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棕榈科植物桄榔学名的订正

王勇进,廖启炓

王勇进,廖启炓. 棕榈科植物桄榔学名的订正[J]. 华南农业大学学报, 2001, 22(3): 93-93. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2001.03.031
引用本文: 王勇进,廖启炓. 棕榈科植物桄榔学名的订正[J]. 华南农业大学学报, 2001, 22(3): 93-93. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2001.03.031
Revision on the Scientific Name of the Palm-Plant “Guanglang”[J]. Journal of South China Agricultural University, 2001, 22(3): 93-93. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2001.03.031
Citation: Revision on the Scientific Name of the Palm-Plant “Guanglang”[J]. Journal of South China Agricultural University, 2001, 22(3): 93-93. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.2001.03.031

棕榈科植物桄榔学名的订正

Revision on the Scientific Name of the Palm-Plant “Guanglang”

  • 摘要: 桄榔 (南方草木状 )ArengawesterhoutiiGriff.inCalc.Journ .Nat.Hist. 5 :474.1845Arengapinnatasensunon (Wurmb .)Merr.;中国植物志 13(1) :110 ,Pl.2 5 (1~ 6) ,1991;海南植物志 4:167,Pl.10 68,1977;广东植物志 2 :45 2 ,1991.分布 :海南、广西及云南南部至东南部 ,生于海拔 60 0m以下的山地密林或疏林中 中南半岛及东南亚亦有分布 Hainan(海南 ) :Yaxian(崖县 ) ,F .C .How(侯宽昭 ) 70 690 ;Ledong(乐东 ) ,Lau (刘心祈 …
  • 苦楝Melia azedarach又名翠树、楝树、紫花树、森树等,为楝科楝属落叶乔木,分布于中国、韩国、日本、印度、斯里兰卡、印度尼西亚和澳大利亚等地,欧洲、美洲也有栽培[1].苦楝在我国分布广泛,水平分布为北纬18° ~ 40°,南至海南省崖县,北到河北保定和山西运城、陕西渭南、陇南地区,东至台湾、沿海各省,西到四川、云南保山[2].它生长速度快、木材材质优良、纹理美丽,易加工,可用于家具、建筑、农具、船舶、乐器制作等方面,木材抗白蚁、抗虫蛀、耐腐.苦楝耐烟尘,能大量吸收有毒有害气体,是优良的城市及工矿区绿化树种,也是我国南方四旁绿化常用树种[3-4].苦楝的根、皮、花、果均可入药,也可作为植物源农药[5].遗传多样性是生物多样性的重要组成部分,SRAP(Sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)结合了AFLP及RAPD各自的优点,方便快速,只需要极少量DNA材料,且不需要预先知道DNA序列信息,即可快速获得大量的信息,试验结果稳定可靠,且再现性较高,重复性较好[6-7].目前为止,国内对于苦楝的遗传多样性分析,鲜见开展过SRAP的研究.本试验采用单因素和正交试验设计从DNA、dNTPs、Mg2+、引物和TaqDNA聚合酶5个组分浓度对苦楝SRAP-PCR反应体系进行优化,旨在寻找一种高效、快速、经济的试验方法,建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系,为进一步应用SRAP技术对苦楝群体遗传多样性、种质资源鉴定等研究提供参考[7].

    苦楝幼叶于2013年7月取自华南农业大学苗圃,随用随采,用于苦楝基因组DNA的提取,采集叶片分别为海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸种源.所用正向引物序列为Me19(TGAGTCCAAACCGGTTG)和Me27(TGGGGACAACCCGGCTT),反向引物序列为Em2(GACTGCGTACGAATTTGC)、Em4(GACTGCGTACGAATTTGA)和Em5(GACTGCGTACGAATTAAC).

    用于SRAP-PCR反应的Taq酶、dNTPs、Mg2+为TaKaRa公司产品,引物由北京华大基因研究中心合成,PCR反应在东胜创新生物技术有限公司的PCR扩增仪上进行,DNA浓度和纯度使用超微量紫外分光光度计(Thermo Nanodrop 2000)检测.

    苦楝基因组DNA提取参照上海生工生物工程有限公司柱式基因组DNA提取试剂盒说明书进行.所提取的基因组DNA用8 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测品质,并采用超微量紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,然后将DNA稀释至50 ng·μL-1,置于-20 ℃条件下保存备用.

    SRAP-PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min.扩增产物采用20 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳,电泳后在自动凝胶图像分析仪上拍照分析.

    对影响苦楝SRAP-PCR反应的主要因素(模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物和Taq酶)进行单因子试验.对各影响因子分别设置8个梯度处理:模板DNA为0、10、20、30、40、50、60和70 ng;dNTPs为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mmol · L-1;Mg2+为0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 mmol·L-1;引物为0、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56和0.64 μmol·L-1Taq DNA聚合酶为0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 U.

