狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)感染引起的一种人兽共患中枢神经系统传染病，人类及所有的温血动物均易感，病死率几乎达100%^[1]。现今狂犬病仍呈全球性流行，90%以上分布在亚洲和非洲，对公众健康安全构成严重威胁^[2-3]。固有免疫是机体抵抗外来病原入侵的第一道防线，RABV感染激活宿主固有免疫主要是通过维甲酸诱导基因I(Retinoic acid induced gene I，RIG-I)识别病毒5'−三磷酸化的基因组RNA或者转录前导RNA链(Leader RNA)，从而诱导I型干扰素(Type I interferon，IFN-I)通路的活化，发挥抵抗RABV的作用^[4]；IFN-I系统对于机体抗RABV感染起着非常重要的作用，敲除IFN-I受体的小鼠对RABV感染的敏感性增加^[4]；也有研究显示，敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)或者其下游关键接头分子MyD88(Myeloid differentiation primary response protein 88)的小鼠对于某些中强毒力RABV的保护力显著下降，说明TLR7介导的IFN-I途径也在抗RABV中发挥重要作用^[5-6]。但是，RABV也进化出了拮抗IFN-I作用的方式^[7]。一方面，RABV的磷蛋白(Phosphoprotein，P)能够与TBK-1(TANK-binding kinase 1)相互作用，阻断IRF3(Interferon regulatory factor 3)的磷酸化，阻断其二聚化以及核转移，从而抑制IFN-I的产生^[8]。另一方面，P蛋白还能与激活后的STAT1/2(Signal transducer and activator of transcription 1/2)相互作用，阻止它们的核转移进而抑制下游干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)的表达^[9]。另外，RABV的核蛋白(Nucleoprotein，N)在一定程度上也可以通过抑制IRF3激活的方式，抑制下游IFN-I基因的表达。因此，通过改变N基因序列可达到减弱病毒毒力的效果^[10]。但是，对病毒致病力起关键作用的糖蛋白(Glycoprotein，G)是否在调节或对抗IFN-I途径中发挥着作用？其在RABV抵抗IFN-I通路作用中扮演着什么样的角色？这些问题在目前的研究中都极少涉及。为了探究上述相关问题，我们利用RABV的反向遗传操作系统将弱毒Hep-Flury的G基因替换成CVS-11的G基因，拯救出重组病毒HepG，分别研究弱毒株Hep-Flury、攻毒固定毒株CVS-11和HepG在体内和体外感染对IFN-I通路激活和调控的差异，并对比分析它们在神经细胞中对抗IFN-I抗病毒作用的差异，拟阐释不同RABV的G蛋白与IFN-I通路的相互作用。

1.   材料与方法

1.1   病毒毒株及试验动物

RABV疫苗弱毒株Hep-Flury及致病固定毒株CVS-11由华南农业大学兽医学院兽医微生物学实验室保存。6周龄SPF级雌性昆明系(KM)小白鼠购自南方医科大学实验动物中心，其狂犬病病毒血清、抗体检测均为阴性，健康状况良好，在严格的饲养管理条件下进行试验。所有动物试验均在华南农业大学兽医学院动物生物安全三级(ABSL-3)实验室完成，所有试验程序和条件均遵守《中华人民共和国实验动物管理条例》，并通过了华南农业大学动物福利委员会审查。

1.2   细胞株及培养

细胞株：乳仓鼠肾细胞(BHK-21)、人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)、小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)。其中，BHK-21、SK-N-SH培养于含10%(φ)FBS的DMEM培养基，Neuro-2a细胞培养于含10%(φ)FBS的RPMI-1640培养基，所有细胞均置于37 ℃、5%(φ)CO₂细胞培养箱中培养。

1.3   重组毒株HepG的构建及拯救

利用基于Hep-Flury基因组骨架的反向遗传操作系统及无缝连接技术将弱毒株HEP-Flury的G基因替换成强毒的CVS-11的G基因，构建并拯救出重组毒株HepG，如图1所示。

