鸡大肠杆菌(O78)超声波灭活菌苗研究
The Immunogenicity of Ultrasonicated Vaccine of Chicken Pathogenic E.coli (O78) Against Colibacillosis
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摘要: 菌毛提取液,荚膜多糖-破伤风类毒素(CPS-TT)载体抗原液及热、甲醛和超声波灭活菌液中加入蜂胶佐剂,制成菌苗免疫石岐杂鸡,77及112d攻毒保护试验结果表明,超声波灭活菌体的免疫原性最好,热灭活菌体最差,菌毛,CPS-TT及甲醛灭活菌体的免疫原性相当。尤其采用超声波处理的菌液作抗原为明显。
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土壤有益微生物包括丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal,AM)真菌、根瘤菌、植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)等,在提高植物生产力和抵抗环境胁迫等方面发挥着至关重要的作用[1-2]。AM真菌能够与80%以上的陆生植物形成共生关系,帮助宿主植物获取养分,特别是磷[3]。根瘤菌是一种与豆科植物形成特定共生关系的革兰阴性细菌,能够通过生物固氮将大气中的N2固定为铵态氮,供宿主植物利用[4]。芽孢杆菌是最常见的PGPR之一,能够通过溶磷、固氮以及释放生长激素促进宿主植物的生长发育[5]。有益微生物单一或2种组合接种在无菌环境中均对植物生长有明显的促进作用。AM真菌和根瘤菌之间存在显著的协同效应。紫花苜蓿同时接种AM真菌和中华根瘤菌,菌根侵染率和结瘤数均显著提高,固氮效率和氮、磷养分吸收的能力增强[6]。AM真菌与芽孢杆菌协同作用能够增加AM真菌的定殖、调节植物激素水平、抑制植物病原体,从而增强植物生长性能[7]。根瘤菌和芽孢杆菌之间存在显著的协同作用,同时接种根瘤菌和芽孢杆菌能够提高土壤酶活性和大豆根瘤的固氮效率,增加大豆产量[8-9]。在农业自然生态系统中,植物根际通常存在土著微生物菌群,外源接种的有益微生物可能会与土著微生物形成竞争,导致接种效果不理想。因此,研究AM真菌、根瘤菌和芽孢杆菌组成的不同复合菌群在未灭菌土壤中的应用效果,对于微生物菌剂的田间应用具有重要的意义。
农业可持续发展是现代农业生产中普遍关注的问题,提高作物养分利用效率和减少化学肥料的使用是实现农业可持续发展的迫切需求,而接种有益微生物和优化栽培模式是提高作物养分利用效率和减少化肥使用的重要措施[10]。间作指在同一地块上种植2种或2种以上作物,是一种可持续发展的种植模式,间作作物地上部和根部种间相互作用促进间作作物产量和养分吸收,豆科−禾本科间作是最常见的间作种植模式[11-12]。在低投入的间作系统中,以AM真菌和PGPR为代表的有益微生物菌群能够介导根部种间相互作用,对土壤肥力保持和植物适应性具有重要作用[13]。在豆科−禾本科间作系统中,同时接种AM真菌和根瘤菌可以提高土壤有效氮和磷含量,增强间作优势[14]。在蚕豆−玉米间作系统中,接种根瘤菌可以增加氮素吸收,从而减少氮肥施用量[15]。在玉米−蚕豆间作系统中,接种根瘤菌能够提高蚕豆对玉米的种间促进作用从而增强间作系统的互补效应和产量优势[16]。玉米和大豆间作是一种常见的农业栽培模式,间作大豆能够显著促进间作玉米的生长,表现出间作优势。在复杂的土壤环境中,接种AM真菌、根瘤菌和芽孢杆菌组成的不同复合菌群对间作系统中玉米和大豆生长以及氮磷吸收的影响鲜见报道。本研究以玉米和大豆为试验材料,在玉米和大豆单、间作系统中,利用未灭菌的土壤,进行接种AM真菌、根瘤菌和芽孢杆菌组成的不同复合菌群盆栽试验,探究接种复合菌群对间作系统中玉米大豆生长及氮磷吸收的影响,旨在为高效利用微生物菌剂促进农业可持续发展提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
本研究选用的大豆Glycine max品种为‘粤春03-3’,属于磷高效大豆品种,在华南酸性红壤地区有较好的产量表现[17];玉米Zea mays品种为‘正甜68’,属于常规商业品种,是适合在南方地区种植的高产品种,抗逆性较强。供试AM真菌菌种为异形根孢囊霉Rhizophagus irregularis,是AM真菌的模式菌株,菌剂通过玉米盆栽扩繁获得,由孢子、菌丝、被侵染的根段和土壤组成,具有促进植物生长的作用。根瘤菌接种剂为BDYD1和BXYD3菌株的混合物,这2个菌株均具有溶磷和高效固氮能力[18-19]。芽孢杆菌接种剂为PLR1和PLR22菌株混合物,这2个菌株均具有溶磷和固氮能力[20]。盆栽试验所用土壤来自广东省广州市增城区华南农业大学教学科研基地和广东省韶关市翁源县,2种土壤按质量比2∶1混合;土壤基本理化性质为:pH 3.99,有效氮42.0 mg·kg−1,有效磷17.5 mg·kg−1。
1.2 试验设计
