In vitro propagation of Acacia mangium×A. auriculiformis
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摘要:目的
提高马大杂种相思Acacia mangium×A. auriculiformis良种的快速繁殖效率与推广种植力度.
方法以马大杂种相思新生枝条带腋芽茎段为外植体，研究马大杂种相思组培快繁体系.
结果和结论用质量分数为0.1%的升汞和体积分数为75%的乙醇分别处理当年新生枝条第3~5个腋芽茎段15 min和30 s，然后接种至MS培养基进行初代培养，芽诱导率为95.68%；最佳增殖培养基为改良MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 ~40 g·L-1，35 d的有效增殖倍数为3.97；将增殖芽接入含IBA 600 mg·L-1的MS固体培养基上预培养4~8 h后转接至无激素1/2 MS培养基上，15 d即可全部生根；或将增殖芽直接接入1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1生根培养基上，第15天时生根率为99.43%.将生根苗移栽至以黄心土为基质的营养袋内，存活率为94.67%.
Abstract:ObjectiveTo improve the propagation efficiency and extend the planting of Acacia mangium×A. auriculiformis.
MethodThis study was carried out to explore the techniques of in vitro propagation of A.mangium×A. auriculiformis using stem segments with buds collected from 16-year plants as the explant.
Result and conclusionCurrent season stem segments carrying 3-5 axillary buds were sterilized with w=0.1% mercuric chloride and φ＝75% alcoho1 for 15 min and 30 s respectively before they were inoculated onto MS medium. Buds could be induced successfully on MS with a shooting rate of 95.68%. The bud proliferation index was 3.97 after being transferred onto MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+ sucrose 30-40 g·L-1 for 35 d. The buds all rooted on the 15th day from inoculation onto 1/2 MS medium after pre-cultured on MS supplemented with IBA 600 mg·L-1 for 4-8 h. Inoculating the proliferated buds onto 1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+sucrose 30 g·L-1 also generated a high rooting rate of 99.43%. The survival rate reach 94.67% after the rooted plantlet are transplanted to the yellow soil medium.
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马大杂种相思Acacia mangium×A. auriculiformis属含羞草科Mimosaceae金合欢属Acacia[1]，主要分布在气温12~35 ℃, 年降水量1 200~1 850 mm和海拔50~350 m的地区[2].马大杂种相思具速生、固氮、涵养水源、极度抗瘠薄等优点，且树干通直、分枝细小，是城市绿化、营造高效生态混交林的优良种植材料，近年来在我国南方逐渐受到重视.
目前，对马大杂种相思离体快繁技术研究已有报道，但这些研究对选择具有优良性状的母株作为外植体来源缺乏重视[3]；且有效增殖倍数低、芽苗质量较差、增殖芽可用于生根诱导的数量极少[4]；移栽存活率仅80.4%[5].本试验从马大杂种相思多年生试验林中进行单株选优，对其离体快繁技术进行了系统研究，成功建立了高效、高质的快繁体系，可应用于工厂化育苗，为马大杂种相思的良种选育及推广种植奠定基础.
1. 材料与方法
1.1 植株来源和试验材料
选取马大杂种相思16年生抗风直杆型优良单株(AMA12001)，先通过扦插繁殖获得较多的无性系材料，然后以其当年新生枝条的带腋芽茎段为外植体进行研究.
1.2 试验方法
1.2.1 外植体消毒和初代培养
最佳消毒时间的确定：于质量分数为0.1%的升汞溶液中分别处理外植体9、12、15 min, 再分别用体积分数为75%的乙醇处理5、15、30 s，无菌水冲洗4~6次.
最佳外植体部位的确定：分别将枝条的第1~2节嫩茎(上)、第3~5节嫩茎(中)、第7~8节嫩茎(下)剪成长1.0~2.0 cm带腋芽茎段.
将消毒后的外植体接种在MS培养基上，每个处理接种60瓶，每瓶接种1株芽，重复3次，15 d后统计存活率和出芽率.
1.2.2 丛生芽诱导和增殖培养
6-BA、NAA单因子对增殖的影响：6-BA选择0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1 4个质量浓度，探讨细胞分裂素对增殖的影响；NAA选择0.05、0.10、0.50 mg·L-1 3个质量浓度，附加6-BA 1.0 mg·L-1，探讨生长素对增殖的影响.