图  1  RABV重组毒株HepG构建示意图

Figure  1.  Construction diagram of RABV recombinant strain HepG

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在含Hep-Flury基因组全长cDNA的pHEP-3.0质粒的合适位置设计2对引物(表1)，以pHEP-3.0为模板进行PCR，得到L片段和C区段(C区段包括N、P和M基因)。在CVS-11的G基因位置设计1对引物(表1)，以CVS-11 cDNA为模板进行PCR，扩增G基因片段。以上引物均在相应的连接区设计15~20 bp的重叠序列。将上述3个片段扩增回收，利用无缝连接试剂盒(Vazyme)进行连接反应，筛选得到G基因替换的重组质粒pHepG。质粒转染及病毒拯救方法参照郭霄峰等^[11]，利用SuperFect Transfection Reagent(Qiagen)将pHepG和4个辅助质粒pH-N、pH-P、pH-L、pH-G共转染到BHK-21细胞中，培养6 d后，筛选并鉴定出重组病毒，全程以pHEP-3.0及辅助质粒拯救Hep-Flury作为阳性对照。

表  1  HepG构建的引物序列

Table  1.  Primer sequences for construction of HepG

基因片段 Gene segment	引物序列(5′→3′) Primer sequence
HEP-L	F: AGGCCGGTCATCCTTTTGACACCTCAAGTCCAGA
	R: ATTTTAGCATGTACAGGCTTTCATTAATGTCCGGC
HEP-C	F: GCCTGTACATGCTAAAATTCTTGTAYGATGCATCTTG
	R: CTTTCCTTAAGTCTTTTGAGGGATGTTAATAGTTTT
CVS-G	F: CAAAAGACTTAAGGAAAGATGGTTCCTCAGGTTCTT
	R: CAAAAGGATGACCGGCCTTCACAGTCTGATCTCACCT

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1.4   直接免疫荧光法测定病毒滴度

将狂犬病病毒分别倍比稀释(10⁻¹~10⁻⁸)并与BHK-21细胞混合后，铺于96孔细胞培养板中，每个稀释度重复4孔。在37 ℃、5%(φ)CO₂培养箱中培养48 h。弃去细胞培养液，每孔加入预冷丙酮100 μL，然后将培养板放置于−20 ℃冰箱静置1 h。弃去丙酮，用200 μL PBS洗3遍。每孔避光加入25 μL抗RABV的N蛋白荧光抗体(Fujirebio)，于37 ℃条件下孵育1 h。弃去荧光抗体，用200 μL PBS洗涤细胞3次。在荧光显微镜下观察并计数，按照Reed-Muench法计算病毒滴度。

1.5   RT-qPCR测定小鼠脑内的病毒载量及宿主基因表达量

1.5.1   RABV滴鼻接种小鼠

将RABV Hep-Flury、HepG、CVS-11分别对6周龄的SPF级KM小鼠进行滴鼻攻毒(每只小鼠10⁵ FFU)，每组10只小鼠。同时滴鼻DMEM为空白对照，每天观察小鼠状态并称量体质量。

1.5.2   小鼠的心脏灌流

为了排除血液中的细胞因子对检测小鼠脑组织中细胞因子的干扰，在取鼠脑之前对小鼠进行心脏灌流。攻毒后第4、7、10天分别从各试验组和对照组中取3只小鼠，麻醉后，进行活体心脏灌流。

1.5.3   鼠脑采集

小鼠心脏灌流完成后，在生物安全柜内取出完整鼠脑，放入无RNA酶的1.5 mL EP管中。对鼠脑进行编号、标记并称质量，加入适量的Trizol溶液进行研磨处理。

1.5.4   鼠脑总RNA的抽提及反转录

利用HiPure Universal RNA Kits (Magen)试剂盒抽提鼠脑样品总RNA，在抽提时加入DNase I去除基因组DNA污染。用NanoDrop 2000c微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。取等质量的RNA进行反转录，按HiScript^® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme)反转录试剂盒说明书进行操作，引物为Oligo (dT)23和Random hexamers。

1.5.5   RT-qPCR

根据各检测基因的序列设计特异引物(表2)，以GADPH为内参基因。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme)荧光定量试剂盒进行RT-qPCR。反应结束后，对所有靶基因与内参基因GAPDH作均一化处理以消除试验误差，各基因转录水平通过2^−ΔΔCt方法计算得出，表达倍数计为各组中不同基因的转录值与未感染细胞(Mock)组转录值的比值。各个样本靶基因的表达差异分析由GraphPad 5.0软件完成。显著性差异按双因素方差分析(Two-way ANOVA)法计算，以P<0.05、0.01、0.001记为差异显著。

