水稻、玉米和小麦是我国三大主要粮食作物，产量占我国粮食总量的90%以上^[1]。镰刀菌属Fusarium spp. 是农作物最重要的病原真菌之一，严重影响谷类作物生长及粮食产量^[2]。史晓榕等^[3]研究表明，串珠镰刀菌F. moniliforme是作物穗粒腐病的主要病原菌，占所有分离群落的50%~83%；侯恩庆等^[4]对水稻穗腐病原菌进行分离与鉴定发现，63.4%是再育镰刀菌F. proliferatum；我国小麦赤霉病病原菌中禾谷镰刀菌F. graminearum高达94. 5%^[5]。同时，上述3种病原镰刀菌可产生多种真菌毒素。串珠镰刀菌和再育镰刀菌可产生伏马菌素，伏马菌素可以引起人畜急性中毒和慢性毒性，如马脑白质软化综合征、猪肺水肿和羊肝肾病变等，也可能与人类食管癌有关^[6]。而小麦赤霉病致病菌禾谷镰刀菌可产生单端孢霉烯族毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，又称呕吐毒素)^[7]。研究表明，呕吐毒素能引起猪食欲减退或废绝、呕吐、体质量下降、流产、死胎和弱仔，抑制免疫机能和降低机体抵抗力^[8]。可见，农作物中镰刀菌病害的防治具有重要意义。

三唑类杀菌剂是目前应用范围广、防治效果好、使用量最大的一类杀菌剂，对多种作物病原菌具有良好的防治效果，可用于对担子菌、子囊菌及半知菌三大菌纲真菌引起的多种病害的防治^[9]。目前，三唑类杀菌剂也已广泛用于作物中镰刀菌病原菌的防治。同时，大多数三唑类杀菌剂是手性农药，分子中一般均有1~2个手性中心，存在2或4个对映异构体。研究表明，手性农药各对映体对靶标生物的生物活性、非靶标生物的毒性及在动植物体和环境中的降解行为都存在很大差异^[10-11]。研究发现，某些三唑类手性杀菌剂对映体对多种病原菌如立枯丝核菌Rhizoctonia solani、番茄早疫病菌Alternaria solani、番茄叶霉病菌Cladosporium fulvum、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、玉蜀黍赤霉菌Gibberella zeae等表现出明显的活性差异^[12]。三唑类手性杀菌剂对映体对串珠镰刀菌、再育镰刀菌和禾谷镰刀菌这3种产毒性病原镰刀菌的活性研究鲜见报道。本研究选取戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲环唑3种三唑类手性杀菌剂为供试药剂，测定其外消旋体和各对映体对上述3种产毒性病原镰刀菌的生物活性，以期筛选出高效的对映体，减少农药的使用量和环境污染。

1.   材料与方法

1.1   材料

供试药剂：戊唑醇外消旋体、腈菌唑外消旋体、苯醚甲环唑外消旋体和各对映体(+)–戊唑醇、(–)–戊唑醇、(+)–腈菌唑、(–)–腈菌唑、(2S,4S)–苯醚甲环唑、(2S,4R)–苯醚甲环唑、(2R,4S)–苯醚甲环唑、(2R,4R)–苯醚甲环唑，均购自于上海勤路生物技术有限公司，w为98%。所有药剂均用丙酮配制成质量浓度为5 000 μg·mL^–1的母液，4 ℃条件下保存备用，用无菌水稀释成不同质量浓度的工作液使用。

供试菌株：串珠镰刀菌菌株(KU554607.1)和再育镰刀菌菌株(AF291057.1)由华南农业大学天然农药与化学生物学实验室分离自芦笋植株上并进行病原菌分离，得到的菌株经过纯化，再进行单孢分离，最后进行分子生物学鉴定各选取1株作为本试验的供试菌株；禾谷镰刀菌菌株(KK082465.1)由南京农业大学周明国教授惠赠。

GXZ型智能光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。PDA培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、无菌水1 L)。

