航天水稻选育新品种——华航一号
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摘要: “华航一号”是华南农业大学1996年利用返地式卫星将稻种搭载15d,进行空间诱变选育而成的优质稻新品种,具有优质、高产、抗逆、广适等特性,于2001年通过广东省品种审定,审定编号为:粤审稻200108;并于2003年通过国家品种审定,审定编号为2003032,是我国第一个通过国家级品种审定的航天育种水稻新品种.目前,该品种已经申请国家农作物新品种权保护(申请编号为20040225.0).该品种属早、晚兼种型,全生育期早造123~126d,晚造105~108d.全省各地进行的较大面积的晚造生产表明,其产量、熟期、后期熟色等方面都表现甚佳.
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苦楝Melia azedarach又名翠树、楝树、紫花树、森树等,为楝科楝属落叶乔木,分布于中国、韩国、日本、印度、斯里兰卡、印度尼西亚和澳大利亚等地,欧洲、美洲也有栽培[1].苦楝在我国分布广泛,水平分布为北纬18° ~ 40°,南至海南省崖县,北到河北保定和山西运城、陕西渭南、陇南地区,东至台湾、沿海各省,西到四川、云南保山[2].它生长速度快、木材材质优良、纹理美丽,易加工,可用于家具、建筑、农具、船舶、乐器制作等方面,木材抗白蚁、抗虫蛀、耐腐.苦楝耐烟尘,能大量吸收有毒有害气体,是优良的城市及工矿区绿化树种,也是我国南方四旁绿化常用树种[3-4].苦楝的根、皮、花、果均可入药,也可作为植物源农药[5].遗传多样性是生物多样性的重要组成部分,SRAP(Sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)结合了AFLP及RAPD各自的优点,方便快速,只需要极少量DNA材料,且不需要预先知道DNA序列信息,即可快速获得大量的信息,试验结果稳定可靠,且再现性较高,重复性较好[6-7].目前为止,国内对于苦楝的遗传多样性分析,鲜见开展过SRAP的研究.本试验采用单因素和正交试验设计从DNA、dNTPs、Mg2+、引物和TaqDNA聚合酶5个组分浓度对苦楝SRAP-PCR反应体系进行优化,旨在寻找一种高效、快速、经济的试验方法,建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系,为进一步应用SRAP技术对苦楝群体遗传多样性、种质资源鉴定等研究提供参考[7].
1. 材料与方法
1.1 材料
苦楝幼叶于2013年7月取自华南农业大学苗圃,随用随采,用于苦楝基因组DNA的提取,采集叶片分别为海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸种源.所用正向引物序列为Me19(TGAGTCCAAACCGGTTG)和Me27(TGGGGACAACCCGGCTT),反向引物序列为Em2(GACTGCGTACGAATTTGC)、Em4(GACTGCGTACGAATTTGA)和Em5(GACTGCGTACGAATTAAC).
1.2 主要试剂和仪器
用于SRAP-PCR反应的Taq酶、dNTPs、Mg2+为TaKaRa公司产品,引物由北京华大基因研究中心合成,PCR反应在东胜创新生物技术有限公司的PCR扩增仪上进行,DNA浓度和纯度使用超微量紫外分光光度计(Thermo Nanodrop 2000)检测.
1.3 基因组DNA的提取
苦楝基因组DNA提取参照上海生工生物工程有限公司柱式基因组DNA提取试剂盒说明书进行.所提取的基因组DNA用8 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测品质,并采用超微量紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,然后将DNA稀释至50 ng·μL-1,置于-20 ℃条件下保存备用.
1.4 PCR扩增
SRAP-PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min.扩增产物采用20 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳,电泳后在自动凝胶图像分析仪上拍照分析.
1.5 PCR反应体系单因素分析
对影响苦楝SRAP-PCR反应的主要因素(模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物和Taq酶)进行单因子试验.对各影响因子分别设置8个梯度处理:模板DNA为0、10、20、30、40、50、60和70 ng;dNTPs为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mmol · L-1;Mg2+为0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mmol·L-1;引物为0、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56和0.64 μmol·L-1;Taq DNA聚合酶为0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 U.