6-BA、NAA不同质量浓度组合对增殖的影响：设置培养基中的6-BA与NAA质量比例为40:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、2:1，探讨细胞分裂素与生长素不同质量浓度比例组合对增殖的影响.
基本培养基、活性炭质量浓度、糖浓度单因子对增殖的影响：基本培养基类型选择MS、1/2MS、改良MS; 糖质量浓度选择20、30和40 g·L-1；活性炭选择0.1、0.5和1.0 mg·L-1.以上培养基均附加上一步骤筛选出的最佳激素浓度配比.
每处理均接种20瓶，每瓶接种3株芽，重复3次，35 d后调查增殖倍数.
1.2.3 最佳生根方法筛选
高质量浓度激素浸泡法：将长2~3 cm的增殖芽在添加IBA 200、400、600、800和1 000 mg·L-15个质量浓度的固体培养基上分别预培养4和8 h后，转接入1/2MS培养基中继续培养.
低质量浓度激素诱导法：将长2~3 cm的增殖芽接入含不同类型基本培养基、不同质量浓度活性炭及蔗糖、不同低质量浓度激素的培养基中进行不定根的诱导.
每个处理均接种20瓶，每瓶接种3株芽，重复3次，培养15 d后统计生根率、生根条数.
1.2.4 移栽和驯化
生根培养10~15 d后，炼苗5~10 d，洗净根部的培养基后移栽到经消毒过的营养袋中，移栽基质选择黄心土.
1.3 培养条件
以上试验除特殊说明外，增殖培养以MS为基本培养基，生根培养以1/2MS为基本培养基，均添加琼脂7 g·L-1、蔗糖30 g·L-1，控制pH为5.5~6.5，培养基均在121 ℃高压灭菌15 min，培养温度为(25±2) ℃，每日光照12 h，光照度2 500 lx.
1.4 统计分析
使用Excel、SPSS18.0对数据进行处理和方差分析，以最小显著差数法(LSD)评价差异的显著性.
2. 结果与分析
2.1 外植体消毒对初代培养的影响
2.1.1 不同处理时间对初代培养的影响
带腋芽茎段是最理想的组培外植体材料，其诱导的芽遗传变异小，能保持亲本的优良性状[6].本试验以带腋芽茎段为外植体，消毒效果见表 1.处理1至处理3(升汞消毒9 min)的消毒时间偏短，导致污染率偏高，存活率偏低；随着升汞消毒时间的增加，污染率逐渐降低，存活率逐渐上升，当选用15 min升汞配合30 s乙醇(处理9)消毒时，其褐化率虽然较高，但污染率仅6.67%，存活率达78.33%，是最适宜的消毒方案.
表 1 升汞及乙醇不同处理时间对初代培养的影响1)Table 1. Effects of sterilization time on initial culture
2.1.2 不同部位的外植体对初代培养的影响
外植体污染率、褐化率和芽诱导率受枝条的木质化程度影响较大.木质化程度越高，污染率越高，新生顶芽内生菌含量少，但材质娇嫩，容易被消毒剂杀死.枝条中上部半木质化的茎段出芽率高[7]，且污染率低[8]，本试验(表 2)也发现中段(第3~5个腋芽)半木质化茎段污染率和褐化率都较低，且出芽率较高，因而当年生新枝第3~5个腋芽茎段是理想的外植体材料.
表 2 不同外植体来源及部位对初代培养的影响1)Table 2. Effects of different sampling positions on initial culture
综上所述，剪取枝条的中部(第3~5个腋芽)作为外植体，用体积分数为75%的乙醇和质量分数为0.1%的升汞分别消毒30 s、15 min，是获得马大杂种相思无菌材料的最佳途径.将无菌茎段接入MS基本培养基初代培养10 d后，腋芽开始萌动，30 d调查时新芽长约为2~4 cm(图 1A)，可用于增殖培养.
