Pathogen identification of lychee brown spot and screening of its biocontrol agents
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摘要:目的
鉴定新发生的荔枝褐斑病病原种类，并进行病原菌生物学特性测定和生防菌的筛选，为该病发生规律研究及绿色防控提供依据。
方法2021年10月采集荔枝幼树褐斑病叶片，采用病组织分离获得菌株GZ1并依据柯赫氏法则确定其致病性。通过形态学比较及内转录间隔序列(ITS)、β−微管蛋白基因(Tub2)、RNA聚合酶II第二大亚基基因(rpb2)的多序列联合构建系统发育树，明确病原菌的种类。在不同碳源、温度、pH等培养条件下，测定GZ1的生物学特性。采用平板对峙法和菌丝生长速率法测定2种生防菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XX和贝莱斯芽孢杆菌B. velezensis BS对GZ1的抑制效果。
结果菌株GZ1是荔枝褐斑病的致病菌，其种名为嘴突凸脐蠕孢Exserohilum rostratum (Drechsler) K.J. Leonard & Sugg。该菌最适生长温度为28 ℃，最适生长pH为7，能利用多种碳源且蔗糖为碳源时菌丝生长最快；B. subtilis XX和B. velezensis BS均对该病原菌的生长有明显的抑制效果。
结论本研究报道了嘴突凸脐蠕孢引起荔枝褐斑病，为荔枝新病害，研究为嘴突凸脐蠕孢引起的荔枝病害防治提供了依据。
Abstract:ObjectiveTo identify the pathogen species of newly occurring lychee brown spot, determine the biological characteristics of the pathogen, and screen biocontrol agents, so as to provide a basis for understanding the occurrence patterns of lychee brown spot and green disease control.
MethodIn October, 2021, leaves with severe brown spot on young litchi trees were collected. A strain of GZ1 was obtained from diseased leaves and its pathogenicity was determined based on Koch’s postulates. Morphological analysis and a phylogenetic tree based on sequences of internal transcribed spacer (ITS), β-tubulin gene (Tub2), and RNA polymerase II second largest subunit gene (rpb2) were performed to clarify the taxonomic status of this pathogen. The biological characteristics of pathogen GZ1 were determined under various culture conditions including multiple carbon sources, temperatures, and pH. Antagonistic effects of two biocontrol agents, Bacillus subtilis XX and B. velezensis BS against GZ1 were evaluated using the dual culture method and hyphal growth rate method.
ResultThe strain GZ1 was confirmed as the causal agent of lychee brown spot, and it was identified as Exserohilum rostratum (Drechsler) K.J. Leonard & Suggs. The optimal temperature and pH for its growth were 28 ℃ and 7. It could utilize various carbon sources, with the fastest hyphal growth observed in the presence of sucrose. The biocontrol agents B. subtilis XX and B. velezensis BS exhibited significant inhibitory effects on the growth of pathogen GZ1.
ConclusionThis study reports that E. rostratum is the causal agent of lychee brown spot, thereby identifies a new lychee disease. The study can provide a basis for scientific control of lychee disease caused by E. rostratum.
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1. S22系基础群建立
S22以2006年从加拿大DGI公司引进的杜洛克原种公猪35头、18个血缘、281头母猪为基础育种素材建立核心育种群，在水台原种场分场沙湖原种场组群和选育。
2. S22系的育种目标
按照专门化父系来选育，以饲料报酬高、体型高长、眼肌面积大、生长速度快为选育方向，以30~115 kg料重比、30~115 kg日增重、达115 kg时背膘厚、达115 kg时眼肌面积作为主选性状，注重体型高长、骨架大的选择。具体指标如下：