    在对影响苦楝SRAP-PCR反应的模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物和Taq酶进行单因子试验后采用L16(45)正交试验设计,共16个处理,每个处理设2个重复,各因素水平见表 1.根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色进行打分.最优的得5分,最差的得1分,并计算每个因素在不同水平下的平均得分[8].

    表  1  SRAP-PCR正交试验设计L 16(45)及试验结果
    Table  1.  L 16(45) Orthogonal designs and results of SRAP-PCR reaction
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    以SRAP-PCR反应产物电泳得到的条带数目较多且清晰为筛选原则,对反应体系中起主要作用的5个因素进行单因素浓度梯度筛选试验[9-12],每个因素设置8个浓度梯度.试验结果表明:在25 μL反应体系中,模板DNA为25 ~ 40 ng、dNTPs为0.125 ~ 0.200 mmol·L-1、Mg2+为1.75 ~ 2.25 mmol·L-1、引物为0.40 ~ 0.52 μmol·L-1Taq DNA聚合酶为0.50 ~ 1.25 U时扩增效果好,条带较多且清晰,故将其选为后续正交试验的适宜浓度范围.

    以上述单因素试验确定的各因素适宜浓度范围为基础,采用L 16(45)正交设计对SRAP-PCR反应体系进行优化(表 1),并根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色(图 1)对16个处理进行打分,打分结果如表 1所示,从2次的得分来看,重复间差异不大,试验的一致性较好,其中处理5、处理7、处理8和处理9效果较好,评分均为4分,而处理15效果不好,评分仅为1.0分.从图 2可见,模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L-1、Mg2+ 2.25 mmol·L-1、引物0.48 μmol·L-1Taq DNA聚合酶0.75 U、反应总体积25 μL时得分较高,实现最佳扩增,确定为最优组合.

    图  1  SRAP-PCR反应体系正交试验结果
    M:DNA maker DL2000;1 ~ 16:处理1 ~ 16(陕西蒲城种源).
    Figure  1.  Amplified patterns of the SRAP-PCR based on orthogonal design
    图  2  模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶与平均得分的关系
    Figure  2.  Relationship between concentrations and mean scores of template DNA, dNTPs, Mg2+, primer and Taq polymerase

    为了验证体系的准确性,以来自海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸的8个苦楝种源DNA为模板,选取引物Me27/Em2、Me27/Em4进行SRAP-PCR验证,其结果如图 3所示,每个种源对每个引物均有清晰的条带,且不同种源间条带有差异.由此可见,本试验建立的SRAP-PCR体系稳定可靠,适用于苦楝后续的SRAP分析.

    图  3  SRAP-PCR反应体系稳定性检测
    M:DNA maker DL2000;1 ~ 8:引物Me27/Em2;9 ~ 16:引物Me27/Em4;自1和9开始,从左到右依次为海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸种源DNA.
    Figure  3.  The verification of Melia azedarach SRAP-PCR reaction system

    本试验建立并优化了适应苦楝SRAP-PCR的反应体系,前期对苦楝模板DNA、Mg2+、引物和Taq酶进行单因子试验,研究发现,SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高,有一个较宽的浓度适宜范围,在25 μL体系中,模板DNA为10 ~ 70 ng时都扩增出了较清晰、带型基本相同的谱带;dNTPs设计的8个浓度梯度中,0.1 ~ 0.2 mmol·L-1范围内能扩增出清晰谱带,且条带基本相同,浓度低于0.1 mmol·L-1时,扩增条带弥散,高于0.2 mmol·L-1时,出现条带丢失的现象;Mg2+为2.00 mmol·L-1左右时扩增条带较清晰且数量多;引物介于0.48 ~ 0.64 μmol·L-1之间均能产生较为清晰的条带,且带型基本上保持一致,条带数并没有随着浓度的增加而增加;Taq DNA聚合酶用量在0.50 ~ 2.0 U范围内均可以得到清晰的带型,对其用量要求不高.进一步对苦楝SRAP-PCR的反应体系进行正交试验,并根据电泳条带的多少、清晰度及背景颜色对16个处理进行打分,从2次的得分来看,重复间差异不大,试验的一致性较好,其中处理5、处理7、处理8和处理9效果较好,评分均为4.0分,而处理15效果不好,评分仅为1.0分.根据得分可知,在25 μL反应体系中,当模板DNA 30 ng、dNTPs 0.125 mmol·L-1、Mg2+ 2.25 mmol·L-1、引物0.48 μmol·L-1Taq DNA聚合酶0.75 U时,实现最佳扩增,确定为最优组合.以来自海南三亚、广东兴宁、广西梧州、福建建瓯、江西南昌、安徽利辛、陕西蒲城、河北邯郸的8个苦楝种源DNA为模板,选取引物Me27/Em2、Me27/Em4进行SRAP-PCR反应体系稳定性验证,结果表明,筛选体系能很好地满足苦楝基因组SRAP-PCR扩增的要求且不同种源间条带有差异.

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出版历程
  • 修回日期:  2001-04-29
  • 刊出日期:  2001-07-09

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