试验设计包括8种不同接种处理和2种栽培系统。接种处理:不接种对照(CK),单接种AM真菌(A)、根瘤菌(R)、芽孢杆菌(B),双接种AM真菌和根瘤菌(A+R)、AM真菌和芽孢杆菌(A+B)、根瘤菌和芽孢杆菌(R+B),以及接种AM真菌、根瘤菌和芽孢杆菌的复合菌群(A+R+B);栽培系统:单作(单作玉米、单作大豆)和间作(间作玉米、间作大豆)。2种植物在单作和间作中均以15 cm的间距种植,不同处理以完全随机设计排列,4个生物学重复。
盆栽试验中,将3 kg未灭菌土壤与0.6 kg AM真菌菌剂或在相同时间和管理条件下扩繁的未接种AM真菌的空白菌剂均匀混合(质量比5∶1),装入矩形盆(290 mm × 130 mm × 110 mm)中。挑选饱满且具有活力的玉米和大豆种子进行播种,出苗后不同接种处理分别进行2次根瘤菌菌剂和(或)芽孢杆菌菌剂的接种,接种时D600 nm为0.8~1.0。根瘤菌在YMA培养基(甘露醇10 g·L−1、硫酸镁0.2 g·L−1、氯化钠0.1 g·L−1、酵母提取物3 g·L−1,磷酸氢二钾0.25 g·L−1,磷酸二氢钾0.25 g·L−1)中28 ℃震荡培养2~3 d,芽孢杆菌在LB培养基(酵母提取物5 g·L−1、胰蛋白胨10 g·L−1,氯化钠10 g·L−1)中37 ℃震荡培养1 d。植物生长在日光温室中,昼夜气温20~28 ℃,自然光强度在500~1 800 μmol·m−2·s−1,定期浇水保持土壤湿润;植物生长后期所有处理都追施一次氮肥[w(尿素)=0.05 g·kg−1],种植期间进行常规管理。
1.3 收获与测定
盆栽种植60 d后收获,将植株分成地上部和根部,地上部样品装入信封在105 ℃杀青30 min,65 ℃烘干至恒质量并测定干质量。根部样品去除松散的大土块后,将根系浸入装有100 mL的0.2 mmol·L−1 CaCl2 溶液的塑料瓶中,轻轻摇晃,收集的根际悬浊液用于测定根际酸性磷酸酶活性和根际pH。将大豆根系剥除根瘤,记录根瘤个数,烘干至恒质量后测定根瘤干质量;玉米和大豆根系利用扫描仪(Epson1460XL,日本)进行扫描,再通过根系分析软件 WinRHIZO (Regent Instruments Inc.,加拿大)分析总根长、根表面积等根系性状;之后,将根系剪成1 cm的根段并混匀,随机取一部分根段放入100 g·L−1的 KOH溶液中浸泡透明1周后,用5%(体积分数)醋酸墨水染色2 min,采用网格交叉划线法通过实体显微镜观察记录根系的菌根侵染率[21]。将根部样品75 ℃烘干至恒质量并测定干质量。烘干的样品使用磨样机进行粉碎,通过H2SO4−H2O2 法消煮,使用苯酚次氯酸盐法[22]和钼锑抗比色法[23]分别测定植株样品的氮和磷含量。
1.4 根际酸性磷酸酶活性和根际pH的测定
根际土壤中的酸性磷酸酶活性采用对硝基苯磷酸盐法[24]进行测定,以对硝基苯磷酸二钠作为反应底物,在405 nm波长下,用紫外分光光度法测定释放的对硝基苯酚(pNP)含量。将收集在塑料瓶中的涮根溶液用pH计测定pH,烘干并称量塑料瓶中的土壤质量,矫正获得水土质量比为2.5∶1.0的根际pH[25]。
1.5 数据分析
试验数据均采用Microsoft Excel 2021(Microsoft Company,美国)软件进行平均值和标准误计算;采用IBM SPSS Statistics 26进行双因素方差分析和t检验,采用LSD法进行多重比较(P<0.05);使用 Origin 2021对植株功能性状进行主成分分析。
2. 结果与分析
2.1 接种复合菌群对单/间作系统植株干质量的影响
双因素方差分析见结果表1。由表1可知,玉米植株干质量受到接种处理和栽培方式的显著影响(P<0.001);同时,玉米植株干质量在接种处理和栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.05);接种处理显著影响大豆植株干质量(P<0.001)。从不同接种处理来看(图1),与CK相比,单作玉米接种A+B和R+B植株干质量分别增加了14.11%和13.31%;间作玉米接种A+R+B植株干质量降低了17.02%;单作大豆接种R+B植株干质量增加了28.53%。与接种A相比,单作大豆接种A+B植株干质量增加了21.33%;与接种R相比,单作玉米和单作大豆接种R+B植株干质量分别增加了10.23%和29.32%,间作大豆接种A+R植株干质量降低了29.27%;与接种B相比,单作大豆接种R+B植株干质量增加了15.46%。与接种A+R相比,接种A+R+B的间作玉米植株干质量降低了21.62%,间作大豆植株干质量增加了38.14%。与接种A+B相比,接种A+R+B的单作玉米和间作玉米植株干质量分别降低了8.82%和21.65%,间作大豆植株干质量增加了30.77%。与接种R+B相比,接种A+R+B的间作玉米和单作大豆植株干质量分别降低了22.37%和17.94%。从不同栽培方式来看(图1),无论在哪种接种处理,间作玉米都比单作玉米具有更大的植株干质量(接种A+R+B除外);相反,接种A+B处理时,间作大豆植株干质量比单作大豆降低了22.01%。