表  2  RT-qPCR检测引物

Table  2.  Primers used for RT-qPCR

基因 Gene	上游引物序列(5′→3′) Forward primer sequence	下游引物序列(5′→3′) Reverse primer sequence
RABV genome	GACAGCGTCAATTGCAAAGCAAAAAT	GGGTACTTGTACTCATATTGATCCACGAT
N	GCACTGGCAGATGACGGAAC	TCGGCGAATGAGTTTGGACG
Leader RNA	TGTAGGGGTGTTACATTTTT	ACGCTTAACAACAAAACC
Cxcl10	TCCATATCGATGACGGGCCA	CAACACGTGGGCAGGATAGG
Dhx58	CCAGAGCACACACATGACCC	CCATAGCGCACCACCACATT
IFN-α4	AGCCTGTGTGATGCAGGAACC	CAGCAAGTTGGTTGAGGAAGAG
IFN-κ	TGGAGTTGGGCAAGTATTTCTTC	GGACTTGGAAAATATAATGAAACATCTTC
IFN-β	ACCTACAGGGCGGACTTCAA	ACACTGTCTGCTGGTGGAGT
IFN-γ	TCAGCAACAGCAAGGCGAAA	ATTGAATGCTTGGCGCTGGA
IL6	TGCCTTCTTGGGACTGATGC	GACAGGTCTGTTGGGAGTGGT
IRF3	TCAGGATCCCGTGGAAGCAT	TGACACGTCCGGCTTATCCT
IRF7	ACTGGCTATTGGGGAGGTC	ACGACCGAAATGCTTCCAGG
ISG15	GACGCAGACTGTAGACACGC	TTAGGCCATACTCCCCCAGC
MDA5	GAGCACCTACGCACTTTCCC	CCACCGTCGTAGCGATAAGC
MyD88	TCATGTTCTCCATACCCTTGGT	AAACTGCGAGTGGGGTCAG
RIG-I	CCTTGATTGCCCTGATGTTG	ATTTCTCCCTGTCCCTCCAA
RNF125	GGCGCACATAAGGACCTGTG	TCATCCAGTTCCCGCTGACA
TLR3	GTGAGATACAACGTAGCTGACTG	TCCTGCATCCAAGATAGCAAGT
TLR7	TCTTTGGGTTTCGATGGTTTCC	GCAGTCCACGATCACATGGG
TLR9	ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT	GAGGCTTCAGCTCACAGGG
GAPDH	AGAGTGTTTCCTCGTCCCGT	CTGTGCCGTTGAATTTGCCG

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1.6   病毒感染Neuro-2a细胞后IFN-I通路相关基因转录水平检测

将Hep-Flury、HepG和CVS-11病毒以相同的感染复数(MOI=3)感染6孔板中的Neuro-2a细胞，同时设置未接毒的Neuro-2a细胞为空白对照。接毒后6、12、24、48 h，在每孔细胞加入1 mL Trizol溶液处理并抽提RNA。利用上述RT-qPCR检测病毒的载量及IFN-I通路相关基因的表达水平。

1.7   IFN-I通路的激活对病毒复制的影响

将Neuro-2a和SK-N-SH细胞接种至直径为3.5 cm的细胞培养板中，细胞贴壁后用无血清培养基洗1遍，然后每板细胞利用脂质体转染50 ng的Poly(I:C)，孵育6 h。之后弃去Poly(I:C)和培养基的混合液，用无血清的培养基洗3遍，以MOI=3接种不同RABV毒株。分别于接毒后1、2、3、4及5 d收集病毒培养上清液120 μL，测定上清液中病毒滴度。

2.   结果与分析

2.1   HepG病毒的拯救

将扩增得到的C、L片段和CVS-11 G基因(图2)回收后，进行无缝连接和重组质粒筛选，进一步利用Hep-Flury反向遗传操作系统拯救出重组病毒HepG(图3)。

图  2  构建重组病毒HepG的扩增片段

M：DNA marker DL10000；1、2：C区段基因；3、4：L片段基因；5、6：CVS-11 G基因

Figure  2.  Amplified fragments for construction of recombinant virus HepG

M: DNA marker DL10000; 1, 2: C-segment gene; 3, 4: L-segment gene; 5, 6: CVS-11 G gene