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图 1 马大杂种相思快繁体系A：初代培养；B：增殖培养；C：生根培养；D：移栽.Figure 1. Processes of in vitro propagation of Acacia mangium×A. auriculiformis2.2 丛生芽诱导与增殖培养基筛选
2.2.1 6-BA、NAA单因子对增殖的影响
增殖培养10 d左右从基部腋芽处开始冒出新芽，且茎段基部逐渐变粗.第35天时调查可知(表 3)，增殖倍数随6-BA浓度的增加而增加，当6-BA质量浓度为1.0~1.5 mg·L-1时，增值倍数均达到3以上，且6-BA质量浓度为1.5 mg·L-1时，增殖倍数较高，芽长势较好；但当质量浓度达到2.0 mg·L-1时，芽玻璃化现象严重，有效芽减少.而NAA对芽生长起主要作用，随着NAA质量浓度的升高，芽体长势变好，当NAA质量浓度为0.5 mg·L-1时，芽生长健壮，生长速度快，但增值倍数低；而NAA质量浓度为0.1 mg·L-1时的增殖倍数最高，芽的长势也较好.
表 3 不同比例的6-BA、NAA对增殖的影响Table 3. Effects of various concentrations of 6-BA and NAA on proliferation
2.2.2 6-BA、NAA不同浓度组合对增殖的影响
腋芽的增殖不只受6-BA和NAA的绝对值影响，还受二者的比值影响[9]，试验结果经方差分析表明，6-BA与NAA的质量比对马大杂种相思增殖倍数的影响达到极显著水平，增殖倍数随着二者比值的增加呈先上升后下降的趋势，m(6-BA):m(NAA)在2:1至10:1范围时，增殖倍数普遍较低，但芽的长势健壮，生长速度快.m(6-BA):m(NAA)为20:1至40:1时，腋芽处萌发出大量的丛生芽，但芽丛矮小，玻璃化现象严重，有效芽数目随比值的增加而减少，因此，在此质量比范围时，增殖倍数呈现下降趋势，且芽品质变差.而当m(6-BA):m(NAA)为15:1时(即6-BA为1.5 mg·L-1、NAA为0.10 mg·L-1)，诱导的增殖芽一方面具有长势健壮的特点，又具有较高增殖倍数的优势，是试验筛选出较适宜的激素浓度比例.
表 4 6-BA与NAA不同质量浓度组合对增殖的影响Table 4. Effects of different combinations of 6-BA and NAA on proliferation
2.2.3 基本培养基、活性炭浓度、糖浓度单因子对增殖的影响
由表 5可知，活性炭、蔗糖质量浓度对增殖的影响达极显著水平，而培养基类型对增殖的影响不显著.随着活性炭质量浓度的增加，增殖倍数明显下降，但芽生长情况越来越好，甚至有部分芽开始生根，因此，当发现增殖芽出现玻璃化现象时，可将芽转移至添加有较低质量浓度活性炭(0.04 g·L-1)的培养基中进行增殖培养，从而改善增殖芽质量；随着蔗糖质量浓度的增加，玻璃化现象也会得到缓解，有效芽数增多，芽的健壮程度也提升，当蔗糖质量浓度为30和40 g·L-1时显著优于蔗糖为20 g·L-1时的增殖效果，不仅增殖倍数较高，芽长势也较好；试验发现，虽然培养基类型对增殖倍数影响不大，但改良MS上的芽叶片更绿，生长也更健壮.
表 5 不同添加剂对增殖的影响Table 5. Effects of different additives on proliferation
综合以上试验结果，马大杂种相思比较适宜的增殖培养基为改良MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30~40 g·L-1，培养35 d可获得3.97的有效增殖倍数，且芽体较健壮(图 1B).在工厂化生产中，多次继代需要添加适量的Ac来改善芽苗生长情况，减小玻璃化现象发生.
2.3 生根诱导
2.3.1 高质量浓度激素浸泡法(两步生根法)
将在含有高质量浓度IBA的MS培养基预培养4、8 h的芽接入无激素的MS培养基后，第5天即可见白色圆点冒出，第10天时调查结果见表 6.两步生根法生根效果普遍较好，不仅生根率高，平均生根数也较多.虽然不同质量浓度的IBA对生根率的影响达显著、极显著水平，但IBA200~800 mg·L-14个组诱导的生根效果总体差异不显著，芽长势也无明显区别；随着IBA质量浓度的升高，生根率呈先上升后下降趋势，而生根数逐渐增多，当IBA为1 000 mg·L-1时，基部形成大量愈伤组织，根系过于发达，导致苗长势较差(表 6).比较发现，4和8 h的预培养时间对生根效果并无显著差别，但预培养8 h的芽生根数略多，总体的生根率也较高.当选择IBA 600 mg·L-1预培养4~8 h后再转接至MS中，生根率可达100%，且苗较健壮，是较好的处理方法.