表 1 接种处理(I)、栽培方式(C)及交互作用(I×C)对玉米和大豆植株生长、菌根侵染率、结瘤性状和根际性状影响的方差分析1)Table 1. Variance analysis of the effects of inoculation treatment (I), cultivation method (C), and their interactions (I×C) on plant growth, mycorrhizal colonization rate, nodule trait, and rhizosphere trait of maize and soybean变异来源Variance source I C I×C 玉米植株干质量 Plant dry weight of maize 4.43*** 189.6*** 3.02* 大豆植株干质量 Plant dry weight of soybean 5.68*** 0.07 1.66 玉米植株氮含量 Plant N content of maize 1.39 81.23*** 0.57 大豆植株氮含量 Plant N content of soybean 5.58*** 11.62** 2.31* 玉米植株磷含量 Plant P content of maize 4.07** 85.18*** 4.65*** 大豆植株磷含量 Plant P content of soybean 2.94* 43.55*** 0.86 玉米总根长 Total root length of maize 1.84 63.57*** 1.1 大豆总根长 Total root length of soybean 3.32** 4.28* 0.75 玉米根表面积 Root surface area of maize 1.17 35.8*** 1.56 大豆根表面积 Root surface area of soybean 2.15 20.24*** 0.61 玉米菌根侵染率 Mycorrhizal colonization rate of maize 1.95 17.07*** 4.2** 大豆菌根侵染率 Mycorrhizal colonization rate of soybean 0.86 60.96*** 0.67 根瘤个数 Nodule number 5.75*** 15.97*** 0.69 根瘤干质量 Nodule dry weight 2.97* 31.21*** 0.18 玉米根际pH pH in maize rhizosphere 1.8 12.44*** 4.38*** 大豆根际pH pH in soybean rhizosphere 2.8* 31.83*** 2.25* 玉米根际酸性磷酸酶活性 ACP activity in maize rhizosphere 3.98** 21.72*** 2.36* 大豆根际酸性磷酸酶活性 ACP activity in soybean rhizosphere 3.03* 0.65 5.07*** 1) * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001; No significance. 图 1 不同接种处理与栽培方式对玉米和大豆生长的影响图中数据为4次重复的平均值及标准误;柱子上不同大、小写字母分别表示单作或间作中不同接种处理间存在显著差异(LSD法,P<0.05);*、**、***分别表示在相同接种处理下单作与间作之间在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。Figure 1. Effects of different inoculation treatments and cultivation methods on the growth of maize and soybeanData in the figure represented the mean and standard error of four replicates. Different uppercase or lowercase letters indicated the significant differences among different inoculation treatments in intercropping or monoculture, respectively (LSD method, P<0.05). *, ** and *** indicated the significant differences between monoculture and intercropping under the same inoculation treatment at the levels of 0.05, 0.01 and 0.001, respectively (t-test).2.2 接种复合菌群对单/间作系统植株氮和磷含量的影响
