黄单胞菌属是植物病原菌中较大的类群，能侵染超过11科70属124种单子叶植物和57科170属268种双子叶植物.该属几种主要的致病菌有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc)、水稻白叶枯菌X. oryzae pv. oryzae(Xoo)和柑橘溃疡病菌X. axonopodis pv. citri, (Xac)等，能造成包括十字花科作物、水稻、豆类作物、番茄和柑橘等的重大经济损失^[1].随着分子生物学和细菌基因组学的发展，多种黄单胞菌的基因组得到测序，这为深入研究黄单胞菌的致病机理、开发新的防治药物或手段提供了有力条件.

研究细菌脂肪酸合成代谢，寻找新的抗菌药物作用靶点，开发新的抗菌药物是微生物学研究的热点领域^[2-3].细菌以酰基载体蛋白(Acyl carrier protein, ACP)为载体，利用Ⅱ型脂肪酸合成酶系通过聚合、还原、脱水和再还原，从头合成脂肪酸，其特点是每一步反应均由独立的酶催化^[4].在模式细菌大肠埃希菌中聚合反应由3-酮脂酰ACP合成酶(KAS)催化^[5].根据生理功能的差异，大肠埃希菌Escherichia coli 的3-酮脂酰ACP合成酶可分为3种类型：3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ(FabH)在脂肪酸合成的起始反应中起作用，而3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ和Ⅱ(FabB和FabF)则是脂肪酸合成循环反应中的关键酶，被称做长链3-酮脂酰ACP合成酶^[6-7]，其中FabB是大肠埃希菌合成不饱和脂肪酸的关键酶之一，参与不饱和脂肪酸的从头合成^[8], FabF能将棕榈油酸延伸为顺-11-十八烯酸，参与受温度控制的脂肪酸组成调节^[9].

植物病原菌野油菜黄单胞菌X.campestris 8004脂肪酸合成代谢的研究尚未完全展开，通过比对发现，其基因组中有XcfabF1(Xc3225)、XcfabF2(Xc4087)和XcfabB(Xc3652)这3个基因标注为3-酮脂酰ACP合成酶，其功能尚未得到鉴定.本论文主要通过遗传互补和体外分析等手段，研究以上3个基因在野油菜黄单胞菌脂肪酸合成代谢中的作用.

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   菌株、质粒和培养基

所用细菌菌株和质粒见表 1.LB用作培养大肠埃希菌的丰富培养基，RB作为检测脂肪酸合成突变菌株的培养基.培养基中的常用试剂和抗生素有100 mg·L^-1氨苄青霉素、30 mg·L^-1卡那霉素、0.2 g·L^-1的L-阿拉伯糖、1 mmol·L^-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG).体积分数为20%的油酸(Oleate)用无水乙醇配制，并用KOH将pH调至中性，在RB培养基中油酸的最终体积分数为0.1 mL·L^-1.

表  1  试验相关的菌株和质粒

Table  1.  The strains and plasmids used in this work

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.1.2   主要试剂来源

限制性内切酶、T4连接酶、Taq、pfu DNA聚合酶、DNA marker DL2000、标准蛋白质等试剂、T-载体克隆、质粒提取和DNA凝胶回收等试剂盒均购自TaKaRa公司；氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG、L-阿拉伯糖、各种脂肪酸等试剂购自Sigma公司；PCR扩增引物寡核苷酸由上海Sangon公司合成.

1.2   方法

1.2.1   质粒构建和重组DNA技术

以野油菜黄单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增XcfabF1、XcfabF2 和XcfabB.扩增XcfabF1的引物为：5′-CAATCATATGAGTCGTCGTGTTG-3′和5′-CTTGAAGCTTTCAGATGCGCTTGAACA-3′；扩增XcfabF2的引物为：5′-CAATCATATGGCCCCGGTGCCAT-3′和5′-CAATAAGCTTTAGCGTGCCTGCCCGA-3′；扩增XcfabB的引物为：5′-CTTACATATGCGCCGTGTTGTC-3′和5′-CTTGAAGCTTTTACAGGCCGAACA-3′(下划线处分别代表限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ酶切位点).PCR扩增产物分别连接至pMD19-T载体，通过测序验证获得的质粒pHJ1(fabF1)、pHJ2(fabF2)和pHJ3(fabB).使用NdeⅠ和HindⅢ分别消化pHJ1(fabF1)、pHJ2(fabF2)和pHJ3(fabB)，获得的基因片段分别克隆到用阿拉伯糖诱导表达的载体pBAD24M上，得到互补载体pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2)和pHJ6(fabB).用同样的方法将3个基因分别克隆到pET28(b)上，得到表达载体pHJ7(fabF1)、pHJ8(fabF2)和pHJ9(fabB).

