• 《中国科学引文数据库(CSCD)》来源期刊
  • 中国科技期刊引证报告(核心版)期刊
  • 《中文核心期刊要目总览》核心期刊
  • RCCSE中国核心学术期刊

硝磺草酮降解菌HZ-2制剂固定化载体材料性能的比较

张晶晶, 杨孟然, 刘婕, 蒋刚彪, 钟国华

张晶晶, 杨孟然, 刘婕, 蒋刚彪, 钟国华. 硝磺草酮降解菌HZ-2制剂固定化载体材料性能的比较[J]. 华南农业大学学报, 2016, 37(3): 86-89. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2016.03.013
引用本文: 张晶晶, 杨孟然, 刘婕, 蒋刚彪, 钟国华. 硝磺草酮降解菌HZ-2制剂固定化载体材料性能的比较[J]. 华南农业大学学报, 2016, 37(3): 86-89. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2016.03.013
ZHANG Jingjing, YANG Mengran, LIU Jie, JIANG Gangbiao, ZHONG Guohua. Pexformance comparison of different carrier materials for immobilization of mesotrione-degrading strain HZ-2[J]. Journal of South China Agricultural University, 2016, 37(3): 86-89. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2016.03.013
Citation: ZHANG Jingjing, YANG Mengran, LIU Jie, JIANG Gangbiao, ZHONG Guohua. Pexformance comparison of different carrier materials for immobilization of mesotrione-degrading strain HZ-2[J]. Journal of South China Agricultural University, 2016, 37(3): 86-89. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2016.03.013

硝磺草酮降解菌HZ-2制剂固定化载体材料性能的比较

基金项目: 

广东省科技计划项目 2014B020206003

详细信息
    作者简介:

    张晶晶(1993—),女,硕士研究生,E-mail:784224089@qq.com

    通讯作者:

    钟国华(1973—),男,教授,博士,E-mail: guohuazhong@scau.edu.cn

  • 中图分类号: S482.2

Pexformance comparison of different carrier materials for immobilization of mesotrione-degrading strain HZ-2

  • 摘要:
    目的 

    研究改性蔗渣MSB、MSB-Mo、MSB-Cl对硝磺草酮降解菌HZ-2的降解能力的影响。

    方法 

    以这3种改性蔗渣和活性炭为固定化载体,对固定化后菌制剂的降解性能进行研究。

    结果 

    降解菌制剂培养48 h后,D600 nm均较高,表明MSB、MSB-Mo、MSB-Cl及活性炭均具备较强的固菌能力;培养3 d后,以改性蔗渣为载体的固菌制剂对LB培养基中硝磺草酮的降解率高于85%,显著优于活性炭,其中改性蔗渣MSB-Mo效果突出,降解率达96.35%。添加葡萄糖辅料7 d后,这3种改性蔗渣对土壤中硝磺草酮的降解率均高于99%。

    结论 

    改性蔗渣MSB-Mo是固定降解菌株的最佳新型生物载体材料。

    Abstract:
    Objective 

    To evaluate the effect of modified bagasse (MSB, MSB-Mo and MSB-CI) on the immobilization of mesotrione-degrading bacteria strain HZ-2.

    Method 

    Three types of modified bagasse and activated carbon were selected as the carrier candidates for the bacterial immobilization, and the degradation abilities of immobilized composites were examined.

    Result 

    After 48 hours culture, the high D600 nmvalues indicated that modified bagasse(MSB, MSB-Mo and MSB-CI) and activated carbon had strong abilities to immobilize bacteria. More than 85% of mesotrione in LB medium was degraded using modified bagasse as a carrier after 3 days of culture, which was higher than the results of activated carbon. MSB-Mo composite had the best degradation performance with a degradation rate of 96.35%.Moreover, mesotrione in soil was degraded over 99% after 7 days by adding glucose as support nutrient to the modified bagasse.

    Conclusion 

    Modified bagassse MSB-Mo is the most available carrier material, which demonstrates the highest potential of being a new biological carrier material for immobilization of mesotrione-degrading bacteria strain.