1.6 PCR反应体系的正交试验
在对影响苦楝SRAP-PCR反应的模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物和Taq酶进行单因子试验后采用L16(45)正交试验设计,共16个处理,每个处理设2个重复,各因素水平见表 1.根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色进行打分.最优的得5分,最差的得1分,并计算每个因素在不同水平下的平均得分[8].
表 1 SRAP-PCR正交试验设计L 16(45)及试验结果Table 1. L 16(45) Orthogonal designs and results of SRAP-PCR reaction2. 结果与分析
2.1 单因素试验分析
以SRAP-PCR反应产物电泳得到的条带数目较多且清晰为筛选原则,对反应体系中起主要作用的5个因素进行单因素浓度梯度筛选试验[9-12],每个因素设置8个浓度梯度.试验结果表明:在25 μL反应体系中,模板DNA为25 ~ 40 ng、dNTPs为0.125 ~ 0.200 mmol·L-1、Mg2+为1.75 ~ 2.25 mmol·L-1、引物为0.40 ~ 0.52 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶为0.50 ~ 1.25 U时扩增效果好,条带较多且清晰,故将其选为后续正交试验的适宜浓度范围.
2.2 苦楝SRAP-PCR正交反应体系的优化
以上述单因素试验确定的各因素适宜浓度范围为基础,采用L 16(45)正交设计对SRAP-PCR反应体系进行优化(表 1),并根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色(图 1)对16个处理进行打分,打分结果如表 1所示,从2次的得分来看,重复间差异不大,试验的一致性较好,其中处理5、处理7、处理8和处理9效果较好,评分均为4分,而处理15效果不好,评分仅为1.0分.从图 2可见,模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L-1、Mg2+ 2.25 mmol·L-1、引物0.48 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U、反应总体积25 μL时得分较高,实现最佳扩增,确定为最优组合.
2.3 苦楝SRAP-PCR反应体系稳定性的检测
为了验证体系的准确性,以来自海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸的8个苦楝种源DNA为模板,选取引物Me27/Em2、Me27/Em4进行SRAP-PCR验证,其结果如图 3所示,每个种源对每个引物均有清晰的条带,且不同种源间条带有差异.由此可见,本试验建立的SRAP-PCR体系稳定可靠,适用于苦楝后续的SRAP分析.
3. 结论
本试验建立并优化了适应苦楝SRAP-PCR的反应体系,前期对苦楝模板DNA、Mg2+、引物和Taq酶进行单因子试验,研究发现,SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高,有一个较宽的浓度适宜范围,在25 μL体系中,模板DNA为10 ~ 70 ng时都扩增出了较清晰、带型基本相同的谱带;dNTPs设计的8个浓度梯度中,0.1 ~ 0.2 mmol·L-1范围内能扩增出清晰谱带,且条带基本相同,浓度低于0.1 mmol·L-1时,扩增条带弥散,高于0.2 mmol·L-1时,出现条带丢失的现象;Mg2+为2.00 mmol·L-1左右时扩增条带较清晰且数量多;引物介于0.48 ~ 0.64 μmol·L-1之间均能产生较为清晰的条带,且带型基本上保持一致,条带数并没有随着浓度的增加而增加;Taq DNA聚合酶用量在0.50 ~ 2.0 U范围内均可以得到清晰的带型,对其用量要求不高.进一步对苦楝SRAP-PCR的反应体系进行正交试验,并根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色对16个处理进行打分,从2次的得分来看,重复间差异不大,试验的一致性较好,其中处理5、处理7、处理8和处理9效果较好,评分均为4.0分,而处理15效果不好,评分仅为1.0分.根据得分可知,在25 μL反应体系中,当模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L-1、Mg2+ 2.25 mmol·L-1、引物0.48 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U时,实现最佳扩增,确定为最优组合.以来自海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸的8个苦楝种源DNA为模板,选取引物Me27/Em2、Me27/Em4进行SRAP-PCR反应体系稳定性验证,结果表明,筛选体系能很好地满足苦楝基因组SRAP-PCR扩增的要求且不同种源间条带有差异.
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