所采用的DNA操作，包括DNA的酶切、片段回收、连接、转化等方法，参照文献[12].

1.2.2   制备无细胞抽提物

根据Heath等^[13]的方法制备脂肪酸合成无细胞提取物.用Bradford方法，以牛血清白蛋白为标准，确定蛋白质浓度.分装并添加甘油至体积分数为10%，-80 ℃条件下保存备用.

1.2.3   蛋白质的表达与分离纯化

将表达载体pHJ7(fabF1)、pHJ8(fabF2)和pHJ9(fabB)分别转化大肠埃希菌BL21(DE3)后，野油菜黄单胞菌的FabF1、FabF2和FabB蛋白的表达和纯化参照文献[14-15]进行.同时分离纯化哈氏弧菌脂酰ACP合成酶(AasS)和大肠埃希菌holo-ACP蛋白^[14-15].

1.2.4   3-酮脂酰ACP合成酶体外活性分析

体外检测野油菜黄单胞菌FabF1、FabF2和FabB蛋白在细菌脂肪酸合成延伸中的功能, 参照文献[14-15].具体做法：总反应体系为50 μL，其中含有100 mmol·L^-1 Tris-HCl(pH8.0)，20 μmol·L^-1 ACP，10 mmol·L^-1 ATP，10 mmol·L^-1 MgSO₄，5 mmol·L^-1 DTT，300 μmol·L^-1脂肪酸，脂酰ACP合成酶1 μg，100 μmol·L^-1丙二酸单酰CoA，再添加100 μmol·L^-1 NADH和100 μmol/L NADPH，加入无细胞抽提物0.2 μg，根据不同反应需要加入0.2 μg酶蛋白，37 ℃保温培养2~3 h.反应结束后，用20%非变性聚丙烯酰胺凝胶(含2.5 mol·L^-1尿素)电泳分析脂酰ACP^[16].

1.2.5   脂肪酸组成分析

在合适的条件下培养细菌10 mL，离心收集菌体，按照文献[15]的方法，提取细菌的脂肪酸，并转化为脂肪酸甲酯.样品送华南农业大学测试中心，进行脂肪酸组成GC-MS分析.

2.   结果与分析

2.1   野油菜黄单胞菌XcfabF1、XcfabF2和XcfabB基因的克隆及酶蛋白表达与纯化

通过PCR扩增获得野油菜黄单胞菌XcfabF1、XcfabF2和XcfabB基因，并克隆到受外源阿拉伯糖诱导调控的质粒载体pBAD24M(图 1a)，得到功能检测质粒pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2)和pHJ6(fabB).同时将上述基因克隆到表达载体pET-28(b)上, 构建能在大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中高效表达的载体：pHJ7(fabF1)、pHJ8(fabF2)和pHJ9(fabB)(图 1b).可溶性表达分析显示，3个蛋白均为可溶性蛋白(结果未列).然后采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析，分别分离纯化了N端融合有His-tag标签的FabF1、FabF2和FabB蛋白，如图 1c所示.

图  1  表达质粒的构建与FabF1、FabF2和FabB蛋白的纯化

M₁: DNA marker DL 2000; 1: pBAD24M/NdeⅠ&HindⅢ; 2: pHJ4/NdeⅠ&HindⅢ; 3: pHJ5/NdeⅠ&HindⅢ; 4: pHJ6/NdeⅠ&HindⅢ; 5: pET28(b)/NdeⅠ&HindⅢ; 6: pHJ7/NdeⅠ&HindⅢ; 7: pHJ8/NdeⅠ&HindⅢ; 8: pHJ9/NdeⅠ&HindⅢ; M₂:蛋白marker; 9: XcFabF1; 10: XcFabF2; 11: XcFabB.
a:构建pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2)和pHJ6(fabB)质粒载体; b:构建pHJ7(fabF1)、pHJ8(fabF2)和pHJ9(fabB)质粒载体; c:纯化Xanthomonas campestris 8004 FabF1、FabF2和FabB蛋白.