  • 随着纳米生物技术的迅速发展,纳米材料可作为基因载体,通过包裹、静电吸附及化学键作用等方式负载外源基因[1-3],通过细胞吞噬作用将其传送到细胞内,使基因成功表达[4]。与其他纳米载体相比,磁性纳米载体具有超顺磁性优势[5],在磁场作用下可快速负载、运输目的基因[6]。有研究表明外源基因成功整合到基因组中需要通过3个细胞屏障:细胞膜、溶酶体和细胞核[7],影响整合效率的关键因素是避开溶酶体的消化作用[8-9],纳米载体的表面电荷[10]、粒径大小[11]和修饰功能基团[12]等是影响整合效率的重要因素。有学者提出纳米载体基因复合物可通过“质子海绵效应”免受溶酶体的消化作用[13-14]

    纳米载体基因传输技术为动植物遗传育种提供了新思路,Wang等[15]将磁性纳米载体与精子介导的基因转染相结合,获得了转基因小鼠。Zhao等[16]利用磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticle,MNP)作为基因载体,负载pGBIF4ABCΔα质粒,在磁场作用下磁转染棉花花粉,成功筛选到转融合抗虫基因的棉花。随着CRISPR基因编辑和修饰技术的使用,磁性纳米颗粒会是将生物分子传送到植物体内进行基因编辑和修饰的最佳平台[17]

    本研究选用MNP作为基因载体,负载质粒pRGEB32,构建了不同质量比的纳米载体−基因复合物MNP−pRGEB32。通过琼脂糖凝胶电泳阻滞试验评价和分析了MNP对pRGEB32的结合和保护能力。通过纳米粒度分析仪、Zeta电位分析仪、透射电子显微镜和原子力显微镜对MNP和MNP−pRGEB32复合物的粒径、表面电位、形貌、分布等进行了检测和观察,研究了MNP−pRGEB32复合物的生物物理特性、基因负载形态与负载机理,以期为MNP负载CRISPR/Cas9表达载体的应用提供依据。

    MNP poly MAG1000购自德国Chemicell公司;DNase I购自TaKaRa公司;无内毒素质粒大提试剂盒购自TIANGEN生物技术有限公司;含CRISPR/Cas9表达载体pRGEB32[18]的大肠埃希菌 Escherichia coli DH5α由国家植物航天育种工程技术研究中心保存;核酸染料GelRed购自美国Biotium公司。

    取pRGEB32(15 888 bp)大肠埃希菌菌液加入到含50 ng/µL卡那霉素的LB液体培养基(每升培养基含酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g)中,于37 ℃、220 r/min培养16 h,按照TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒说明书提取质粒。利用超微量紫外分光度计测定质粒DNA的浓度和纯度,选取D260 nm/D280 nm≈1.8的质粒DNA于−20 ℃贮存备用。

    pRGEB32质量固定为4 μg,将poly MAG1000和pRGEB32按照质量比为1∶1、1∶4、1∶8、1∶16、1∶24、1∶40、1∶50混合,于37 ℃条件下培育30 min,连接制备MNP−DNA复合物。

    将MNP−pRGEB32复合物点样在8 g/L的琼脂糖凝胶(含7 µL 荧光染料GelRed)上,在TAE缓冲液中于130 V电泳30 min,然后在凝胶成像仪上观察,分析MNP对pRGEB32的负载能力;同时,将MNP−pRGEB32复合物在37 ℃分别用DNase I酶切4 h,用Hind III和Bsa I双酶切16 h,然后电泳跑胶,分析对MNP对pRGEB32的保护能力。

    将MNP和pRGEB32按照质量比为1∶1、1∶4、1∶8制备的MNP−pRGEB32复合物分别用超纯水稀释至0.001 µg/µL,采用纳米粒度分析仪及Zeta电位分析仪分析粒度分布及Zeta电位。

    吸取MNP和MNP、pRGEB32质量比为1∶1的MNP−pRGEB32复合物,用超纯水分别稀释至0.001 μg/μL,各取10 μL均匀滴加到干净的碳膜覆盖的铜网上,用滤纸吸干多余的液体,静置晾干30 min,用20 g/L的磷钨酸负染1 min,置于干净的培养皿中自然干燥,然后在透射电子显微镜下观测形态并拍照。

    吸取MNP和pRGEB32质量比为1∶1的MNP−pRGEB32复合物,用超纯水稀释至0.01 μg/μL,取10 μL均匀滴加到新剥离的云母片表面,置于干净的培养皿中自然干燥,然后在原子力显微镜下扫描成像,用NanoScope Analysis 1.5在Height Sensor模式下分析图像。