1.2   不同对映体对供试菌株的毒力测定

采用慕立义^[13]的菌丝生长速率法。供试三唑类杀菌剂外消旋体和各对映体用无菌水配置成7个质量浓度梯度，添加到50 ℃左右的PDA培养基中，充分震荡混匀，然后倒入90 mm培养皿中制成含药平板，各药剂的质量浓度梯度(0~500 mg·L^–1)，根据预试验结果设定预试验以加入丙酮的培养基做空白对照，试验表明丙酮对菌丝生长无影响。以加入等体积无菌水的培养基做空白对照，每个浓度3次重复。首先将供试菌株接到PDA平板上，25 ℃培养4 d，再用直径为4 mm的打孔器在菌落边缘打孔，将菌饼朝下转接到含药PDA平板中央；将接菌后的平板置于 25 ℃下倒置培养一定时间(串珠镰刀菌培养6 d，再育镰刀菌培养4 d，禾谷镰刀菌培养 3 d)后，测量菌落生长量。

采用十字交叉法测定菌落生长直径^[5]，求出平均值，计算菌丝生长抑制率：

抑制率=[(对照菌落直径−处理菌落直径)/对照菌落直径]×100%。

1.3   数据处理

采用SPSS17.0软件计算毒力回归方程、EC₅₀ 值及 95% 置信限。以药剂浓度对数为X轴，菌丝生长抑制率的概率为Y轴，得到毒力回归方程

计算出各药剂抑制菌落的EC₅₀值和相关系数(r)。

2.   结果与分析

2.1   戊唑醇对映体对镰刀菌的杀菌活性

戊唑醇对映体对3种镰刀菌菌丝生长的抑制效果存在明显差异(表1)。从表1可以看出，(–)–戊唑醇对3株镰刀菌菌株的杀菌活性最高，对串珠镰刀菌菌株(KU554607.1)、再育镰刀菌菌株(AF291057.1)和禾谷镰刀菌菌株(KK082465.1)的EC₅₀值分别为0.015、0.131和 0.311 μg·mL^–1；(+)–戊唑醇对3种供试镰刀菌菌株的EC₅₀值分别为3.147、4.223和11.128 μg·mL^–1。(–)–戊唑醇的杀菌活性明显高于(+)–戊唑醇，二者对3种镰刀菌菌株的杀菌活性相差32~208倍。戊唑醇外消体对3种镰刀菌菌株的杀菌活性介于(+)–戊唑醇和(–)–戊唑醇之间，EC₅₀值分别为0.041、0.259和0.577 μg·mL^–1。

表  1  戊唑醇对映体对 3 种供试镰刀菌的毒力测定结果

Table  1.  Toxicity of tebueonazole and its enantiomers against Fusarium spp.

供试药剂	菌株	毒力回归方程1)	EC50/(μg·mL–1)	95%置信区间/ (μg·mL–1)	相关系数 (r)
( + )–戊唑醇	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.777X − 0.387 Y=0.820X − 0.513 Y=0.928X − 0.971	3.147 4.223 11.128	2.112 ~ 4.754 3.149 ~ 5.700 8.718 ~ 14.485	0.997 0.992 0.979
(–)–戊唑醇	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=1.172X − 2.133 Y=0.839X + 0.740 Y=1.547X + 0.785	0.015 0.131 0.311	0.012 ~ 0.020 0.100 ~ 0.174 0.264 ~ 0.365	0.993 0.993 0.998
(±)–戊唑醇	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.882X + 1.218 Y=0.928X + 0.545 Y=1.367X + 0.326	0.041 0.259 0.577	0.030 ~ 0.058 0.198 ~ 0.337 0.480 ~ 0.688	0.990 0.993 0.998
1) 式中，Y 为菌丝生长抑制率的概率，X 为药剂浓度对数。