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图  3  重组病毒HepG的免疫荧光检测

Figure  3.  Immunofluorescence detection of recombinant virus HepG

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将CVS-11、Hep-Flury和HepG滴鼻感染小鼠(10⁵ FFU)，CVS-11和HepG分别在第8天和第10天100%致死小鼠，试验小鼠均呈现麻痹型的狂犬病症状(图4)，说明G蛋白对病毒的致病力起着关键作用。感染Hep-Flury的小鼠在感染第10天出现明显的体质量下降，之后第14天体质量开始回升，出现耸毛、弓背等症状，但16 d后逐渐恢复正常，所有小鼠均成活(图4)。

图  4  3种RABV毒株感染的KM小鼠的体质量变化

Figure  4.  Body weight changes of KM mice infected with three RABV strains

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2.2   各病毒感染鼠脑内的病毒载量及IFN-I通路相关基因转录水平的变化

2.2.1   各病毒滴鼻感染鼠脑病毒载量及病毒基因表达变化

采用RT-qPCR分别检测Hep-Flury、HepG、CVS-11滴鼻感染鼠脑后第4天和第7天N、G基因，leader RNA和病毒基因组RNA的含量。

滴鼻感染小鼠后第4天，Hep-Flury、HepG和CVS-11在鼠脑中的整体复制水平比较低，CVS-11的基因组水平最高(图5A)，而对于leader RNA、N和G基因的转录水平，Hep-Flury显著高于CVS-11 (P<0.05、P<0.01、P<0.05)(图5B~5D)。在感染第7天，CVS-11的复制程度超过Hep-Flury约4 000倍(P<0.001)；HepG的复制水平及基因转录水平介于Hep-Flury和CVS-11之间(图5A)。在感染中后期，HepG和CVS-11的复制量大大增加，感染7 d后小鼠开始发病，10 d内全部死亡；Hep-Flury在脑内的总体复制水平较低，小鼠感染后不死亡(图5B~5D)。

图  5  RABV感染鼠脑后病毒载量和病毒基因转录水平变化

“*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著(t检验)

Figure  5.  Changes of viral load and viral gene transcription in the brains of mice infected with RABV

“*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

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2.2.2   各病毒感染鼠脑诱导IFN-I通路相关基因的表达

小鼠感染Hep-Flury、HepG和CVS-11后，利用RT-qPCR检测小鼠中枢神经系统中IFN-I通路相关分子的表达水平变化。

结果表明，在病毒感染的第4天，IFN-I通路上游基因RIG-I、MDA5、Dhx58以及下游基因ISG15、IL6均在Hep-Flury感染后有较高水平的表达(图6A~6C、6G和6H)，HepG感染后对这些基因的激活水平处于Hep-Flury和CVS-11之间。在病毒感染后第7天，上述基因及TLR3在CVS-11和HepG感染后的激活水平显著高于Hep-Flury(图6A~6D、6F~6H)。另外，IRF3则在3种毒株的不同感染时间都没有显著的表达变化(图6E)。结果说明，弱毒Hep-Flury能够更早地激活IFN-I通路，而致病毒株CVS-11则在感染后期大大刺激IFN-I通路相关基因表达。HepG感染后对IFN-I通路相关基因的激活水平介于Hep-Flury和CVS-11之间，暗示着在RABV感染中枢神经系统中不同G基因对于IFN-I通路的激活具有一定的调节作用。

图  6  RABV感染鼠脑后IFN-I通路相关基因表达分析

“*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著（t检验）

Figure  6.  Expression analysis of IFN-I pathway related genes in the brains of mice infected with RABV

“*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

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RT-qPCR检测不同RABV毒株感染后鼠脑中各IFN基因的表达变化，发现IFN-α4/β/γ/κ这4个基因在3种病毒感染的第4天表达量均较低，各毒株间无显著差异(图7A~7D)，但在HepG和CVS-11感染后第7天诱导的IFN-α4/β/γ基因表达量显著超过了Hep-Flury，其中IFN-γ的表达水平上调最显著(图7C)。而IFN-κ则只在CVS-11感染后第7天显著上调(图7D)。

图  7  RABV感染鼠脑后不同IFN基因表达分析

“*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著（t检验）

Figure  7.  Expression analysis of IFN genes in the brains of mice infected with RABV