    MNP和pRGEB32质量比为1∶1、1∶4、1∶8、1∶16时,MNP与pRGEB32完全结合,泳道中无游离的pRGEB32;质量比为1∶24、1∶40、1∶50时,逐渐减少的MNP难以负载逐步增多的pRGEB32,形成的MNP−pRGEB32复合物较少,过量的pRGEB32在泳道中呈现明显条带(图1)。结果表明MNP能有效装载相当于自身质量16倍的pRGEB32。

    图  1  MNP−pRGEB32复合物电泳分析
    M:DNA marker; 1:纯质粒pRGEB32; 2~8:MNP−pRGEB32复合物,质量比分别为1∶1、1∶4、1∶8、1∶16、1∶24、1∶40、1∶50
    Figure  1.  Electrophoreses analyses of MNP-pRGEB32 complexes
    M: DNA marker; 1: Pure plasmid pRGEB32; 2-8: MNP-pRGEB32 complexes at mass ratios of 1∶1, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶24, 1∶40 and 1∶50 respectively

    MNP−pRGEB32复合物用核酸酶DNase I处理4 h后,质量比为1∶1、1∶4、1∶8、1∶16的复合物样品仍停留在点样孔,纯质粒及质量比为1∶24、1∶40、1∶50的复合物样品中过量的DNA被完全消化,完全结合的MNP−pRGEB32复合物停留在点样孔(图2)。MNP−pRGEB32复合物用Hind III和Bsa I双酶切16 h后,纯质粒及质量比为1∶24、1∶40、1∶50的复合物样品中过量的DNA随电场迁移,被限制性内切酶 Hind III和Bsa I切开形成2条线性质粒条带,MNP−pRGEB32复合物质量比为1∶1、1∶4、1∶8、1∶16的泳道没有DNA痕迹,说明MNP−pRGEB32复合物没有被酶切割(图3)。结果证明MNP能保护其负载的pRGEB32免受酶促降解。

    图  2  MNP−pRGEB32复合物用DNase I酶切处理的电泳分析
    M:DNA marker; 1:纯质粒pRGEB32; 2~8:MNP−pRGEB32复合物,质量比分别为1∶1、1∶4、1∶8、1∶16、1∶24、1∶40、1∶50
    Figure  2.  Electrophoresis analyses of MNP-pRGEB32 complexes digested with DNase I
    M: DNA marker; 1: Pure plasmid pRGEB32; 2-8: MNP-pRGEB32 complexes at mass ratios of 1∶1, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶24, 1∶40 and 1∶50 respectively
    图  3  MNP−pRGEB32复合物用Hind III和Bsa I双酶切处理的电泳分析
    M: DNA marker; 1:纯质粒pRGEB32; 2~8: MNP−pRGEB32复合物,质量比分别为1∶1、1∶4、1∶8、1∶16、1∶24、1∶40、1∶50
    Figure  3.  Electrophoresis analyses of MNP-pRGEB32 complexes digested with Hind III and Bsa I
    M: DNA marker; 1: Pure plasmid pRGEB32; 2-8: MNP-pRGEB32 complexes at mass ratios of 1∶1, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶24, 1∶40 and 1∶50 respectively

    纳米粒度及Zeta电位分析仪结果显示,MNP的平均疏水粒径为127.5 nm,Zeta电位为12.1 mV,在结合带负电的pRGEB32后,MNP−pRGEB32复合物的粒径增大,Zeta电位降低(图4)。随着结合的pRGEB32的量逐渐增加,MNP−pRGEB32复合物的粒径也逐渐增加,Zeta电位逐渐降低。结果说明MNP能通过静电作用负载pRGEB32,并能有效地结合和负载pRGEB32形成纳米载体基因复合物。

    图  4  MNP和MNP−pRGEB32复合物的粒径及Zeta电位分析
    Figure  4.  Size distribution and Zeta potential of MNP and MNP-pRGEB32 complex

    透射电镜下MNP为规则球形,分散性较好,粒径约10~150 nm(图5a)。中心深色部分为磁性氧化铁核心,外层附有阳离子PEI膜包裹(图5b)。MNP与pRGEB32结合后大量的pRGEB32被压缩、吸附、聚集在纳米颗粒表面(图5c5d)。试验表明MNP可携带大量的pRGEB32,从而作为外源基因转移的载体。