表 6 两步生根法结果1)Table 6. Results of the two-step rooting method
2.3.2 低质量浓度激素诱导法
将2~3 cm长的增殖芽接入Ⅰ型至Ⅵ型生根培养基中，4~5 d后基部出现白点，6~7 d开始生根，15 d根最长, 可达6.5 cm.由表 7可知，Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅵ型这3种培养基的生根效果均极显著高于另3种培养基，而添加了0.1和0.5 mg·L-1活性炭的Ⅱ型和Ⅲ型培养基虽然平均根长要远高于其他组，但生根率却比不添加活性炭的低17.07%和40.50%；此外，蔗糖质量浓度为30 g·L-1的生根效果(Ⅰ)要优于10 g·L-1(Ⅳ)；1/2 MS(Ⅴ)比MS(Ⅰ)更利于不定根的诱导；IBA 1.5 mg·L-1(Ⅵ)比IBA 1.0 mg·L-1(Ⅴ)诱导的根数要多，但根系太发达反而会抑制苗的生长；由此可见，不添加活性炭的Ⅴ型培养基诱导马大杂种相思不定根效果最好，不仅生根率达99.4%，且根系较长，有须根，苗健壮.
表 7 不同培养基的生根效果1)Table 7. Effects of different media on rooting
综上所述，马大杂种相思增殖苗生根可采用2种办法.方法1，用两步生根法，将增殖苗接入含IBA600 mg·L-1的固体培养基上预培养4-8 h后接种到1/2MS基本培养基上，15 d即可全部生根.方法2，直接将较健壮的增殖苗接入1/2 MS + IBA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1培养基上，第15天时生根率可达99.43%(图 1C).从节约成本，缩减操作程序的角度出发，方法2更利于工厂化生产.
2.4 驯化与移栽
生根培养10~15 d后，苗长至2~4 cm，根长达2~3 cm，在自然条件下炼苗5~10 d后，将苗根部的培养基洗净，移植于经高锰酸钾消毒过的5种基质的营养袋中，5种基质分别为：黄心土、黄心土:沙(体积比分别为3:1、2:1、1:1)、沙，盖膜保湿.1周后揭开薄膜，1个月后调查其存活率分别为94.67%、94.00%、96.00%、96.00%、93.33%，均在90%以上(图 1D)，以黄心土:沙(体积比为2:1、1:1)生根率最高，在实际生产过程中，含沙量较多的营养杯在上山造林的运输过程中，容易松散，使得造林存活率低，因而，移栽基质应尽可能考虑黄心土.至此，马大杂种相思的组培快繁体系基本建立(图 1).
3. 讨论与结论
3.1 影响外植体消毒的相关因子
外植体消毒成功与否，不仅与消毒剂的处理时间有关，也与外植体采集时间、外植体部位等因素有关，本试验发现半木质化枝条的中上部节段是最理想的外植体部位，春末夏初的晴朗天气采条可以降低污染.与赵建萍等[10]、张玮等[11]的研究结果一致.
3.2 影响增殖效果的相关因子
想要获得高增殖倍数和短增殖时间，必须选择合适的细胞分裂素和生长素质量浓度[12].本试验发现6-BA 1.5 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1是最佳的适宜马大杂种相思增殖的激素质量浓度，不仅增殖倍数较高，芽体也较健壮.
较高的激素质量浓度易使芽玻璃化，且外源调节剂对植物作用的时效较长[13]，多次继代会使芽苗增殖缓慢、质量变差，可通过改变基本培养基类型、适当提高蔗糖质量浓度、适当降低激素质量浓度、添加低质量浓度的活性炭解决.
3.3 影响生根效果的相关因子
IBA与NAA组合使用可明显提高生根率，改善根的质量和苗的生长情况[14]，本研究也证明，用IBA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1可获得较好的生根效果.
