在大多数植物如大豆Glycine max^[1]、黄瓜Cucumis sativus^[2]、水稻Oryza sativa^[3]等的生长过程中，根冠最外层细胞不断脱落，在水中以单个游离态存在，称为根尖边缘细胞(Root border cells，BCs)。而一些植物如拟南芥Arabidopsis thaliana^[4]、日冠花Heliophila coronopifolia^[5] 、马占相思Acacia mangium^[6]等的细胞从根冠脱落后相互紧密粘连，形成致密的片状甚至鞘状结构包裹根尖，称为根尖类边缘细胞(Root border-like cells，BLCs)。BCs从根冠脱离后仍具有一定的活性，且可以产生具有抗逆性的分泌物，因此，BCs形成及维持活性所需的碳源引起越来越多的关注^[7-9]。研究发现，苜蓿Medicago truncatula的根冠及BCs中含有大量的淀粉体，且其转录本中包含70%以上的蔗糖降解相关基因^[9]，这表明淀粉和蔗糖可能在BCs的形成和生长发育过程中起重要作用。淀粉经转化后生成的蔗糖是植物体内的主要碳源，其代谢为植物的生长发育提供能量^[10-12]，但蔗糖是否影响BCs的形成还有待明确。

BCs在植物抵御生物和非生物胁迫中发挥重要作用。BCs参与植物对病原菌的防御过程，如大豆BCs分泌的黏液能促使卵菌疫霉的游动孢子溶解从而阻止其进入根尖，使根尖免受疫霉病害^[1]。经镉处理后的豌豆Pisum sativum根尖可以产生更多且活性更高的BCs，因而具有更强的镉耐受能力^[13]。此外，越来越多的研究表明，BCs可以显著增强植物的铝毒耐受能力。例如，在雾培铝处理条件下，豌豆BCs细胞壁中的碱溶性果胶结合大量铝离子，降低进入根尖的铝离子含量，从而减轻铝对根尖的毒害作用^[14]；果胶含量较高的水稻BCs及其分泌的黏液可以降低铝毒引起的根尖损伤^[15]；铝对去除BCs杉木Cunninghamia lanceolata幼苗根生长的抑制作用显著增强，表明杉木BCs及其分泌的黏液能有效缓解铝毒^[16]。

柱花草Stylosanthes guianensis是一类广泛种植于热带、亚热带地区的优质豆科牧草，经过长期的自然选择和人工选育，对热带和亚热带地区酸性土壤中的诸多限制因子，如低磷、锰毒害和铝毒害等表现出良好的适应性^[17-19]。前期研究发现，柱花草种子萌发2 d后，其根尖被鞘状的BLCs包裹，且BLCs的宽度与柱花草幼苗的耐铝能力显著相关，表明BLCs的形成可能是柱花草适应酸性土壤的重要机制^[20-21]。本研究以圭亚那柱花草‘热研2号’为材料，探究蔗糖对其BLCs形成及其幼苗铝毒耐受能力的影响，为植物BCs的形成及柱花草适应铝毒胁迫的机制研究提供参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

本试验所用植物材料‘热研2号’的种子由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。

1.2   不同糖源处理试验

柱花草种子依次用75%(φ)乙醇溶液和10%(φ)次氯酸钠溶液消毒后，分别播种在不含糖、含甘露醇、含蔗糖和含葡萄糖的固体MS培养基(pH=5.6)中，含糖培养基中糖浓度均为0.087 mol/L。置于25 ℃条件下黑暗培养，种子播种当天记为第0天，记录萌发1~5 d柱花草的主根长，并在第3天时拍照观察主根BLCs的形态特征，同时测定其长度和宽度。试验结果取6株幼苗的平均值。

1.3   BLCs的长度、平均宽度测量

选取柱花草萌发第3天时拍摄的主根根尖图片，用Image J软件测量每条主根BLCs顶部到基部的距离记为其长度；测量其顶部、中部和基部的宽度并计算平均值作为每条主根BLCs的平均宽度。试验共测量5株幼苗，取其平均值即为每株柱花草幼苗BLCs的长度和平均宽度。

1.4   BLCs的鲜质量测定

选取蔗糖处理和无糖处理条件下萌发第3天的柱花草幼苗并剥取其主根BLCs，每10株幼苗的BLCs混合为1次生物学重复，称量其BLCs的鲜质量，所得数值除以10即为每株柱花草幼苗BLCs的质量，试验结果为3次生物学重复的平均值。