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2.2   腈菌唑对映体对镰刀菌的杀菌活性

腈菌唑外消旋体及2个对映体对3种镰刀菌的杀菌活性见表2。从表2可以看出，(+)–腈菌唑对3种镰刀菌的杀菌活性均小于(–)–腈菌唑，(–)–腈菌唑与(+)–腈菌唑之间的毒力相差1.4~6.4倍；(+)–腈菌唑对串珠镰刀菌菌株(KU554607.1)、再育镰刀菌菌株(AF291057.1)和禾谷镰刀菌菌株(KK082465.1)的EC₅₀值分别为0.425、1.703和0.560 μg·mL^–1；而(–)–腈菌唑对3种镰刀菌的EC₅₀值分别为0.578、10.902和2.204 μg·mL^–1。腈菌唑外消旋体对3种供试镰刀菌的EC₅₀值介于(–)–腈菌唑和(+)–腈菌唑之间，EC₅₀值分别为0.426、3.376和0.683 μg·mL^–1。

表  2  腈菌唑对映体对 3 种供试镰刀菌的毒力测定结果

Table  2.  Toxicity of myclobutanil and its enantiomers against Fusarium spp.

供试药剂	菌株	毒力回归方程1)	EC50/(μg·mL–1)	95%置信区间/ (μg·mL–1)	相关系数 (r)
(+)–腈菌唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.923X + 0.343 Y=0.992X − 0.229 Y=1.416X + 0.356	0.425 1.703 0.560	0.310 ~ 0.586 1.209 ~ 2.405 0.453 ~ 0.691	0.991 0.998 0.993
(–)–腈菌唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=1.094X + 0.298 Y=0.980X − 1.017 Y=1.051X − 0.361	0.578 10.902 2.204	0.402 ~ 0.708 7.688 ~ 15.679 1.672 ~ 2.934	0.994 0.995 0.992
(±)–腈菌唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.946X + 0.351 Y=0.787X − 0.394 Y=1.100X + 0.182	0.426 3.376 0.683	0.311 ~ 0.588 2.129 ~ 4.794 0.521 ~ 0.894	0.994 0.997 0.991
1) 式中，Y 为菌丝生长抑制率的概率，X 为药剂浓度对数。

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2.3   苯醚甲环唑对映体对镰刀菌的杀菌活性

苯醚甲环唑外消旋体和4个对映体对镰刀菌菌株的活性见表3。从表3可知，在4个对映体中，(2R,4R)–苯醚甲环唑对3种镰刀菌的杀菌活性最高，EC₅₀值分别为0.242、0.217和0.555 μg·mL^–1；(2S,4R)–苯醚甲环唑和(2R,4S)–苯醚甲环唑对3种镰刀菌的活性相差不大，EC₅₀值在0.355~1.535 μg·mL^–1之间；(2S,4S)–苯醚甲环唑对3种供试镰刀菌的杀菌活性最小，EC₅₀值分别为3.020、3.376和2.026 μg·mL^–1。苯醚甲环唑4个对映体对3种镰刀菌的杀菌活性相差3.7~15.5倍。

表  3  苯醚甲环唑对映体对 3 种供试镰刀菌的毒力测定结果

Table  3.  Toxicity of difenaconazole and its enantiomers against Fusarium spp.

供试药剂	菌株	毒力回归方程1)	EC50/ (μg·mL–1)	95% 置信区间/ (μg·mL–1)	相关系数 (r)
(2R,4R)–苯醚甲环唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.667X + 0.411 Y=0.799X + 0.558 Y=0.844X + 0.216	0.242 0.217 0.555	0.150 ~ 0.378 0.147 ~ 0.325 0.393 ~ 0.771	0.990 1.000 0.998
(2S,4S)–苯醚甲环唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.688X − 0.330 Y=0.654X − 0.345 Y=0.698X − 0.214	3.020 3.376 2.026	1.986 ~ 4.630 2.151 ~ 5.314 1.409 ~ 2.941	0.999 0.996 0.995
(2R,4S)–苯醚甲环唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.782X + 0.130 Y=0.659X + 0.118 Y=0.869X + 0.120	0.646 0.662 0.729	0.464 ~ 1.033 0.419 ~ 1.033 0.525 ~ 1.006	0.993 1.000 0.997
(2S,4R)–苯醚甲环唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.632X + 0.292 Y=0.746X − 0.139 Y=0.724X + 0.015	0.355 1.535 0.953	0.221 ~ 0.539 1.020 ~ 2.325 0.633 ~ 1.386	0.991 0.996 0.997
苯醚甲环唑	KU554607.1 AF291057.1 KK082465.1	Y=0.664X + 0.063 Y=0.763X + 0.118 Y=0.673X + 0.103	0.805 0.701 0.704	0.524 ~ 1.250 0.466 ~ 1.048 0.450 ~ 1.093	0.999 0.997 0.998
1) 式中，Y 为菌丝生长抑制率的概率，X 为药剂浓度对数。