1) 体型外貌：头大小适中、较清秀，颜面稍凹、嘴筒短直，耳中等大小，向前倾，耳尖稍弯曲；体躯高长，骨架大，胸宽深，背腰平阔，腹线平直，前后躯较发达，肌肉丰满；四肢粗壮有力，肢蹄结实；毛色以棕黑色、棕红色为主；乳头排列整齐，有效乳头6对。
2) 肥育性状：校正30~115 kg料重比，公猪2.35、母猪2.45；校正30~115 kg日增重，公猪850 g、母猪820 g。
3) 胴体性状：校正115 kg背膘厚，公猪13.0 mm、母猪14.0 mm；校正115 kg眼肌面积，公猪36 cm2、母猪34 cm2。
4) 初配日龄220~245 d，初配体重120 kg以上。
5) 各性状经济加权值：料重比0.20、校正日增重0.30、校正背膘厚0.35、校正眼肌面积0.15。
3. 选育方法
以数量遗传学结合分子遗传学理论为基础，采用开放式核心群群体继代选育方法，根据实际需要在中途适度引进部分优秀公猪精液和活体公猪补充血缘，淘汰群体中差血缘，并从扩繁群中选留少量优秀母猪进入核心群来提高群体的遗传性能。
种猪的选留经过出生、断奶、进测定站、终测选留多个阶段。种猪选留主要根据自身的遗传性能以及父母的遗传缺陷，根据核心群选育要求进行性能测定，生长性状和繁殖性状用BLUP法多性状模型估计主选性状育种值，并按照各主选性状的经济加权合成选择指数，结合现场体型外貌评估、分子标记检测结果选择后备种猪。
选配方面，在控制血缘配种量和近交系数上升的情况下，主要采用优配优，辅以优配差等精细化选配方式，提高遗传进展，根据种猪的遗传性能和选留标准做好各阶段种猪选留工作，期间采取控制选择强度、加快核心群种猪更新来加快遗传进展的传递速度。
4. S22品系选育过程
4.1 S22品系血统和选育性状的演变
S22系来源是2006年从加拿大DGI公司引进的杜洛克母猪316头、公猪35头，共18个血统。在选育过程中，淘汰生长速度慢、背膘厚、料重比高、体型粗短的血统共8个；保留了体型好、背膘薄、生长快、饲料报酬高、适应性好、综合指数高的10个血统，即006504、001188、002102、003762、001305、001525、056406、002543、112102、038904，具体见表 1。由于该品系体型高长，生长速度快，饲料报酬高，将它作为父系猪来选育，在选育中同时保留各个血统的特点。
表 1 S22系的血统选择演变情况项目 引入时的血统 淘汰血统 目前血统 编号 006504、001188、004834、002102、003762、
001305、001525、056406、038904、002543、
112102、030804、063912、169910、044807、
030007、030303、030502030804、063912、169910、
044807、030007、030303、
030502、004834006504、001188、002102、001305、
001525、056406、038904、002543、
112102、003762数量 18 8 10 在建群初期，S22系主要选育校正30~100 kg日增重、校正100 kg背膘厚以及体型等性状。2008年开始利用奥饲本全自动生产性能测定系统，开始测定料重比数据，并对该性状进行遗传评估；2011开始，肉猪市场趋向于大体重上市，肉猪的体型也是定价指标之一，所以公司开始注重对父系猪的体型评分、体长、体高的选择。2012年开始利用ALOK500型B超仪测定种猪的活体背膘厚、眼肌面积、肌内脂肪含量等指标，并将它们纳入遗传评估。
4.2 S22系血统的近交系数
S22系各个血统的近交系数见表 2。由表 2可以看出，该品系各血统的近交系数控制总体比较好，但有3个血统，006504、002102和003762的生产公猪和后备公猪的近交系数都大于2%，所以在选配时要注意控制近交，另外，需要在适当的时候引入外血，补充优秀血缘，增加群体的多样性。
表 2 S22系中各血统的近交系数% 血统 选留前 后备 生产公猪 生产母猪 合计 006504 0.89 2.20 0.59 0.85 001188 0.87 0.00 0.89 0.87 002102 1.02 2.33 1.53 1.09 1.04 003762 1.05 2.15 1.11 2.11 001305 0.74 0.78 0.99 0.85 001525 0.97 0.82 1.25 0.99 0.97 056406 1.18 0.57 0.66 1.17 002543 1.09 0.78 0.82 1.04 112102 1.79 1.79 038904 0.85 0.85 4.3 S22系分子标记辅助选择
在分子标记辅助育种方法方面，对该品系肋骨数基因标记进行检测和验证，发现其阳性基因纯合子QQ与肋骨数呈较高的遗传相关，而且该品系的阳性基因Q的频率为92.5%，所以采用选配加分子检测方法对肋骨数基因进行纯合选育，存栏公母猪的肋骨数基因型都是QQ，保证肋骨数有利等位基因纯合。
4.4 S22品系的选育进展
S22系各年度测定主要生长性状的表型变化趋势见表 3~5。由表 3可以看出，S22系30~115 kg日增重基本呈逐年上升趋势，校正背膘厚逐年下降。2008年公司引进奥饲本全自动种猪生产性能测定系统，开始测定种猪的料重比，料重比的表型值也基本呈下降趋势。2012年开始对眼肌面积进行选择，眼肌面积的表型值也有所提高。由表 4可以看出，S22系的体长、体高近10年来提高明显，这与对该品系往高长的大体型方向选育有关。尽管父系猪主要关注生长发育性能选育，但该品系的繁殖性能近10年也有所提高，见表 5。