Figure  1.  Construction of expression vector and purification of Xanthomonas campestris 8004 FabF1, FabF2 and FabB

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   野油菜黄单胞菌XcfabF1、XcfabF2和XcfabB基因互补大肠埃希菌突变株

为了检测野油菜黄单胞菌fabF1、fabF2和fabB基因的功能，首先用质粒pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2)和pHJ6(fabB)分别转化大肠埃希菌fabB温度敏感突变株CY242(fabB(ts)).该菌株在30 ℃时，能够正常生长(图 2a)，42 ℃时由于FabB蛋白失活, 成为fabB的营养缺陷型菌株, 因此如果外源基因能够在不添加油酸的条件下恢复CY242菌株42 ℃的生长表型，表明该基因编码的蛋白具有大肠埃希菌FabB活性，即3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ的活性.遗传互补检测结果(图 2b、2c)表明，质粒pHJ6(fabB)能够互补CY242，说明黄单胞菌XcfabB编码的蛋白具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ的活性，而pHJ4(fabF1)和pHJ5(fabF2)不能恢复CY242的生长性状，则表明XcfabF1和XcfabF2编码的蛋白不具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ的活性.接着用质粒pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2)和pHJ6(fabB)分别转化大肠埃希菌fabBfabF双突变菌株CY244(fabF fabB(ts)).在30 ℃时，虽然该菌株的fabF发生突变，但是fabB基因编码的蛋白仍具有长链3-酮脂酰ACP聚合酶活性，故能正常生长(图 2d).在42 ℃条件下，fabB基因编码的蛋白也失去活性，此时即使培养基中添加油酸, 菌株也无法生长(图 2e).因此，在42 ℃条件下，如果外源基因在添加油酸平板上，能够恢复CY244的生长，表明该基因编码的蛋白具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ(FabF)的活性；如果外源基因在不添加油酸平板上，能够恢复CY244的生长，表明该基因具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)的活性.结果如图 2所示，42 ℃条件下，在只添加有阿拉伯糖的RB平板上，pHJ6(fabB)能使大肠埃希菌CY242和CY244恢复生长(图 2c、2f)；而在添加有阿拉伯糖和体积分数为0.1%油酸的RB平板上，pHJ4(fabF1)能使大肠埃希菌CY244恢复生长(图 2e).这再次表明野油菜黄单胞菌的FabB具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ的活性，同时表明FabF1具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ的活性，而FabF2则不具有以上活性.

图  2  野油菜黄单胞菌XcfabF1、XcfabF2和XcfabB基因互补大肠埃希菌转化子生长表型分析

Figure  2.  Growth of transformants of Escherichia coli mutants with plasmids carrying XcfabF1 , XcfabF2 and XcfabB genes

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   野油菜黄单胞菌FabF1、FabF2和FabB蛋白体外活性检测

体内互补试验表明野油菜黄单胞菌XcfabF1具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ的活性，fabB具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ的活性，即两者均具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性.为了确定上述结论，对XcfabB、XcfabF1和XcfabF2基因编码的蛋白进行了体外酶活性检测.首先制备大肠埃希菌CY244菌株携带不同质粒[pBAD24M、pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2]和pHJ6(fabB)]和野生型MG1655的无细胞抽提物，并在体外进行脂肪酸合成反应.结果如图 3所示，含有pHJ4(fabF1)和pHJ6(fabB)的CY244无细胞抽提物与阳性对照MG1655类似，能以辛脂酰-ACP(C8-ACP)为底物延伸，产生长链脂酰-ACP(LC-ACP)，说明FabF1和FabB具有3-酮脂酰-ACP合成酶活性，而含有pHJ5(fabF2)的CY244无细胞抽提物与阴性对照类似，不能催化辛脂酰-ACP的延伸，这表明FabF2不具有酮脂酰-ACP合成酶活性，与体内遗传互补的试验结果相印证.

图  3  表达XcfabF1、XcfabF2和XcfabB的CY244菌株无细胞抽提物的KAS酶活性检测

M₁:C8-ACP; M₂:C10-ACP; 1:添加野生型MG1655无细胞抽提物；2~5:分别为添加携带有pHJ4、pHJ5、pHJ6和pBAD24M载体的CY244无细胞抽提物；M₃:Holo-ACP.

