
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期刊类型引用(5)
1. 刘进，周慧颖，马小定，孟冰欣，崔迪，胡佳晓，涂夯，余丽琴，韩龙植，黎毛毛. 基于高密度遗传图谱定位水稻抽穗期耐热性QTL. 植物遗传资源学报. 2025(05): 962-973 . 
百度学术
2. 赵凌，张勇，魏晓东，梁文化，赵春芳，周丽慧，姚姝，王才林，张亚东. 利用高密度Bin图谱定位水稻抽穗期剑叶叶绿素含量QTL. 中国农业科学. 2022(05): 825-836 . 百度学术
3. 宋博文，王朝欢，赵哲，陈淳，黄明，陈伟雄，梁克勤，肖武名. 基于高密度遗传图谱对水稻粒形QTL定位及分析. 作物学报. 2022(11): 2813-2829 . 百度学术
4. 潘俊峰，崔克辉，刘彦卓，王昕钰，严博宇，梁开明. 利用高密度Bin图谱定位水稻叶绿素含量QTL. 广东农业科学. 2022(09): 132-140 . 百度学术
5. 刘进，胡佳晓，马小定，陈武，勒思，Jo Sumin，崔迪，周慧颖，张立娜，Shin Dongjin，黎毛毛，韩龙植，余丽琴. 水稻RIL群体高密度遗传图谱的构建及苗期耐热性QTL定位. 中国农业科学. 2022(22): 4327-4341 . 百度学术
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