Otroshy等[15]认为合适质量浓度的活性炭可提供暗环境、吸附激素和其他有害物质，利于植株生长.本试验发现，活性炭的存在确实能促进苗的生长，但一定程度上抑制了马大杂种相思不定根的形成，导致生根率下降，具体机理还有待相关研究证明.
蔗糖是生根培养基的重要组成部分，对维持培养基的渗透压具有重要作用.本试验还发现降低蔗糖质量浓度对根的生长影响较大，10 g·L-1的蔗糖质量浓度对根的生长不利，且苗生长缓慢，在生根培养基中添加30 g·L-1的蔗糖生根效果更佳.
从节约生产成本、简化操作程序的角度来说，即使两步生根法可使马大杂种相思组培苗的生根率达到100%，却不宜采用，但对其他生根较困难的相思树种来说，是值得尝试的生根方法.
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图 1 马大杂种相思快繁体系
A：初代培养；B：增殖培养；C：生根培养；D：移栽.
Figure 1. Processes of in vitro propagation of Acacia mangium×A. auriculiformis
表 2 不同外植体来源及部位对初代培养的影响1)
Table 2 Effects of different sampling positions on initial culture
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表 3 不同比例的6-BA、NAA对增殖的影响
Table 3 Effects of various concentrations of 6-BA and NAA on proliferation
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表 4 6-BA与NAA不同质量浓度组合对增殖的影响
Table 4 Effects of different combinations of 6-BA and NAA on proliferation
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[1] FAO. Seed sources establishment and tree improvement project, Sabah, Malaysia[C] // PEDLEY L. Variation in acacia mangium Willd. Rome: Food and Agriculture Organization, 1982: 41-42.
[2] VOZZO J A. Tropical tree seed manual [M]. Washington D C: USDA Forest Service Agriculture Handbook 721, 2002: 899.
[3] 蔡玲, 王以红, 吴幼媚, 等.五种相思树组织培养研究[J].广西林业科学, 2003, 32(1): 24-26. doi: 10.3969/j.issn.1006-1126.2003.01.006 [4] 周丽华, 张华通, 刘颂颂, 等.相思杂种:莞屏1号离体快速繁殖的研究[J].广东林业科技, 1996, 12(3): 26-29. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/lykx201406007 [5] 熊建勇, 宗亦臣, 常金财, 等.马大相思茎段的组织培养[J].林业实用技术, 2011(9): 29-30. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/lysyjs201109012 [6] 汪长水.卷荚相思组培快繁技术研究[J].福建林业科技, 2009, 36(3): 92-97. doi: 10.3969/j.issn.1002-7351.2009.03.022 [7] 林来水. 黑木相思优良无性系离体培养与快速繁殖技术研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2008. [8] 谢寅峰, 张志敏, 尚旭岚, 等.青钱柳茎段腋芽萌发和丛生芽增殖[J].林业科学, 2011, 47(1): 50-55. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/lykx201101008 [9] 赵建萍, 柏新富, 蒋小满, 等.北高丛越桔芽器官离体培养与快繁体系的建立[J].林业科学, 2007, 43(5): 111-115. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/lykx200705019 [10] 张玮, 黄树燕, 谢锦忠, 等.花吊丝竹组培快繁育苗技术研究[J].林业科学研究, 2010, 23(6): 914-919. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/lykxyj201006021 [11] 曹孜义, 刘国民.实用植物组织培养技术教程[M].兰州:甘肃科学技术出版社, 2002: 52-53. [12] 阳莉, 石大兴, 麦苗苗, 等.蓝花楹组织培养与快速繁殖研究[J].热带亚热带植物学报, 2012, 20(1): 26-32. doi: 10.3969/j.issn.1005-3395.2012.01.005 [13] 唐凤鸾, 韦记青, 蒋运生, 等.黄花蒿组培快繁与种质离体保存的研究[J].热带亚热带植物学报, 2008, 16(5): 486-490. doi: 10.3969/j.issn.1005-3395.2008.05.015 [14] OTROSHY M, MORADI K, NEKOUEI K M. The effect of different cytokinins in propagation of Capsicum annuuml by in vitro nodal cutting[J]. Trakia J Sci, 2011, 9(3): 21-30.
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