防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.为伞形科多年生草本植物，主要分布在中国、韩国和日本^[1]，以未抽薹的干燥根入药^[2]。防风药用历史悠久，在中医临床实践中已有2000多年的历史，是我国传统中药材的重要组成部分，具有解表祛风、胜湿、止痛解痉的功效^[3]。现代研究表明防风中含有挥发油、色原酮、有机酸、香豆素以及多糖等多种类别的化学成分，其中，香豆素类是防风的主要药效成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗菌、保护心脏、诱导癌细胞凋亡等药理作用^[4]。

香豆素类化合物通过苯丙烷途径产生，根据母核上的取代基及其位置的不同，可分为简单香豆素、呋喃香豆素和吡喃香豆素，具有多种生物活性；在香豆素合成通路中多数基因均是以基因家族的形式存在于植物中，对香豆酰辅酶A 2'−羟化酶(p-Coumaroyl CoA 2'-hydroxylase, C2'H)参与香豆素合成，属于2−氧代戊二酸依赖性双加氧酶(2-Oxoglutarate-dependent dioxygenase，2OGD)超家族^[5]。邻羟基化反应是香豆素生物合成的关键步骤，C2'H通过催化对香豆酰辅酶A和阿魏酰辅酶A的邻位羟基化，生成伞形酮前体与东莨菪碱前体，最后通过自发或酶促环化形成香豆素核心骨架。目前，在拟南芥^[6]、甘薯^[7]、芸香^[8]、白花前胡^[9]等物种中发现C2'H对对香豆酰辅酶A和阿魏酰辅酶A这2种底物均具有高度特异性；然而，在防风中尚未克隆到C2'H基因。因此，本研究拟克隆防风SdC2'H基因，解析其对香豆素生物合成的调控作用。

毛状根是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes侵染植物受伤部位使植物表面产生的一种病理表现^[10]，具有遗传稳定、繁殖速度快、容易进行基因操作等优点。毛状根不仅是研究植物基因功能的良好遗传体系^[11]，还可以合成具植物特征的次生代谢产物，因此在药用植物研究方面，毛状根的培养技术受到诸多关注，在丹参^[12]、人参^[13]、长春花^[14]等药用植物中取得显著进展。近年来，很多学者利用毛状根培养体系在不同植物中进行基因功能研究。例如，在丹参毛状根中过表达SmSCR1基因显著提高毛状根中丹参酮的含量^[15]；在黄芩毛状根中过表达肉桂酸4−羟化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H)和4−香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumaroyl coenzyme A ligase，4CL)基因显著增加毛状根中黄酮的含量^[16]；在何首乌毛状根中过表达2种尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(Uridine-diphosphate-dependent glycosyltransferases，UGTs)基因使毛状根中2, 3, 5, 4'−四羟基二苯乙烯−2−O−β−D−葡萄糖苷(2, 3, 5, 4'- Tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)含量显著提高^[17]。而在防风毛状根中进行基因过表达功能验证的研究报道较少。本研究前期利用茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)诱导的防风毛状根转录组测序数据^[18]筛选出香豆素生物合成途径的关键基因C2'H，利用无缝克隆技术，构建含有SdC2'H基因的过表达载体，利用毛状根遗传转化体系开展SdC2'H基因功能研究，解析该基因在防风香豆素生物合成中的作用，为阐明香豆素生物合成的分子调控网络提供基础。

1.   材料与方法

1.1   试剂与仪器

植物RNA提取试剂盒(货号：ZP405)、cDNA合成试剂盒(货号：AT311)、快速高保真DNA聚合酶(货号：AS131)、同源重组无缝克隆试剂盒(货号：CU201)购于北京全式金生物科技有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(货号：B518131)、限制性内切酶Bg1 II和BstE II、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(货号：B518191)、植物DNA提取试剂盒(货号：B518262)以及大肠埃希菌DH5α感受态细胞购于上海生工生物工程股份有限公司；pMD-19T载体以及DNA marker(BM2000、BM15000)购于TaKaRa公司；K599发根农杆菌感受态细胞采购自华越洋生物科技(北京)有限公司。

仪器包含PCR仪ProFlex™(美国ThermoFish)、恒温振荡培养箱YAMATOIC412C(美国Yamato)、离心机(美国ThermoFish)、琼脂糖凝胶电泳仪DYY-8C(北京六一)、凝胶成像系统GIS-2010(上海Tanon)。