表 3 专门化品系S22主要生长性状表型测定的变化趋势1)年份 性别 校正30~115 kg日增重 校正115 kg背膘厚 校正30~115 kg料重比 校正115 kg眼肌面积 样本量 表型值/g CV/% 样本量 表型值/mm CV/% 样本量 表型值/g CV/% 样本量 表型值/cm2 CV/% 2006 母 280 759.60±73.18 9.63 280 18.57±2.15 11.58 公 35 859.89±59.81 6.96 35 15.94±1.80 11.29 2007 母 734 762.60±74.88 9.82 737 18.49±2.25 12.17 公 375 871.89±58.12 6.67 379 15.24±1.71 11.22 2008 母 1 523 798.19±67.95 8.51 1 531 17.71±1.78 10.05 89 2.51±0.25 10.36 公 750 922.99±76.08 8.24 765 14.78±1.41 9.54 162 2.41±0.19 7.88 2009 母 1 651 805.11±71.69 8.90 1 659 17.58±1.49 8.48 121 2.45±0.20 8.16 公 824 928.24±64.59 6.96 831 14.23±1.03 7.24 215 2.40±0.18 7.92 2010 母 1 761 820.94±58.82 7.16 1 774 16.13±1.50 9.30 154 2.43±0.19 7.82 公 877 943.16±64.80 6.87 885 14.11±1.21 8.58 650 2.38±0.21 8.82 2011 母 1 897 778.07±66.90 8.60 1 932 16.61±1.53 9.21 320 2.42±0.27 9.50 公 949 875.49±73.24 8.37 958 14.78±1.15 7.78 729 2.36±0.21 8.90 2012 母 2 162 775.35±72.09 9.30 2 175 15.93±1.29 8.10 433 2.37±0.23 8.02 2 175 41.27±4.30 10.42 公 1 049 877.34±72.59 8.27 1 054 14.31±1.31 9.15 1287 2.35±0.19 8.09 1 051 40.18±4.03 10.03 2013 母 2 197 866.70±69.18 7.98 2 215 12.63±1.16 9.18 323 2.37±0.22 8.86 2 215 40.33±3.89 9.65 公 1 085 987.40±81.32 8.24 1 105 11.86±0.98 8.26 1 819 2.26±0.18 7.96 1 105 39.05±3.82 9.78 2014 母 2 508 865.96±76.02 8.78 2 546 12.51±1.01 8.07 471 2.35±0.17 7.23 2 546 42.09±3.89 9.24 公 1 233 958.33±66.66 6.96 1 257 12.05±0.95 7.88 1925 2.17±0.19 8.76 1 257 40.02±3.72 9.30 1)表型值为平均数±标准差 表 4 专门化品系S22主要体尺性状表型测定的变化趋势1)年份 性别 样本量 终测体长 终测体高 表型值/cm CV/% 表型值/cm CV/% 2006 母 280 108.95±3.23 3.52 60.59±2.88 2.88 公 35 112.09±2.98 3.34 61.89±2.34 2.34 2007 母 737 109.15±3.35 3.66 61.12±2.78 2.78 公 379 112.11±2.75 3.08 62.18±2.52 2.52 2008 母 1 531 113.60±3.41 3.87 61.80±2.35 2.35 公 765 115.40±3.15 3.63 63.11±2.29 2.29 2009 母 1 659 112.39±2.85 3.20 61.22±2.43 2.43 公 831 115.46±2.53 2.92 63.95±2.31 2.31 2010 母 1 774 113.30±2.97 3.37 61.37±2.45 2.45 公 885 115.78±2.41 2.79 62.12±2.17 2.17 2011 母 1 932 114.42±3.58 3.13 61.64±2.27 2.27 公 958 116.72±2.63 2.25 63.11±2.14 2.14 2012 母 2 175 113.22±3.16 2.79 61.69±2.54 2.54 公 1 054 116.74±2.86 2.45 62.70±2.42 2.42 2013 母 2 215 115.71±2.70 2.33 61.39±2.35 2.35 公 1 105 118.59±2.44 2.06 62.97±2.19 2.19 2014 母 2 232 116.75±4.14 3.40 60.59±2.05 2.05 公 1 257 120.45±4.18 3.36 63.13±2.09 2.09 1)表型值为平均数±标准差 表 5 专门化品系S22主要繁殖性状表型测定情况1)头 年份 胎次 总仔数 活仔数 健仔数 样本量 表型值 样本量 表型值 样本量 表型值 2007 初 216 9.35±2.25 209 8.28±2.11 208 8.15±2.00 经 437 9.75±2.28 429 8.53±2.07 428 8.39±1.96 2008 初 254 9.52±2.14 248 8.45±2.01 247 8.32±1.90 经 517 10.12±2.25 495 8.91±2.11 494 8.77±2.00 2009 初 272 10.21±2.21 258 8.88±2.01 257 8.75±1.90 经 552 10.66±2.22 541 9.39±2.11 540 9.25±2.00 2010 初 291 10.14±2.12 287 8.90±1.80 286 8.77±1.69 经 590 10.54±1.99 578 9.35±1.91 577 9.21±1.80 2011 初 335 9.93±1.78 324 9.03±1.78 323 8.90±1.67 经 651 10.39±1.89 646 9.46±1.9 645 9.32±1.79 2012 初 342 10.12±1.98 328 9.05±1.68 327 8.92±1.57 经 715 10.48±1.89 704 9.47±1.89 703 9.33±1.78 2013 初 365 10.12±1.74 345 8.99±1.77 344 8.86±1.66 经 748 10.37±1.88 726 9.38±1.83 725 9.24±1.72 2014 初 390 9.59±1.54 378 9.06±1.81 377 8.93±1.70 经 790 10.27±1.78 770 9.40±1.82 769 9.26±1.71 1)表型值为平均数±标准差 S22主要性状的遗传趋势见表 6。由表 6可以看出，S22系近9年的日增重遗传进展上升趋势非常明显，眼肌面积有所上升，背膘厚的遗传趋势逐年下降；料重比也逐年缓慢下降。因此，该品系的生长发育性状的选育效果非常明显。