1.5   BLCs的层数、宽度测定和根尖直径测量

选取在蔗糖处理和无糖处理条件下萌发3 d的柱花草主根根尖约0.5 cm，用70 g/L低熔点的琼脂包埋，琼脂冷却凝固后用震动切片机(Eppendorf公司，德国)切片获得根尖横截面，切片厚度为30 µm。取距离根尖1 mm左右的切片在生物显微镜DM5000B(Leica公司，德国)下拍摄，统计其BLCs的层数。在Image J软件上分别测量根尖横截面宽度和根尖直径，测量时须经过横截面圆心。将横截面宽度减去根尖直径即为BLCs宽度。试验共测量6条主根根尖的横截面，试验结果取6次生物学重复的平均值。

1.6   柱花草幼苗铝处理试验

将柱花草种子置于含蔗糖和不含蔗糖的MS培养基上萌发3 d后，挑选长势一致的幼苗测量其根长。对2组幼苗分别设置保留BLCs和去除BLCs 处理2组，随后进行48 h铝处理，铝处理溶液为0.5 mmol/L CaCl₂和50 μmol/L AlCl₃溶液，对照组为0.5 mmol/L CaCl₂溶液，pH为4.5。测量铝处理后的根伸长量，并计算根相对生长速率(铝处理的根伸长量/对照处理的根伸长量×100%)。

1.7   苏木精染色

称取0.2 g苏木精粉末和0.02 g碘酸钾粉末，先后加入100 mL去离子水中，避光溶解2 h制成苏木精染色液。铝处理后的柱花草幼苗用0.5 mmol/L CaCl₂溶液漂洗3次，随后置于苏木精染色液中染色5 min，染色结束后用去离子水终止反应并洗去浮色，在体式镜(Leica DFC420，德国)下观察、拍照。

1.8   数据统计与分析

数据统计与分析在Microsoft Excel 2019和SPSS 26软件上进行。

2.   结果与分析

2.1   不同糖源对柱花草BLCs及其主根生长的影响

本研究首先对柱花草根尖进行蔗糖和葡萄糖添加处理，以不加糖源和添加甘露醇的处理作为对照，分析不同处理条件下主根生长以及BLCs的长度和平均宽度。结果表明，添加蔗糖和葡萄糖均明显促进柱花草根系的生长。萌发4 d以前，糖处理和对照处理的根系长度无明显差异，但萌发后第4天，2种糖处理的主根开始快速生长。萌发后第5天，蔗糖处理的主根长与无糖、甘露醇处理组相比分别增加39.8%和37.2%，葡萄糖处理的主根长分别增加38.3%和35.6% (图1)。

图  1  不同糖源处理对柱花草主根生长的影响

Figure  1.  Effects of different carbohydrate sources on the growth of Stylosanthes guianensis primary root

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与主根不同，柱花草种子萌发3 d后，主根长度在不同糖源条件下尚无明显差异时，其BLCs均已发育成熟，在形态上存在差异(图2)。外观上，无糖与甘露醇处理形成的BLCs较薄且透明、可见主根；而蔗糖和葡萄糖处理的BLCs较厚且明显褐化(图2)。此外，BLCs长度和平均宽度在无糖与甘露醇2个对照处理之间无明显差异，在蔗糖和葡萄糖2个处理之间也无明显差异；其中，蔗糖处理形成的BLCs的长度和平均宽度分别为无糖对照的1.2和1.1倍(图3)。

图  2  不同糖源处理下柱花草的BLCs形态

Figure  2.  Phenotypes of Stylosanthes guianensis BLCs treated with different carbohydrate sources

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图  3  不同糖源处理对柱花草BLCs生长的影响

各小图中柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，Duncan’s法)

Figure  3.  Effects of different carbohydrate sources on the growth of Stylosanthes guianensis BLCs

Different lowercase letters on bars in each figure indicate significant differences among different treatments (P < 0.05, Duncan’s method)