表1可知,玉米植株氮含量受栽培方式影响显著(P<0.001);大豆植株氮含量受接种处理(P<0.001)和栽培方式(P<0.01)的影响显著,接种处理与栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.05)。从不同接种处理来看(图2a、2b),与CK相比,单作玉米接种A+B、R+B和A+R+B植株氮含量分别增加了30.02%、20.56%和18.87%;单作大豆接种A+B和R+B植株氮含量分别增加了19.28%和33.55%。与接种A相比,接种A+B的单作玉米和单作大豆植株氮含量分别增加了21.29%和19.46%;与接种R相比,单作玉米接种A+B和R+B植株氮含量分别增加了29.17%和19.77%,单作大豆接种R+B植株氮含量增加了20.74%,间作大豆接种A+R植株氮含量降低了27.05%。单作大豆接种R+B植株氮含量比接种B增加了15.32%,单作大豆接种A+R+B植株氮含量比接种R+B降低了14.95%;间作大豆接种A+R+B植株氮含量比接种A+R和A+B分别增加了42.08%和32.96%。从不同栽培方式来看(图2a、2b),间作显著增加了玉米植株氮含量(接种A+R+B除外);与相应的单作大豆相比,A+B处理的间作大豆植株氮含量降低了25.41%。
图 2 不同接种处理和栽培方式对玉米和大豆单株氮或磷含量的影响图中数据为4次重复的平均值及标准误;柱子上不同大、小写字母分别表示单作或间作中不同接种处理间存在显著差异(LSD法,P<0.05);*、**、***分别表示在相同接种处理下单作与间作之间在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。Figure 2. Effects of different inoculation treatments and cultivation methods on N or P content per plant of maize and soybeanData in the figure represented the mean and standard error of four replicates. Different uppercase and lowercase letters indicated the significant differences among different inoculation treatments in intercropping or monoculture, respectively (LSD method, P<0.05). *, ** and *** indicated the significant differences between monoculture and intercropping under the same inoculation treatment at the levels of 0.05, 0.01 and 0.001, respectively (t-test).表1可知,玉米植株磷含量受到接种处理(P<0.01)和栽培方式(P<0.001)的显著影响,且在接种处理和栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.001)。从不同接种处理来看(图2c、2d),与CK相比,单作玉米接种A+B和R+B植株磷含量分别增加了17.77%和16.84%,单作大豆接种R+B植株磷含量增加了17.29%,间作玉米接种A+R+B植株磷含量降低了40.05%;单作大豆接种A+B植株磷含量比接种A增加了13.41%,间作大豆接种A+R植株磷含量比接种R降低了23.70%;间作玉米接种A+R+B植株磷含量比接种A+R、A+B和R+B分别降低了36.35%、31.55%和32.46%;单作大豆接种A+R+B植株磷含量比接种R+B降低了12.80%。从不同栽培方式来看(图2c、2d),间作显著增加了玉米植株磷含量(接种A+R+B除外);与相应的单作大豆相比,A+R和A+B处理的间作大豆植株磷含量分别降低了24.84%和28.08%。
2.3 接种复合菌群对单/间作系统根系生长的影响
表1可知,玉米总根长受到栽培方式的显著影响(P<0.001);大豆总根长受到接种处理(P<0.01),和栽培方式(P<0.05)的显著影响。从不同接种处理来看(图3a、3b),与CK相比,接种A、A+R、A+B、R+B和A+R+B的单作玉米总根长分别增加了22.76%、16.37%、22.42%、17.40%和16.28%,而间作玉米各处理间总根长无显著差异;与CK相比,接种B的单作大豆总根长增加了23.44%,接种B和R+B的间作大豆总根长分别增加了35.77%和34.78%;单作玉米接种R+B的总根长比接种R增加了15.16%。与接种B相比,接种A+B和R+B的单作玉米总根长分别增加了20.85%和15.89%,接种A+B的间作大豆总根长降低了21.38%。从栽培方式来看(图3a),间作显著促进了玉米总根长(接种A和A+R+B的除外)。