表 6 专门化品系S22主要性状的遗传趋势1)年份 校正日增重 校正背膘厚 校正料肉比 校正眼肌面积 样本量 遗传趋势 样本量 遗传趋势 样本量 遗传趋势 样本量 遗传趋势 2006 315 -9.16±12.73 315 0.15±0.82 2007 1 720 -8.36±15.73 1 776 -0.01±0.84 2008 2 385 -1.77±17.22 2 455 0.11±0.85 113 0.01±0.03 2009 3 314 9.86±18.39 3 329 -0.13±0.83 154 0.01±0.04 2010 4 183 11.15±18.65 4 407 -0.37±0.85 654 0.01±0.05 2011 7 694 22.62±18.74 7 716 -0.66±0.83 1 797 -0.01±0.04 2 110 -0.74±1.36 2012 6 772 31.86±18.93 6 772 -0.91±1.01 2 015 -0.02±0.03 6 428 -0.65±1.49 2013 4 356 40.16±20.14 4 366 -1.23±0.97 2 296 -0.02±0.04 4 365 -0.55±1.66 2014 1 159 44.50±20.67 1 163 -1.24±0.97 1 537 -0.02±0.03 1 163 -0.43±1.56 1)遗传趋势为平均数±标准差 5. S22品系的选育效果
2006—2014年，S22经过9年的选育。在选育过程中，通过优化群体血统，控制群体近交手段，加强种猪料重比、体型外貌、生长速度等性状的选育，将该品系培育成了一个体型高长、生长速度快、饲料报酬高、体型较好的父系种猪。
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图 2 GZ1对荔枝幼叶的致病性(接种3 d后)
1、2：不刺伤接种及对照；3、4：刺伤接种及对照。
Figure 2. Pathogenicity of GZ1 on young litchi leaves (3 days after inoculation)
1, 2: Non-stabbing inoculation and its control; 3, 4: Stabbing inoculation and its control.
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图 4 GZ1的分生孢子梗和分生孢子的形态(接种7 d后)
A：分生孢子梗；B~F：分生孢子。
Figure 4. Morphology of conidiophores and conidia of GZ1 (7 days after inoculation)
A: Conidiophore; B−F: Conidia.
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图 6 基于凸脐蠕孢ITS、Tub2和rpb2联合构建的NJ系统发育树
上标中的T、ET、IsoT和A分别代表ex-type、ex-epistyle、ex-isotype和 authentic strains。
Figure 6. Neighbor-joining phylogenetic tree constructed based on Exserohilum ITS, Tub2 and rpb2 sequences
In superscript, T, ET, IsoT and A indicate ex-type, ex-epitype, ex-isotype and authentic strains, respectively.
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图 7 不同碳源(A)、温度(B)和pH (C)对GZ1生长的影响
各图中，柱子上方不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)。
Figure 7. Effects of different carbon sources (A), temperatures (B) and pH (C) on the growth of GZ1
In each figure, different lowercase letters on columns indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method).
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图 8 不同生防菌株对GZ1的平板对峙(A)和生长抑制效果(B)
Figure 8. Plate confrontation inhibition effect (A) and growth inhibition effect (B) of different biocontrol strains on GZ1
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图 9 生防菌株对GZ1的平板对峙结果
柱子上方不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05，Duncan’s 法)。
Figure 9. Plate confrontation results of different biocontrol strains on GZ1
Different lowercase letters above the bars indicate significant differences among treatments (P＜0.05，Duncan’s method).
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