1.2   PCR引物及程序

由上海生工生物工程股份有限公司完成所有PCR引物合成及测序工作，试验所用引物信息及PCR反应程序参见表1、2。

表  1  引物信息

Table  1.  Primer information

编号 Code	项目 Item	名称 Name	正向序列(5′→3′) Forward sequence	反向序列(5′→3′) Reverse sequence
S1	SdC2'H基因克隆	SdC2'H-1	ATGCATATTGTTAATCATGG	TCATATCTTTGCAAACTCGA
S2	SdC2'H基因过表达载体构建	SdC2'H-2	TGACCATGGTAGATCTATGCATA TTGTTAATCATGGAGTCCCCA	ATTCGAGCTGGTCACCTCATATC TTTGCAAACTCGAGAGTGTCC
S3	植物双元表达载体构建	1304	GCAACAGGATTCAATCTTAAGA	ATTGTGAAGATAGTGGAAAAGG
S4	毛状根中rolB验证	rolB	GCCAGCATTTTTGGTGAACT	GGCACTGAACTTGCCGTTAT
S5	转基因毛状根外源SdC2'H鉴定	hrHyg	ATCATCGAAATTGCCGTCAA	ATGGCGTGATTTCATATGCG
S6	利用RT-qPCR检测EF1-α表达	EF1-α	AGGCTCTTCAGGAGGCTCTTC	CAATGTGACAGGTGTGGCAATC
S7	利用RT-qPCR检测SdC2'H表达	q-C2'H	ATGCATATTGTTAATCATGGAGTCC	GCAACGCAAAGAATCTACGA

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.3   防风SdC2'H基因克隆及生物信息学分析

采用植物RNA提取试剂盒提取新鲜防风叶片总RNA，采用cDNA合成试剂盒逆转录获得cDNA。使用Vector N TI设计引物S1(表1)对SdC2'H基因进行PCR扩增，采用反应程序1(表2)；反应体系(20 μL)为cDNA 1.0 μL、2× TransTag HiFi PCR SuperMixⅡ 10.0 μL、上游引物(10 μmol·L⁻¹)1.0 μL、下游引物(10 μmol·L⁻¹)1.0 μL、ddH₂O 7.0 μL。利用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR扩增产物，在16 ℃恒温条件下与pMD-19T载体过夜连接。将连接产物转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在含50 mg·L⁻¹ Amp的LB平板上筛选阳性克隆，随机选取若干阳性克隆进行PCR鉴定，对确认符合要求的阳性菌液样本进行测序。

表  2  PCR 程序

Table  2.  PCR programs

编号 Code	项目 Item	程序 Program
1	SdC2'H基因克隆	94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循环；72 ℃ 10 min
2	SdC2'H基因过表达载体构建	94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循环；72 ℃ 10 min
3	植物双元表达载体构建	95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35次循环；72 ℃ 10 min
4	毛状根中rolB验证	94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min，35次循环；72 ℃ 10 min
5	转基因毛状根外源SdC2'H鉴定	94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 1 min，35次循环；72 ℃ 10 min
6	利用RT-qPCR检测EF1-α表达	95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40次循环
7	利用RT-qPCR检测SdC2'H表达	95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40次循环

下载: 导出CSV 

| 显示表格

基于Expasy-ProtParam在线平台解析SdC2'H蛋白的理化参数；通过SOPMA在线工具预测其二级结构组成；利用Swiss-Model进行三级结构建模；通过SiqnalP6.0 Server在线平台进行信号肽特征预测；借助NCBI的CD-search工具进行保守结构域鉴定；从GenBank选取16个跨物种同源序列，将其与本研究获得的防风SdC2'H序列共同导入MEGA 11软件进行多序列比对，基于近邻聚类算法构建系统进化树。

1.4   构建过表达SdC2'H基因的植物双元表达载体

选取pCAMBIA1304载体Bg1 II与BstE II酶切位点作为SdC2'H基因插入位点，按照同源重组无缝克隆试剂盒的要求设计同源臂引物S2(表1)，并进行PCR扩增，采用反应程序2(表2)；对质粒pCAMBIA1304进行Bg1 II和BstE II双酶切处理(37 ℃、1 h)；按照Basic Assembly反应体系对琼脂糖凝胶电泳纯化扩增产物的目标基因及线性化载体(物质的量比2∶3)进行重组连接，在PCR仪中于50 ℃温育15 min；将重组连接产物转化至大肠埃希菌Trans1-T1感受态细胞，在含50 mg·L⁻¹ Kan的LB固体培养基上随机挑选阳性单菌落；对扩大培养的阳性菌液进行PCR分子鉴定与测序验证，将确认无误的重组质粒命名为pCA-SdC2'H。