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2.2   蔗糖对柱花草BLCs形成的影响

进一步以无糖为对照，分析蔗糖处理时柱花草BLCs的形成过程。结果显示，与上述试验结果相似，添加蔗糖在柱花草种子萌发后第4天明显促进主根生长(图4)。而无论是否添加蔗糖，柱花草根尖均能在萌发后第2天形成BLCs，但添加蔗糖处理形成的BLCs的厚度明显高于无糖对照；萌发后第3天，蔗糖处理形成的BLCs趋于稳定；第4、5天，BLCs鞘状结构颜色加深，形态不再发生变化(图5)。而无糖处理第3天，BLCs仍保持透明状，此后第4、5天，虽然BLCs鞘状结构颜色加深，形态也不再发生变化，但其厚度明显小于蔗糖处理(图5)。进一步分析萌发3 d后不同处理条件下的BLCs的鲜质量和长度。结果显示，添加蔗糖形成的BLCs的鲜质量和长度与无糖对照相比分别增加50%和14% (图6)。

图  4  蔗糖对柱花草主根生长的影响

Figure  4.  Effects of sucrose on the growth of Stylosanthes guianensis primary root

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图  5  蔗糖处理下不同萌发时间柱花草BLCs的表型

Figure  5.  Phenotypes of Stylosanthes guianensis BLCs treated with sucrose at different germination time

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图  6  蔗糖处理对柱花草BLCs形成的影响

“*”和“**”分别表示蔗糖和无糖处理在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)

Figure  6.  Effect of sucrose on the formation of BLCs in Stylosanthes guianensis

“*” and “**” indicate significant differences at P < 0.05 and P < 0.01 levels respectively between sucrose and sugar-free treatments (t test)

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2.3   蔗糖对柱花草BLCs形态特征的影响

对萌发3 d的柱花草根尖进行横切，利用切片分析BLCs的形态特征。柱花草根尖横切面能较精准地测量BLCs的宽度，并清晰观察BLCs细胞及细胞层数。结果显示，蔗糖处理的柱花草根尖BLCs的横截面明显宽于无糖对照(图7)。与无糖对照相比，蔗糖处理形成的BLCs宽度增加62%，层数增加3~4层(图8A、8B)。与BLCs不同的是，无糖处理和蔗糖处理在根尖直径上没有显著差异(图8C)。

图  7  蔗糖处理的柱花草根尖1 mm处BLCs横切图

Figure  7.  BLCs cross section at 1 mm of root tip of Stylosanthes guianensis in sucrose treatment

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2.4   蔗糖对柱花草BLCs铝毒耐受性的影响

本研究对柱花草进行蔗糖处理后，将根系分为两组，其中一组剥掉根尖的BLCs，另一组保留BLCs，对这两组植株的根尖进行铝处理，测定不同处理条件下柱花草根尖和BLCs的铝累积以及根系的相对生长速率，探究蔗糖介导的柱花草根尖BLCs的形成对其耐铝能力的影响。结果显示，无铝条件下，柱花草根尖和BLCs均无苏木精染色。铝处理条件下，只要剥掉BLCs，无论是蔗糖处理或无糖处理根尖的苏木精染色均明显较深，且两者无明显区别；而保留BLCs的柱花草根尖苏木精染色明显变浅，且蔗糖处理后的根尖苏木精染色明显浅于无糖处理的根尖苏木精染色。铝处理条件下，无论是蔗糖诱导形成的BLCs还是无糖条件下形成的BLCs的苏木精染色均呈深紫色，且两者无明显区别(图9)。

图  8  蔗糖处理对柱花草BLCs形态特征的影响

各小图中，“*”和“**”分别表示蔗糖和无糖处理在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)

Figure  8.  Effect of sucrose on the morphological characteristics of Stylosanthes guianensis BLCs

“*” and “**” in each figure indicate significant differences at P < 0.05 and P < 0.01 levels respectively between sucrose and sugar-free treatments (t test)

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图  9  BLCs对柱花草根尖铝积累的影响

Figure  9.  Effect of BLCs on aluminum accumulation of Stylosanthes guianensis root tip

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根相对生长速率分析结果显示，剥掉BLCs对柱花草的耐铝能力影响较大。无BLCs的条件下，无论根尖是否进行前期的蔗糖处理，根系的相对生长率低于24%。而保留BLCs的柱花草根系的相对生长速率在无糖处理条件下为33.4%，蔗糖处理条件下为48.5%，是无糖处理条件下的1.45倍(图10)。