图 3 不同接种处理和栽培方式对玉米和大豆根系性状的影响图中数据为4次重复的平均值及标准误;柱子上不同大、小写字母分别表示单作或间作中不同接种处理间存在显著差异(LSD法,P<0.05);*、**、***分别表示在相同接种处理下单作与间作之间在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。Figure 3. Effects of different inoculation treatments and cultivation methods on root traits of maize and soybeanData in the figure represented the mean and standard error of four replicates. Different uppercase and lowercase letters indicated the significant differences among different inoculation treatments in intercropping or monoculture, respectively (LSD method, P<0.05). *, ** and *** indicated the significant differences between monoculture and intercropping under the same inoculation treatment at the levels of 0.05, 0.01 and 0.001, respectively (t-test).表1可知,玉米和大豆的根表面积受到栽培方式的显著影响(P<0.001)。从不同接种处理来看(图3c、3d),与CK相比,接种B和R+B的间作大豆根表面积分别增加了40.37%和39.37%。与接种A相比,间作玉米接种A+B的根表面积增加了48.26%。从不同的栽培方式来看(图3c、3d),与相应的单作相比,接种B、A+B和R+B处理的间作玉米根表面积分别增加了82.26%、86.99%和27.79%,接种B和A+R处理的间作大豆根表面积分别降低了26.27%和21.94%。
2.4 接种复合菌群对单/间作系统菌根侵染和结瘤性状的影响
表1可知,玉米菌根侵染率受到栽培方式的显著影响(P<0.001),且在接种处理和栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.01);大豆菌根侵染率也受到栽培方式的显著影响(P<0.001)。从不同的接种处理来看(图4a、4b),接种R+B的间作玉米菌根侵染率比CK增加21.47%,接种A+R+B的间作玉米菌根侵染率比CK降低了18.58%,接种B的单作大豆菌根侵染率比CK降低了10.18%。单作玉米接种A+B菌根侵染率比单接种A增加了29.92%,间作玉米接种R+B菌根侵染率比接种R、B分别增加了18.01%和35.47%。间作玉米接种A+R+B菌根侵染率比接种A+R、A+B和R+B分别降低了27.54%、21.81%和32.98%。从不同栽培方式来看(图4a、4b),与相应的单作玉米相比,接种A、R、A+R和R+B处理的间作玉米菌根侵染率显著增加,而A+R+B处理的降低了19.36%;与相应单作大豆相比,CK、R、B、A+B和A+R+B处理的间作大豆菌根侵染率显著降低。
图 4 不同接种处理和栽培方式对菌根侵染率和结瘤性状的影响图中数据为4次重复的平均值及标准误;柱子上不同大、小写字母分别表示单作或间作中不同接种处理间存在显著差异(LSD法,P<0.05);*、**、***分别表示在相同接种处理下单作与间作之间在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。Figure 4. Effects of different inoculation treatments and cultivation methods on mycorrhizal colonization rate and nodule traitData in the figure represented the mean and standard error of four replicates. Different uppercase and lowercase letters indicated the significant differences among different inoculation treatments in intercropping or monoculture, respectively (LSD method, P<0.05). *, ** and *** indicated the significant differences between monoculture and intercropping under the same inoculation treatment at the levels of 0.05, 0.01 and 0.001, respectively (t-test).表1可知,大豆的根瘤个数受接种处理和栽培方式的显著影响(P<0.001);大豆的根瘤干质量受接种处理(P<0.05)和栽培方式(P<0.001)的显著影响。