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3.   讨论与结论

三唑类杀菌剂作为目前应用范围最广、使用量最大的一类杀菌剂，已用于多种作物病原菌的防治。三唑类杀菌剂对小麦的多种病害，如锈病、白粉病、纹枯病、全蚀病、根腐病以及黑穗病等均有良好的防治效果^[14]。本研究表明，三唑类杀菌剂戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲环唑对串珠镰刀菌、再育镰刀菌和禾谷镰刀菌这3种重要作物病原镰刀菌表现出较强的生物活性，戊唑醇对3种病原镰刀菌的EC₅₀值分别达0.041、0.259和 0.577 μg·mL^–1；腈菌唑对3种病原镰刀菌的EC₅₀值为0.426、3.376和 0.683 μg·mL^–1；苯醚甲环唑对3种病原镰刀菌的EC₅₀值为0.805、0.701和 0.704 μg·mL^–1。表明这3种三唑类杀菌剂具有防治镰刀菌病害的潜力，但需要做进一步的室内和田间研究。总的来说，戊唑醇对于3种病原镰刀菌的杀菌活性高于另外2种三唑类杀菌剂腈菌唑和苯醚甲环唑。这与张勇等^[15]曾报道室内离体条件下戊唑醇对小麦赤霉病菌的杀菌活性高于腈菌唑的结果一致。

大多数三唑类杀菌剂是手性农药，分子中均有1个或多个手性中心。研究表明，手性农药对映体之间对靶标生物的活性表现出立体选择性差异^[16]。本研究采用菌丝生长速率法，分别测定了戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲环唑3个手性杀菌剂对映体对3种镰刀菌的杀菌活性，结果表明，对映体间存在立体选择性差异，其差异大小与杀菌剂种类和靶标生物有关。在戊唑醇的2个对映体之间，(–)–戊唑醇的杀菌活性远高于(+)–戊唑醇，对串珠镰刀菌、再育镰刀菌和禾谷镰刀菌的杀菌活性相差分别达208、32和35倍，表现出明显的立体选择性差异，同时其差异大小与目标菌株也相关。同样，腈菌唑和苯醚甲环唑各对映体间也表现出选择性差异，对3种菌株的杀菌活性差异分别为1.4~6.4和3.7~15.5倍。有研究报道，在手性杀菌剂对映体间，往往一个对映体具有强的活性，而另一个对映体活性却很低。Dong等^[12]报道，2R,4S–苯醚甲环唑对灰葡萄孢菌的活性高于2S,4S–苯醚甲环唑，二者相差24.2倍；Han等^[17]研究发现，(–)–已唑醇对褐腐病菌、芒果炭疽病菌和链格孢菌等的活性远高于(+)–已唑醇；Stehmann等^[18]研究结果表明，(–)–戊唑醇的生物活性比(+)–戊唑醇高出100多倍；Sun等^[19]报道，(+)–腈菌唑对番茄晚疫病菌、褐斑病菌和番茄叶霉病菌的活性高于(–)–腈菌唑，二者相差1.79~1.90倍。本研究结果与前人研究结果相一致，手性农药对映体对靶标生物的活性存在立体选择性差异，其原因或许在于结合了结构敏感生物受体或有天然存在的手性生物分子。今后将进一步开展室内生物测定和田间试验，为筛选高活性杀菌剂单体，减少农药使用和保护环境提供参考。