Figure  3.  Analyses of long-chain KAS activities of cell-free extracts from strain CY244 carrying plasmids harboring XcfabF1, XcfabF2 or XcfabB

下载: 全尺寸图片 幻灯片

为进一步体外验证活性，将“2.1”纯化获得的野油菜黄单胞菌FabF1、FabF2和FabB蛋白分别加入CY244无细胞抽提物中，体外进行脂肪酸合成反应.非变性凝胶电泳(图 4)显示，添加了FabF1和FabB的无细胞抽提物能将辛脂酰-ACP(C8-ACP)延伸为癸脂酰-ACP(C10-ACP)(图 4泳道2和4)，而添加FabF2则不能完成延伸反应(图 4泳道3).这一结果同样表明FabF1和FabB具有3-酮脂酰-ACP合成酶活性，而FabF2不具有3-酮脂酰-ACP合成酶活性，与体内互补试验结果一致。

图  4  野油菜黄单胞菌FabF1、FabF2和FabB蛋白的KAS酶活性检测

M₁:C8-ACP; M₂:C10-ACP; 1:只添加CY244无细胞抽提物; 2~4:在CY244无细胞抽提物中分别再添加纯化的XcFabF1、XcFabF2或XcFabB蛋白；M₃:Holo-ACP.

Figure  4.  Analyses of the enzymatic activities of XcFabF1, XcFabF2 or XcFabB within cell-free extracts from strain CY244

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   脂肪酸组成分析

3-酮基脂酰ACP聚合酶Ⅱ的显著特点是能够延伸棕榈油酸为顺-11-十八烯酸.为了进一步确定野油菜黄单胞菌FabF1的活性，将pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2)和pHJ6(fabB)分别转化大肠埃希菌fabF突变菌株CL28(fabF: :kan)，并提取了大肠埃希菌CL28携带不同质粒[pBAD24M、pHJ4(fabF1)、pHJ5(fabF2)和pHJ6(fabB)]的细菌脂肪酸，利用GC-MS测定各菌株脂肪酸的组成, 结果如图 5所示.

图  5  携带不同质粒的大肠埃希菌CL28脂肪酸组成

C14: 0为十四碳正酸; C16: 0为十六碳正酸; C16: 1为十六碳烯酸; C18: 0为十八碳正酸; C18: 1为十八碳烯酸.

Figure  5.  Fatty acid composition of Escherichia coli CL28 carrying pHJ4(fabF1), pHJ5(fabF2) or pHJ6(fabB)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

与CL28(pBAD24M)相比，CL28[pHJ4(fabF1)]的脂肪酸中棕榈油酸(C16: 1)含量明显下降，而顺-11-十八烯酸含量明显上升，说明野油菜黄单胞菌的FabF1具有将棕榈油酸延伸为顺-11-十八烯酸的活性，具有典型的3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ的功能，而CL28[pHJ5(fabF2)]和CL28[pHJ6(fabB)]的脂肪酸中棕榈油酸含量没有下降，说明野油菜黄单胞菌的FabF2和FabB都不具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ的功能.

3.   讨论与结论

生物信息学分析表明，野油菜黄单胞菌基因组中脂肪酸合成酶系基因集中在3个区域，其中fabB与fabA在同一区域，fabF1、fabG、fabD和fabH在同一区域，而fabF2单独在一区域.相似性比较发现，野油菜黄单胞菌XcFabF1与大肠埃希菌的EcFabF蛋白相似性达到60.1%，而XcFabF2只有36.3%，野油菜黄单胞菌XcFabB与EcFabB具有62.1%的相似性.此外，大肠埃希菌长链3-酮基脂酰ACP合成酶(FabF和FabB)拥有的催化活性位点Cys163/His303/His340在野油菜黄单胞菌XcFabF1、XcFabB和XcFabF2中也同样保守^[17-22].因此，推测XcfabF1、XcfabF2和XcfabB基因编码的蛋白可能具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性.然而研究结果表明在野油菜黄单胞菌中只有XcFabF1和XcFabB具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性，XcFabF2不拥有3-酮基脂酰ACP合成酶活性.进一步研究表明野油菜黄单胞菌的XcFabF1具有3-酮基脂酰ACP聚合酶Ⅱ的活性，而XcFabB具有3-酮基脂酰ACP聚合酶Ⅰ的活性.另外，野油菜黄单胞菌的XcFabF2是否具有其他方面功能，如参与次级代谢产物聚酮体合成或影响菌体生长等方面，还有待进一步研究.此研究也为深入研究黄单胞菌的致病机理，开发新的防治药物提供了一定的理论依据.