从不同接种处理来看(图4c、4d),接种R、A+R和R+B的单作大豆根瘤个数比CK增加了38.13%、52.54%和50.69%,接种R+B和A+R+B的间作大豆根瘤个数比CK增加了90.83%和65.00%;接种R+B的单作大豆根瘤干质量比CK增加了30.41%。与接种A相比,接种A+R单作大豆和间作大豆根瘤个数分别增加了51.70%和91.25%,单作大豆根瘤干质量增加了28.18%;单作大豆接种R+B根瘤干质量比接种R增加了29.43%,接种R+B单、间作大豆根瘤个数比接种B分别增加了48.23%和54.73%,接种R+B单作大豆根瘤干质量比单接种B增加了49.66%。单作大豆接种A+R+B根瘤个数比接种A+R降低了30.08%,单作大豆接种A+R+B根瘤个数和根瘤干质量比接种R+B分别降低了29.23%和26.29%。从不同栽培方式来看,与相应的单作相比,接种A的间作大豆根瘤个数降低了45.45%,接种B、A+R和R+B的间作大豆根瘤干质量降低了45.08%、39.82%和30.10%(图4c、4d)。
2.5 接种复合菌群对单/间作系统根际土壤的影响
从表1可知,玉米根际pH受到栽培方式的显著影响,且在接种处理和栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.001);大豆根际pH受到接种处理(P<0.05)和栽培方式(P<0.001)的显著影响,且在接种处理和栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.05)。从不同接种处理来看(图5a、5b),与CK相比,接种B的单作玉米根际pH降低了5.89%,相反,接种B的间作玉米根际pH升高了3.84%;接种R、A+R、A+B、R+B和A+R+B的单作大豆根际pH比CK分别降低了1.86%、1.78%、1.47%、3.63%和4.64%。间作玉米接种A+B和单作大豆接种A+R根际pH比接种A分别降低了3.51%和1.44%,单作大豆接种R+B根际pH比接种R或B分别降低了1.80%或3.28%,单作玉米接种A+B和R+B根际pH比接种B分别升高了7.11%和5.40%,间作玉米接种A+B和R+B根际pH比接种B分别降低了4.27%和4.10%;接种A+R+B的间作玉米和单作大豆根际pH比接种A+R分别降低了4.64%和2.91%,接种A+R+B的单作玉米和单作大豆根际pH比接种A+B分别降低了4.04%和3.23%。从不同栽培方式来看,与相应单作相比,CK、A+B和R+B处理的间作玉米根际pH分别降低了4.66%、5.98%和4.28%,R+B和A+R+B处理的间作大豆根际pH分别升高了5.34%和5.16%(图5a、5b)。
图 5 不同接种处理和栽培方式对玉米和大豆根际pH值和酸性磷酸酶活性的影响图中数据为4次重复的平均值及标准误;柱子上不同大、小写字母分别表示单作或间作中不同接种处理间存在显著差异(LSD法,P<0.05);*、**、***分别表示在相同接种处理下单作与间作之间在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。Figure 5. Effects of different inoculation treatments and cultivation methods on pH and acid phosphatase activities in the rhizosphere of maize and soybeanData in the figure represented the mean and standard error of four replicates. Different uppercase and lowercase letters indicated the significant differences among different inoculation treatments in intercropping or monoculture, respectively (LSD method, P<0.05). *, ** and *** indicated the significant differences between monoculture and intercropping under the same inoculation treatment at the levels of 0.05, 0.01 and 0.001, respectively (t-test).表1可知,玉米根际酸性磷酸酶活性(APA)受到接种处理(P<0.01)和栽培方式(P<0.001)的显著影响,且在接种处理和栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.05);大豆根际APA受到接种处理显著影响(P<0.05),且在接种处理和栽培方式之间存在显著的交互作用(P<0.001)。