1.5   构建重组发根农杆菌K599

利用冻融法将重组pCA-SdC2'H质粒导入发根农杆菌K599感受态细胞，在含50 mg·L⁻¹ Kan、50 mg·L⁻¹ Str的YEB固体培养基上随机选取阳性克隆；选取引物S3(表1)配合PCR程序3(表2)对阳性克隆进行PCR检测与测序；将经测序确认的重组农杆菌接种至含有相应抗生素的YEB液体培养基中，于28 ℃摇床以180 r·min⁻¹振荡培养至对数期，测定菌液D_{600 nm}为0.6~1.0时离心，收集菌体，以等体积1/2MS液体培养基进行重悬^[18]。

1.6   过表达SdC2'H基因防风毛状根的诱导、验证及培养

在超净工作台中将防风无菌苗的叶片剪出伤口，并放置在重悬于等体积1/2MS液体培养基的菌液中，于28 ℃摇床中震荡侵染；10 min后取出外植体在滤纸上擦干，接种于MS固体培养基，放置于25 ℃恒温培养箱共培养3 d；3 d后将外植体在无菌水中冲洗掉多余农杆菌，吸干水分并转接到含有50 mg·L⁻¹ Cef的固体MS培养基中除菌培养^[18]。以发根农杆菌K599诱导防风毛状根建立空白对照组(CK)，同时分别利用携带pCAMBIA1304空载体的工程菌诱导防风毛状根构建阴性对照组(NC)，以及携带SdC2'H过表达载体的工程菌诱导防风毛状根构建过表达组(SdC2'H⁺)；每周继代培养并梯度降低Cef质量浓度，直至诱导获得防风毛状根；随后通过植物DNA提取试剂盒获取各处理组毛状根系基因组DNA，分别选取引物S4、S5(表1)配合程序4、5(表2)进行rolB基因及hrHyg外源基因的PCR鉴定。参照西芸霏^[18]的方法对上述鉴定正确的防风毛状根进行液体扩大培养，操作如下：无菌条件下称取1.5 g长势一致的防风毛状根系样本，接种于含1/2MS液体培养基的锥形瓶中，置于25 ℃恒温摇床以130 r·min⁻¹进行振荡培养，每7 d更换1次新鲜培养基；持续培养21 d后收获毛状根样本，经蒸馏水冲洗后用于后续SdC2'H基因表达量检测与香豆素含量测定。每个处理设3次生物学重复。

1.7   防风毛状根中SdC2'H基因表达水平检测

通过植物RNA提取试剂盒提取各处理组毛状根系总RNA，并选用cDNA合成试剂盒进行cDNA合成，反应体系为防风毛状根RNA 4 μL、Anchored Oligo (dT)₁₈ 1 μL、2× TS Reaction Mix 10 μL、TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL、gDNA Remover 1 μL、RNase-free Water 1 μL，反应条件为42 ℃孵育15 min，85 ℃加热5 s失活TransScript RT/RI与gDNA Remover。以防风EF1-α基因作为内参基因，利用RT-qPCR检测防风毛状根样品中SdC2'H基因的表达水平；以引物S6(表1)对EF1-α进行扩增，采用PCR反应程序6(表2)，以引物S7(表1)对SdC2'H进行扩增，采用PCR程序7(表2)，反应体系均为基因1.0 μL、上游引物(10 μmol·L⁻¹)1.0 μL、下游引物(10 μmol·L⁻¹)1.0 μL、SYBR Green Master Mix 10.0 μL、ddH₂O 7.0 μL；采用2^−△△CT法计算SdC2'H基因的相对表达水平^[19]。

1.8   防风毛状根中香豆素含量的测定

用蒸馏水将毛状根冲洗干净，并用滤纸吸干水分后置于60 ℃烘箱，干燥后的毛状根用研钵磨成细粉，过0.6 mm孔径筛，称取0.2 g样品，加入6 mL甲醇，于60 ℃超声提取1 h，冷却，滤纸过滤，过0.22 μm滤膜。采用HPLC测定香豆素含量^[20]。