图  10  铝处理对柱花草根相对生长速率的影响

“***”表示蔗糖和无糖处理在P < 0.001水平差异显著(t检验)

Figure  10.  Effect of aluminum treatment on the relative growth rate of Stylosanthes guianensis root

“***” indicates significant difference at P < 0.001 level between sucrose and sugar-free treatments (t test)

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3.   讨论与结论

BCs是一类特殊的根细胞，参与植物根际生物与非生物胁迫的适应过程^[22-23]。目前已在多种植物中观察到BCs或者BLCs，包括产生BCs的豆科作物如大豆、苜蓿、豌豆，锦葵科作物棉花Anemone vitifolia Buch以及产生BLCs的十字花科植物拟南芥等^{[1, 9, 13, 24-25]}。本研究发现，豆科作物柱花草根尖也能产生BLCs。柱花草根尖在萌发后的第3天形成黄褐色的鞘状BLCs包裹根冠，随后BLCs形态逐渐稳定，其BLCs的形态结构与豆科作物马占相思^[6]的BLCs十分相似。

植物的生长发育需要碳源提供能量。已有研究表明，不添加外源蔗糖的玉米Zea mays胚轴在处理7 d后停止生长，而在添加蔗糖的处理中，玉米胚轴则正常发育且产生大量根毛^[26]。在培养基中添加蔗糖显著促进野生稻基部叶芽的发生和根状茎的发育^[27]。添加50 g/L蔗糖时，桃Prunus persica幼苗植株生物量、总根表面积、总根长以及侧根数量均显著增加^[28]，说明蔗糖对植物的生长发育具有促进作用。在本研究中，添加蔗糖处理的柱花草根尖比无糖处理产生更多的BLCs，并且BLCs的鲜质量、长度、宽度和细胞层数均显著高于无糖处理，同时柱花草主根长在第4天后明显增加，说明蔗糖能促进柱花草主根的生长及其BLCs的发育。此外，添加葡萄糖与蔗糖类似，明显促进柱花草幼苗主根的生长和BLCs的形成。早期研究发现，外源添加10 g/L葡萄糖显著促进拟南芥根系的生长，与0.3 µmol/L生长素共同添加则显著促进拟南芥侧根的形成^[29-30]。添加10~30 g/L葡萄糖和10⁻⁴ µmol/L苄氨基嘌呤(人工合成细胞分裂素)显著增加拟南芥幼苗的下胚轴长度^[31]。以上结果说明葡萄糖与生长素和细胞分裂素等相互作用是其促进植物生长发育的可能机制。而蔗糖在植物体内可转化为葡萄糖^[32]，这也可能是二者促进柱花草BLCs形成和主根生长效果类似的原因。

植物BCs在缓解植物铝毒胁迫中发挥重要作用^{[3, 14, 33]}。本研究中，铝处理条件下，处理前有BLCs包裹的柱花草根尖，其苏木精着色程度浅于处理前去除BLCs组，同时柱花草根相对生长速率更高，说明柱花草BLCs能提高柱花草的铝毒耐受能力。研究表明，在铝胁迫条件下，植物BCs的细胞壁果胶及BCs分泌的黏液能吸附大部分铝离子，从而减少进入根系的铝离子，起到保护植物根尖的作用^{[14-15, 34]}。除此之外，作为包裹根冠的最外层细胞，柱花草致密的BLCs鞘也可能起到一定的物理屏蔽作用，直接阻挡铝离子进入根尖。此外，张思琪^[35]在蚕豆Vicia faba上研究发现外源添加蔗糖通过促进有机酸蛋白相关基因表达和有机酸的合成与分泌，从而有效缓解铝毒胁迫对蚕豆主根生长的抑制。在本研究中，经蔗糖处理的柱花草BLCs比缺糖处理组具有更强的铝毒耐受能力，但在去除BLCs的处理组中，添加蔗糖对柱花草的铝毒耐受能力没有明显影响，说明蔗糖增强柱花草铝毒耐受能力依赖于BLCs的形成，其具体机制可能与蚕豆存在差异，需要进一步探究。

综上所述，蔗糖处理促进柱花草BLCs的形成并增强其对铝毒的耐受能力，葡萄糖可以代替蔗糖促进柱花草BLCs的形成。本研究结果为进一步探究柱花草BLCs发育及其适应铝毒胁迫的机制提供了理论依据。