从不同接种处理来看(图5c、5d),单作玉米接种A+R+B和间作玉米接种R+B的APA比CK分别增加了22.28%和62.68%,接种A+R的单作大豆根际APA比CK增加了77.77%,接种A、B、A+R、A+B和R+B的间作大豆APA比CK分别降低了59.76%、49.51%、82.54%、76.24%和49.95%;单作大豆接种A+R根际APA比接种A增加了86.21%,间作玉米接种R+B根际APA比接种R增加了85.61%,间作大豆接种A+R和R+B根际APA比接种R分别降低了81.87%和48.05%;单作玉米接种A+B根际APA比接种B降低了19.43%,间作玉米接种R+B根际APA比接种B增加了62.43%;接种A+R+B的单作玉米、间作玉米和间作大豆根际APA比接种A+R分别增加了33.35%、92.09%和331.66%,接种A+R+B的单作玉米和间作大豆根际APA比接种A+B分别增加了31.24%和217.23%。从不同栽培方式来看(图5c、5d),与相应的单作玉米相比,接种A+B和R+B的间作玉米根际APA分别增加了52.55%和109.17%;与相应的单作大豆相比,接种A+R和A+B的间作大豆根际APA分别降低了79.64%和69.41%,而CK的间作大豆根际APA增加了107.23%。
2.6 基于不同接种处理和栽培方式的主成分分析
由图6可以看出,玉米栽培系统中,PC1和PC2累计贡献度达66.2%;大豆栽培系统中,PC1和PC2累计贡献度达58.9%。在玉米栽培系统中,PC1非常明显地将单作玉米和间作玉米样本点分开,且2个置信椭圆重叠部分较小,说明栽培方式对玉米的影响较大。在大豆栽培系统中,PC1也将单作大豆和间作大豆的样本点分开,但2个置信椭圆重叠部分较大,说明栽培方式对大豆的影响相对较小。在玉米栽培系统中,根系性状、菌根侵染率与植株干质量和植株氮、磷含量呈正相关关系,根际pH与植株干质量以及植株氮、磷含量呈负相关关系,表明玉米的植株干质量和植株氮、磷含量受根系性状和菌根侵染率影响较大;在大豆栽培系统中,根系性状与植株干质量以及植株氮、磷含量呈正相关关系,菌根侵染率和根瘤性状与植株氮、磷含量呈正相关关系,根际pH与植株干质量以及植株氮、磷含量呈负相关关系,表明大豆的植株干质量和植株氮、磷含量受根系性状、菌根侵染率和根瘤性状影响较大。
图 6 功能变量的主成分分析(PCA)PDW:植株干质量;N、P:植株氮、磷含量;L:总根长;S:根表面积;MCR:菌根侵染率;NN:根瘤数目;NDW:根瘤干质量;pH:根际pH;APA:根际酸性磷酸酶活性;置信椭圆:95%的置信区间。Figure 6. Principal component analysis (PCA) of functional variablesPDW: Plant dry weight; N, P: N or P content per plant; L: Total root length; S: Root surface area; MCR: Mycorrhizal colonization rate; NN: Nodule number; NDW: Nodule dry weight; pH: The pH value in rhizosphere; APA: Acid phosphatase activity in rhizosphere; Confidence ellipse: 95% confidence interval.3. 讨论与结论
3.1 接种处理对玉米和大豆生长及氮磷含量的影响
已有研究表明,接种丛枝菌根真菌(A)、根瘤菌(R)和芽孢杆菌(B)均能促进植物生长[26]。本研究发现,与不接种(CK)相比,接种AM真菌、根瘤菌或芽孢杆菌的玉米和大豆植株干质量以及氮、磷含量并没有显著增加,这可能由于本研究使用的是未灭菌的土壤,一方面,土壤存在本土的丛枝菌根真菌、根瘤菌和芽孢杆菌,可以促进不接种CK的植株生长;另一方面,接种单一菌株在面对土壤中复杂且代谢多样化的微生物群落时,存在功能单一、适应能力差等问题[27-28]。不同的AM真菌、根瘤菌和芽孢杆菌之间组合双接种处理比单一接种表现出较好的接种效果,与CK相比,单作大豆接种R+B、单作玉米接种A+B和R+B的植株干质量和氮磷含量显著增加,这与已有的研究结果[5, 7, 29]一致。在复杂的土壤中,复合菌群更有利于外源菌剂的存活及发挥促生的作用;不同双接种处理之间接种效果不同。单作玉米和大豆双接种A+B和R+B的植株干质量显著高于A+R处理,间作大豆双接种R+B的植株干质量显著高于A+R处理,植株氮磷含量也有相同的趋势,说明在双接种处理中芽孢杆菌的溶磷能力可能发挥了重要作用,具体的机制仍需进一步探究。与双接种处理相比,接种A+R+B并没有表现出更好的累加效应,接种A+R+B的单作和间作玉米植株干质量比接种A+B的显著降低,接种A+R+B的单作大豆的植株干质量和氮磷含量比接种R+B的显著降低。这可能是由于潜在的种间竞争,多种微生物之间的相互作用可能会通过消耗宿主营养导致宿主适应性减弱,从而降低了多菌株的接种效果[30-31]。
3.2 间作对玉米和大豆生长及氮磷含量的影响