“*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

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2.3   RABV感染Neuro-2a细胞对IFN-I通路相关基因转录水平的影响

为了研究Hep-Flury、HepG和CVS-11在感染体外细胞后，IFN-I通路相关基因表达量的变化，我们测定了它们感染(MOI=3)Neuro-2a细胞后的一步生长曲线，并利用RT-qPCR检测感染后6、12、24和48 h IFN-I通路上游和下游分子的表达情况。

不同RABV毒株感染Neuro-2a细胞时，病毒滴度均在感染后第3天达到峰值，CVS-11和HepG的滴度较高，超过了10⁷ FFU/mL，Hep-Flury的滴度较低，接近10⁶ FFU/mL，之后下降较快(图8)。 IFN-I通路上游因子TLR3、RIG-I和IRF7在RNBV感染后6 h即被激活表达，且被Hep-Flury和HepG感染激活的水平显著高于CVS-11(图9A、9E、9F)，而TLR9在HepG感染后12 h和24 h有较高水平的表达(图9C)。MyD88则在Hep-Flury的感染后期(48 h)有显著的上调表达，在HepG和CVS-11感染细胞中的表达差异不显著(图9D)。TLR7在3种病毒感染的不同时间均未有激活表达(图9B)。结果表明，相较于CVS-11，Hep-Flury和HepG感染Neuro-2a细胞能够通过激活TLR3和RIG-I相关的通路，更强地激起体外神经细胞的IFN-I通路反应，HepG感染的激活强度相较Hep-Flury更弱一些。

图  8  不同RABV毒株感染Neuro-2a细胞的一步生长曲线

“*”“**”分别表示CVS-11/HepG与Hep-Flury在P<0.05和P<0.01水平差异显著（t检验）

Figure  8.  One-step growth curve of different RABVs in Neuro-2a

“*” and “**” indicate significant differences between CVS-11/HepG and Hep-Flury at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively (t test)

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图  9  RABV感染Neuro-2a细胞对IFN-I通路上游基因表达的影响

“*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著（t检验）

Figure  9.  Effect of RABV infection on expression of upstream genes of IFN-I pathway in Neuro-2a cells

“*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

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Hep-Flury和HepG感染Neuro-2a细胞后6 h即能快速地激活IFN-α4及下游基因CXCL10和ISG15的表达，在激活能力上，Hep-Flury略强于HepG(图10A、10C、10D)。较为特殊的是，在感染后48 h，只有HepG未上调IFN-β的表达(图10B)。

图  10  RABV感染Neuro-2a细胞对IFN-I通路下游基因表达的影响

“*”“**”“***”分别表示在 P<0.05、 P<0.01、 P<0.001水平差异显著（t检验）

Figure  10.  Effect of RABV infection on expression of downstream genes of IFN-I pathway in Neuro-2a cells

“*”, “**” and “***” indicate significant differences at P <0.05, P <0.01 and P <0.001 levels, respectively (t test)

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2.4   IFN-I通路的激活对3种RABV复制的影响

为了检测体外细胞IFN-I通路激活对不同RABV毒株复制的影响，我们在病毒感染前6 h先用Poly(I:C)刺激神经细胞激活其IFN-I通路，之后再分别接种Hep-Flury、HepG、CVS-11 (MOI=3)，在不同时间测定病毒滴度。从感染Neuro-2a和SK-N-SH的不同RABV复制动力学曲线(图11)可以看出，2种神经细胞在经Poly(I:C)处理后，对Hep-Flury复制的影响较为显著，病毒增殖滴度在早期下降明显，到了第4天和第5天影响减小，说明IFN-I对Hep-Flury接毒后前3天复制的抑制作用较强。CVS-11和HepG在感染Poly(I:C)刺激的Neuro-2a的前2天受到一定程度的抑制，之后回升到正常水平(图11A)。而在SK-N-SH上，CVS-11和HepG对于Poly(I:C)的刺激均不敏感，病毒复制几乎没有受到影响(图11B)。综合来看，2种神经细胞在预先用Poly(I:C)处理之后，能够较显著地抑制Hep-Flury的复制，而对替换了G基因的HepG的影响较弱，从一定程度上说明CVS-11的G基因具有抵抗IFN-I通路作用的能力。