    图  5  MNP和MNP−pRGEB32复合物的透射电镜图像
    Figure  5.  Transmission electron microscope images of MNP and MNP-pRGEB32 complex

    原子力显微镜观察到MNP周围吸附了杆状的pRGEB32,以载体颗粒为中心,越靠近中心浓度越高,呈放射状向外扩展(图6),与透射电镜观测的形态相符合。这种高浓度的聚集有利于载体颗粒携带大量的pRGEB32,从而通过细胞的吞噬作用将外源基因传送至细胞内部。

    图  6  MNP−pRGEB32复合物的原子力显微镜图像
    Figure  6.  Atomic force microscope images of MNP and MNP-pRGEB32 complex

    纳米技术已经与许多学科交叉研究,具有巨大的潜在价值,已经广泛应用于生物及医学领域[19-21]。理想的基因载体应该能有效地负载外源核酸,具有较高的生物相容性,在细胞质内可以有效保护外源核酸免受酶促降解,使其最终能实现高效表达[22-23]。琼脂糖凝胶电泳阻滞试验显示了MNP高效负载pRGEB32的能力,并能够有效保护pRGEB32免受核酸酶降解作用。有研究推测可能是DNA和纳米载体结合后导致DNA构象发生变化,阻止Mg2+、核酸酶与DNA接触,从而保护DNA免受酶的消化作用[24-25]。通过粒度分布和Zeta电位测试显示MNP结合pRGEB32后,粒径增大,电位降低,说明二者通过静电相互作用形成了MNP−pRGEB32复合物。透射电镜和原子力显微镜的观测证实pRGEB32被吸附压缩后聚集在MNP表面[26],这种压缩和高浓度的聚集,使载体能够有效地负载和保护pRGEB32。通过上述结果可知,MNP在负载、聚集和保护pRGEB32方面表现优越,是一种理想的基因载体。

    有研究通过磁性纳米载体负载外源基因,将外源基因整合到生殖细胞中,外源基因能在后代稳定遗传[16]。同时有研究证明可以利用CRISPR/Cas9编辑性细胞基因组,如Chapman等[27]利用CRISPR/Cas9直接编辑大鼠的精原细胞,产生纯合非镶嵌突变后代。若能将纳米材料和CRISPR基因编辑技术有效结合,直接对动植物生殖细胞定向编辑,将克服传统方式中部分物种基因转化困难、育种周期长等瓶颈问题。本试验证实磁性纳米载体能有效结合CRISPR编辑系统,为探索基于磁性纳米载体定向编辑技术的研究奠定了基础。

  • 图  1   载体固菌制剂对土壤硝磺草酮的降解作用

    柱子上凡具有一个相同字母者, 表示差异不显著(P>0.05, DMRT法)。

    Figure  1.   Degradation of mesotrione in soil by immobilized microbial preparations

    图  2   添加葡萄糖后改性蔗渣固菌制剂对土壤硝磺草酮的降解作用

    相同时间、不同柱子上凡具有一个相同字母者,表示差异不显著(P>0.05, DMRT法)。

    Figure  2.   Degradation of mesotrione in soil by modified bagasse as immobilized microbial preparations after adding glucose

    表  1   供试载体材料固菌后的D600 nm

    Table  1   D600 nm of tested carrier material after immobilizing bacteria

    下载: 导出CSV
  • [1] 苏少泉.硝磺酮的开发、选择性及生物学特性[J].农药研究与应用, 2009, 13(5):1-6. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK200902704641
    [2]

    STEPHENSON D O, BOND J A, WALKER E R, et al. Evaluation of mesotrione in Mississippi Delta corn production[J]. Weed Technol, 2004, 18(4):1111-1116. doi: 10.1614/WT-03-260R1

    [3]

    BAFISSON I, CROUZET O, BESSE-HOGGAN P, et al. Isolation and characterization of mesotrione-degrading Bacillus sp. from soil[J]. Environ Pollut, 2009, 157(4):1195-1201. doi: 10.1016/j.envpol.2008.12.009

    [4]