2.   结果与分析

2.1   SdC2'H基因克隆与生物信息学分析

如图1所示，PCR扩增产物呈现813 bp的特异性条带，经测序证实其实际长度与预期完全一致，包含完整的813 bp开放阅读框。

图  1  SdC2'H基因的PCR扩增

Figure  1.  PCR amplification of SdC2'H gene

1−3: SdC2'H, M: DNA marker.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

BLAST比对结果显示，该序列与Kitagawia praeruptora的C2'H cDNA序列相似性为93.33%，氨基酸序列相似性为94.44%，确证其为防风SdC2'H基因序列，并成功提交至GenBank数据库(登录号：PV169361)。生物信息学分析显示，防风SdC2'H蛋白分子式为C₁₃₈₆H_{2 191}N₃₅₇O₄₀₁S₉，理论相对分子质量为305603330，等电点为6.61，不稳定指数为37.50(<40)，是一个不稳定蛋白；亲水性为−0.184(<0)，为亲水性蛋白。SdC2'H蛋白质的二级结构以α−螺旋和卷曲结构为主，分别占比34.81%和47.41%，另外延伸链占据17.78%。由三级结构模型预测可知，该蛋白主要由α−螺旋和无规则卷曲组成。SdC2'H蛋白位于跨膜区和膜内部的概率很低，主要定位于膜外。信号肽预测值均为0，说明不含典型信号肽序列。保守结构域分析结果进一步显示，防风SdC2'H属于PLN03178超家族，聚类分析结果如图2所示。防风SdC2'H的氨基酸序列与伞形科植物紫花前胡Angelica decursiva和K. praeruptora的序列聚在一起，亲缘关系较近，说明防风SdC2'H和其他伞形科植物C2'H具有相似的功能。

图  2  SdC2'H氨基酸序列系统进化树

Figure  2.  Phylogenetic tree of SdC2'H amino acid sequence

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   过表达SdC2'H基因防风毛状根的验证

基于图3所示方法构建防风pCA-SdC2'H双元表达载体，经PCR验证(图4)显示，特异性扩增条带长度为813 bp，与SdC2'H基因预期长度一致，测序比对证实其与GenBank注册序列(PV169361)相似性为100%，确证成功构建了防风pCA-SdC2'H双元表达载体。侵染7、30 d后的毛状根样本如图5所示，空白对照(CK)、空载体阴性对照(NC)及过表达SdC2'H(SdC2'H⁺)3个处理组均长势良好。

图  3  质粒pCAMBIA1304图谱

Figure  3.  Mapping of plasmid pCAMBIA1304

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  4  利用PCR验证pCA-SdC2'H双元表达载体

Figure  4.  PCR verification of pCA-SdC2'H binary expression vector

1−2: SdC2'H, M: DNA marker.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  诱导培养7、30 d后的防风毛状根

CK：空白对照，NC：空载体阴性对照，SdC2'H⁺：过表达SdC2'H。

Figure  5.  Saposhnikovia divaricata hairy roots after induction and culture for 7 and 30 d

CK: Blank control, NC: Negative control containing empty vector, SdC2'H⁺: Overexpressing SdC2'H.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图6a为各处理防风毛状根系中rolB基因的PCR验证结果，扩增获得长度为703 bp的条带，经测序比对，与K599发根农杆菌中rolB基因序列完全匹配(相似性100%)。如图6b所示，SdC2'H⁺组特异性扩增出418 bp条带，经测序比对，与hrHyg基因序列完全匹配(相似性100%)，确证SdC2'H基因成功外源整合至毛状根基因组，并排除内源性基因干扰。上述结果证实，本研究成功诱导了过表达SdC2'H基因的防风毛状根。

图  6  基于rolB (a)和hrHyg (b)扩增的防风毛状根鉴定

SdC2'H⁺：过表达SdC2'H，NC：空载体阴性对照，CK：空白对照，M：DNA marker。

Figure  6.  Identification of Saposhnikovia divaricata hairy roots based on rolB (a) and hyHyg (b) amplification

SdC2'H⁺: Overexpressing SdC2'H, NC: Negative control containing empty vector, CK: Blank control, M: DNA marker.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   防风毛状根中SdC2'H基因的表达水平

通过RT-qPCR定量检测防风毛状根中SdC2'H基因表达水平，应用GraphPad Prism 9.5软件进行t检验。如图7所示，SdC2'H⁺处理组基因表达水平显著高于空白对照组(CK) (P<0.0001)。

图  7  SdC2'H在不同处理防风毛状根系中的相对表达水平

CK：空白对照，NC：空载体阴性对照，SdC2'H⁺：过表达SdC2'H；****表示在P<0.000 1水平差异显著(t检验)。

Figure  7.  Relative expression levels of SdC2'H in Saposhnikovia divaricata hairy roots of different treatments

CK: Blank control, NC: Negative control containing empty vector, SdC2'H⁺: Overexpressing SdC2'H; **** indicates significant difference at P<0.000 1 level (t test).