图  11  Poly(I:C)处理体外神经细胞对RABV复制的影响

“*”表示相同RABV毒株感染Poly(I:C)处理和未处理细胞在P<0.05水平差异显著(t检验)

Figure  11.  Effect of Poly(I:C) treatment on the replication of RABV for in vitro nerve cells

“*” indicates significant differences between Poly(I:C) treated and untreated cells infected with the same RABV strain at P<0.05 level (t test)

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3.   讨论与结论

我们前期的研究结果表明弱毒Hep-Flury滴鼻感染小鼠能够更早(感染后第4天)、更强地激活IFN-I相关基因表达，而致病毒株CVS-11则在感染后第7天强烈地激活IFN-I相关基因表达^[12]。为了探讨这2种毒株携带的G基因是否在调节IFN-I通路的作用上有差异，本研究将Hep-Flury的G基因替换成CVS-11的G基因，拯救出重组毒株HepG，分别在小鼠和细胞水平分析不同毒株感染对IFN-I通路相关基因表达调控的影响。结果显示，Hep-Flury在感染后够较快地诱导IFN-I上游基因的表达，重组病毒HepG感染鼠脑激活这些基因的表达水平介于亲本株Hep-Flury和CVS-11之间。这些结果说明不同毒株的G蛋白对于病毒感染激活IFN-I通路的程度具有一定的调节作用。已有研究表明，RABV感染激活宿主IFN-I通路的主要成分是病毒的基因组或转录出的leader RNA^[13-15]，本研究发现在病毒感染后第4天，弱毒Hep-Flury的基因组含量虽然比CVS-11少，但其转录出的leader RNA较多。因此，我们推测leader RNA对IFN-I的诱导能力可能比病毒基因组强，这使得Hep-Flury能够在感染后第4天较强地激活IFN-I通路。有文献报道RABV的G蛋白与病毒leader RNA的转录相关^[14]，据此推测，Hep-Flury的G蛋白也许在一定程度上能够较早地调控转录出leader RNA，使其更强地激活IFN-I通路。这种调控的具体机制还需要进一步研究。在感染后第4天，我们检测到3种毒株对IFN-α4/β/γ/κ这些基因的刺激都不显著，而在感染后第7天，CVS-11和HepG较显著地上调IFN-α4/β/γ，从而推测在感染早期， Hep-Flury虽然激活了IFN-I通路的上游基因，但受到了病毒P蛋白的抑制作用，使得IFN基因的表达未受到明显诱导，到了感染后期，由于CVS-11和HepG在脑内大量地增殖，产生的病毒基因组及leader RNA强烈诱导IFN-I通路，而使得P蛋白无法完全抑制该通路，导致了IFN-α4/β/γ的明显上调。

不管是RABV弱毒株还是致病株都能在鼠脑中激活IFN-I通路相关基因的表达，但它们的复制水平有显著差异，致病株CVS-11在感染后第7天鼠脑内病毒载量约是Hep-Flury的4 000倍。这表明中枢神经系统的IFN-I通路虽然被激活了，但其在对抗致病毒株的能力上似乎受到了限制。为了探究携带不同G基因的RABV在神经细胞中抵抗IFN-I作用的差异，我们预先用Poly(I:C)诱导激活神经细胞Neuro-2a和SK-N-SH的IFN-I通路，再测定3种病毒的复制水平，发现Hep-Flury在感染早期受到IFN-I通路的抑制最为明显，而CVS-11和HepG的复制只略微受到了影响。这些结果说明，CVS-11以及携带其G基因的HepG在神经细胞中具备较好的抵抗IFN-I作用的能力。这也从一个侧面解释了CVS-11和HepG在鼠脑内诱导激活IFN-I通路却依然能够高水平复制的原因。

综上所述，我们推测弱毒株Hep-Flury在感染早期，其G蛋白能够通过某种方式调控leader RNA较高水平地表达，从而较强地诱导IFN-I通路，有效地抑制病毒的复制。而致病毒株较晚诱导IFN-I通路，后期虽然IFN-I通路被强烈激活，但其G蛋白能够在神经细胞中有效地抵抗IFN-I的作用，因此，病毒依然能在脑中大量繁殖。关于致病株的G蛋白如何在神经细胞中抵抗IFN-I作用的疑问尚需更深入的研究进行阐释。