    SARMAH A K, SABADIE J. Hydrolysis of sulfonylurea herbicides in soils and aqueous solutions: A review[J]. J Agr Food Chem, 2002, 50(22):6253-6265. doi: 10.1021/jf025575p

    [5] 朱鲁生, 辛承友, 王倩, 等.莠去津高效降解细菌HB-5的固定化研究[J].农业环境科学学报, 2006, 25(5):1271-1275. doi: 10.3321/j.issn:1672-2043.2006.05.035
    [6] 王建龙.生物固定化技术与水污染控制[M].北京:科学出版社, 2002:15-18.
    [7] 窦晶晶, 冯贵颖, 呼世斌, 等.一株多菌灵降解菌包埋条件及降解特性[J].中国环境科学, 2011, 31(3):431-436. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zghjkx201103014
    [8] 张建辉, 孔瑛, 侯影飞, 等.聚乙烯醇包埋石油脱硫菌UP-2的研究[J].中国环境科学, 2006, 26(S1):92-96. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zghjkx2006z1023
    [9]

    HOCHSTRAT R, CORVINI P F X, WINTGENS T. MINOTAURUS: Microorganism and enzyme immobilization: Novel techniques and approaches for upgraded remediation of underground, wastewater and soil[J]. Rev Environ Sci Bio, 2013, 12(1):1-4. doi: 10.1007/s11157-012-9293-8

    [10] 王允圃, 李积华, 刘玉环, 等.甘蔗渣综合利用技术的最新进展[J].中国农学通报, 2010, 26(16):370-375. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zgnxtb201016075
    [11]

    HANDE A, MAHAJAN S, PRABHUNE A. Evaluation of ethanol production by a new isolate of yeast during fermentation in synthetic medium and sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate[J]. Ann Microbiol, 2013, 63(1):63-70. doi: 10.1007/s13213-012-0445-4

    [12] 李艳红, 李英利, 解庆林, 等.固定化混合菌处理高盐含油废水[J].环境工程, 2012, 30(1):18-21. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK201200119450
    [13] 韩海涛, 刘婕, 高云飞, 等.硝磺草酮降解菌的分离鉴定及其降解特性[J].华中农业大学学报, 2013, 32(3):62-66. doi: 10.3969/j.issn.1000-2421.2013.03.012
    [14] 何连芳, 陈翠锦, 林钻涛, 等.甘蔗渣接枝四乙烯五胺制备治理印染废水的新型吸附剂[J].生态科学, 2011, 30(4):441-445. doi: 10.3969/j.issn.1008-8873.2011.04.013
    [15]

    HANDE P L, GHIMIRE K N, INOUE K. Adsorption behavior of heavy metals onto chemically modified sugarcane bagasse[J]. Bioresource Technol, 2010, 101(6):2067-2069. doi: 10.1016/j.biortech.2009.11.073

    [16] 马尧. 高效阿特拉津降解菌的固定化方法筛选与优化[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2010. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10224-2010264364.htm
    [17] 胡金星, 苏晓梅, 韩慧波, 等.固定化微生物技术修复多氯联苯污染土壤的应用前景[J].应用生态学报, 2014, 25(6):1806-1814. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/yystxb201406037
    [18]

    LU L P, ZHANG B B, XU G R. Efficient conversion of high concentration of glycerol to monacolin-k by solid-state fermentation of Monascus purpureus using bagasse as carrier[J]. Bioproc Biosyst Eng, 2013, 36(3):293-299. doi: 10.1007/s00449-012-0784-3

    [19] 孔祥平, 贺爱永, 陈佳楠, 等.化学改性甘蔗渣对固定化细胞发酵产丁醇的影响[J].生物工程学报, 2014, 30(2):305-309. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/swgcxb201402015
    [20]

    BASAK B, BHUNIA B, DEY A. Studies on the potential use of sugarcane bagasse as carrier matrix for immobilization of Candida tropicalis PHB5 for phenol biodegradation[J]. Int Biodeter Biodegr, 2014, 93:107-117. doi: 10.1016/j.ibiod.2014.05.012

图(2)  /  表(1)
计量
  • 文章访问数: 
  • HTML全文浏览量:  0
  • PDF下载量: 
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2015-07-04
  • 网络出版日期:  2023-05-17
  • 刊出日期:  2016-05-09

目录

/

返回文章
返回