间作更有利于玉米生长,本研究中除接种A+R+B的处理外,间作玉米的植株干质量和氮磷含量均高于单作,这与前人研究结果[10]一致。禾本科与豆科作物的间作中,豆科作物往往有利于禾本科作物生长,而自身的生长受到抑制[32]。本研究中,与单作大豆相比,接种A+B间作大豆植株干质量和氮磷含量显著降低,双接种A+R间作大豆植株磷含量显著降低、大豆生长受到抑制,接种R+B间作大豆植株干质量和氮磷含量没有显著降低;与接种A+R或A+B相比,接种R+B的间作大豆植株干质量和氮磷含量显著增加(A+B植株磷含量除外)。表明接种R+B促进了间作大豆植株生长和氮磷吸收,部分减弱了间作对其的生长抑制。在不同氮素供应条件下,间作玉米产量均高于单作玉米,间作增加了土壤有益微生物的丰度,提高了作物对氮素的利用效率。适量的施氮间作优势会更加显著,适宜的施磷水平可以缓解间作玉米和大豆之间对氮素营养的竞争,获得更高的氮肥利用率[33-34]。接种有益微生物通过提高氮磷的利用效率可以促进间作优势,在光热水资源丰富的南方丘陵旱地推广接种有益微生物的间作栽培模式具有很大的发展前景[35]。
3.3 接种和间作处理促进玉米和大豆生长的可能机制
前人研究发现,AM真菌、根瘤菌或芽孢杆菌复合接种能够显著改善作物根系性状[26]。间作能够提高优势作物和降低劣势作物的根系性状,竞争性强的作物可以通过增加根系性状来增加间作系统的产量和磷吸收[32]。本研究发现,与CK或接种B相比,接种A+R、A+B和R+B单作玉米总根长显著增加;间作显著增加了接种A+R、A+B和R+B玉米总根长以及接种A+B和R+B玉米根表面积;根系性状与植株干质量和氮磷含量呈正相关。表明复合菌群接种能够促进玉米根系生长,发达的根系有利于获取更多的土壤养分,从而促进作物生长;间作可以促进优势作物的根系生长,根系的种间相互作用在很大程度上导致了地上部的高产[36]。间作玉米的根系性状在不同的接种处理之间没有显著差异,这可能是间作的促进作用掩盖了接种效果。与CK相比,接种R+B显著促进了间作大豆的总根长和根表面积,但接种R+B的单、间作大豆根系性状指标之间无显著差异,表明接种R+B改善了间作大豆的根系性状,进而增加植株氮磷含量和干质量,减弱了间作的抑制作用。
AM真菌和根瘤菌的定殖能够促进作物的氮磷吸收[37-39]。本研究发现,间作玉米接种R+B的菌根侵染率显著高于接种R或B的;单作玉米接种A+B菌根侵染率显著高于接种A的,说明接种复合菌群可以促进菌根侵染[40]。与相应的单作相比,接种A+R和R+B的间作玉米菌根侵染率显著增加,接种A+B的间作大豆菌根侵染率显著降低,表明间作会改变菌根侵染,从而导致间作作物的生长差异。这与小麦与扁豆间作中,小麦的菌根侵染率增加而扁豆的菌根侵染率降低的结果类似[12]。与CK相比,间作大豆接种R+B根瘤个数显著增加,表明接种R+B能够改善菌根侵染和结瘤性状,从而促进间作大豆的氮磷吸收,减弱与玉米间作的竞争劣势。接种A+R和R+B的单作大豆根瘤个数显著高于CK;与接种R相比,接种R+B单作大豆根瘤干质量显著增加,接种A+R单作大豆的根瘤个数和根瘤干质量也有增加的趋势,说明与A或B双接种能够促进结瘤。PCA结果发现,菌根侵染率和根瘤性状与植株氮磷含量呈正相关关系。表明在复杂的土壤环境中,相较于单一接种,双接种复合菌群更能够促进玉米的菌根侵染和大豆的结瘤,从而促进作物获取氮磷养分。本研究中,间作大豆的根瘤个数和根瘤干质量整体低于单作大豆,这与前人的研究结果“间作促进大豆结瘤”[41]不一致。低磷会抑制大豆结瘤[42],本研究中土壤有效磷含量较低且没有额外施加磷肥,玉米与大豆的种间竞争导致大豆获取的磷养分较少,可能抑制了间作大豆结瘤。
根际pH是影响土壤养分有效性的重要影响因子[43]。本研究发现,与土壤本底pH 3.99相比,不同处理均提高了根际土壤的pH,这有利于酸性土壤养分的活化,如闭蓄态磷的释放,从而促进植物生长[44]。本研究中,根际pH的变化与玉米和大豆的生长响应变化趋势并不一致,表明不同处理根际pH的变化不是影响玉米、大豆生长和氮磷吸收的主要机制。酸性磷酸酶能够将有机磷水解为无机磷,是反映土壤有机磷分解潜力的重要指标[45-46]。禾本科与豆科作物间作可以通过豆科作物的根际增加土壤中难溶性无机和有机磷的活化,从而促进禾本科作物对磷素的获取[47-48]。本研究发现,大豆比玉米具有更高的根际酸性磷酸酶活性(APA)。与CK或单一接种相比,间作玉米接种R+B和单作大豆接种A+R的根际APA显著增加;与相应单作相比,接种A+B和R+B的间作玉米根际APA显著增加,而接种A+R和A+B的间作大豆根际APA显著降低,接种R+B的单作大豆与间作大豆根际APA差异不显著。表明,接种复合菌群以及间作能够改变玉米和大豆的根际过程,增加作物对磷养分的吸收。
3.4 结论
双接种相较于不接种和单一接种表现出较好的接种效果,而接种A+R+B复合菌群并没有表现出更好的累加效应。间作显著增加了玉米的植株干质量和氮磷含量(A+R+B处理除外),而双接种R+B促进了间作大豆的植株生长和氮磷吸收,部分缓解了间作对大豆生长的抑制作用。可见,在复杂的土壤环境中,单一接种较难发挥作用,双接种复合菌群和间作更有利于提高玉米的生长和氮磷吸收。因此,在农业生产中,应注重不同菌种的选择与搭配以及栽培模式的优化,构建出更加高效、稳定的栽培系统,充分发挥有益微生物接种和间作的优势,提高作物产量和养分利用效率。
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