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   防风毛状根中香豆素含量

如图8所示，经1/2MS液体培养基培养21 d后，各处理防风毛状根均长势良好。采用HPLC检测各处理组防风毛状根系中香豆素含量(图9)，经采用GraphPad Prism 9.5软件进行t检验，SdC2'H⁺组香豆素含量均显著高于空白对照组(CK) (P<0.001)与空载体阴性对照组(NC) (P<0.01)。

图  8  在1/2MS液体培养基中培养21 d的防风毛状根样品

CK：空白对照，NC：空载体阴性对照，SdC2'H⁺：过表达SdC2'H。

Figure  8.  Saposhnikovia divaricata hairy root samples cultured in 1/2 MS liquid media for 21 d

CK: Blank control, NC: Negative control containing empty vector, SdC2'H⁺: Overexpressing SdC2'H.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  9  不同处理防风毛状根系中的香豆素含量

CK：空白对照，NC：空载体阴性对照，SdC2'H⁺：过表达SdC2'H；**和***分别表示在P<0.01和P<0.001水平差异显著(t检验)。

Figure  9.  Coumarin contents in Saposhnikovia divaricata hairy roots of different treatments

CK: Blank control, NC: Negative control containing empty vector, SdC2'H⁺: Overexpressing SdC2'H; ** and *** indicate significant differences at P<0.01 and P<0.001 levels respectively (t test).

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论与结论

香豆素作为苯骈−α−吡喃酮类的芳香族天然产物，在药用植物中广泛存在，具有抗肿瘤、抗凝血及抗氧化等重要的药理活性^[21]。本研究从防风中成功克隆SdC2'H基因，其开放阅读框为813 bp，编码蛋白含270个氨基酸。SdC2'H蛋白一级结构分析显示其具有亲水性及结构不稳定特征，且缺乏典型信号肽序列。二级结构以α−螺旋和无规则卷曲为主，初步解析了该蛋白的折叠构象特征。由C2'H蛋白构建的系统进化树可见，防风SdC2'H蛋白与伞形科植物紫花前胡亲缘关系最近，推测防风SdC2'H可能与紫花前胡C2'H具有相似功能，为后续解析防风香豆素生物合成的分子机制提供了依据。

近年来，有关功能基因对药用成分生物合成调控的研究日益深入。Hwang等^[22]利用根瘤菌注射法，在黄芪茎外植体中诱导过表达AmUGT15基因的毛状根，其黄芪甲苷总量是野生型对照组的4.2倍。侯嘉铭等^[23]利用发根农杆菌转化法将CHI基因在甘草毛状根中过表达，其黄酮类有效成分的含量显著增加。本研究在防风中构建过表达载体pCA-SdC2'H，利用发根农杆菌诱导防风子叶外植体，获得过表达SdC2'H基因的防风毛状根系，其SdC2'H基因的表达水平显著高于空白对照，且香豆素含量显著高于空白对照和空载体阴性对照，证实该基因通过增强对对香豆酰辅酶A的催化效率正向调控香豆素合成通路。前人通过系统进化树分析发现，白花前胡PpC2'H与欧防风PsC2'H具有较高的序列相似性^[24]。已有研究表明，C2'H及F6'H介导的邻位羟基化反应是香豆素生物合成的关键步骤，其中游离肉桂酸衍生物作为非活性底物参与催化过程^{[8, 25]}，例如，拟南芥AtF6'H1和甘薯IbF6'H1对阿魏酰辅酶A表现出严格的底物特异性。本研究中SdC2'H基因对香豆素合成具有正向调控作用，这一结果也与在拟南芥中过表达F6'H1促进东莨菪碱生成的研究结果^[26]相似，说明防风中SdC2'H基因和AtF6'H1基因可能具有高度相似的功能。

本研究成功构建了过表达SdC2'H基因的防风毛状根培养体系，明确了SdC2'H基因在香豆素生物合成中的促进作用。今后，将继续以防风毛状根为研究对象，对影响香豆素生物合成的其他关键基因进行研究，进一步解析香豆素生物合成的分子调控机制。