Construction and immunological evaluation of recombinant Salmonella choleraesuis expressing GAPDH and OmP26 of Glaesserella parasuis
-
摘要:目的
构建能同时表达副猪格拉瑟菌Glaesserella parasuis关键抗原GAPDH和OmP26的重组猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis，并评估其作为二联疫苗候选株的潜力，以期为预防G. parasuis和S. choleraesuis感染提供一种新型高效的解决方法。
方法选取多种血清型的G. parasuis中广泛存在的抗原GAPDH和OmP26作为外源抗原，以S. choleraesuis C500Δasd缺失株为载体，构建同时表达GAPDH和OmP26的G. parasuis-S. choleraesuis重组菌株，并对其生物学特性和免疫效果展开研究。
结果PCR与测序结果共同表明，本研究成功构建重组菌株C501(pYA-GAPDH-OmP26)，该菌株能稳定携带GAPDH和OmP26基因片段(大小分别为1 020和798 bp)，在连续传代100次中均能稳定扩增目标片段；且生长曲线、生化特性与对照菌C501(pYA3493)一致。重组菌株C501(pYA-GAPDH-OmP26)对S. choleraesuis C78-1和G. parasuis 5型强毒株SH0165的保护率分别为62.5%和50.0%，而C501(pYA3493)对S. choleraesuis C78-1的保护率为50.0%，对G. parasuis 5型强毒株SH0165则无保护作用。
结论重组沙门氏菌C501(pYA-GAPDH-OmP26)能稳定携带异源基因，具有与亲本菌株相近的生物学特性及良好的表达特性，能够诱导机体对G. parasuis和S. choleraesuis产生联合免疫反应，为G. parasuis-S. choleraesuis二联基因工程疫苗的研发奠定了基础。
Abstract:ObjectiveThe objective of this study was to construct a recombinant Salmonella choleraesuis strain co-expressing GAPDH and OmP26, two immunogenic antigens derived from Glaesserella parasuis, evaluate its potential as a bivalent vaccine candidate, and provide a novel and efficacious solution for the prevention of both G. parasuis and S. choleraesuis infections in swine populations.
MethodGAPDH and OmP26, which are widely present in various serotypes of G. parasuis, were selected as exogenous antigens. A recombinant strain of G. parasuis-S. choleraesuis, which was capable of expressing both the GAPDH and OmP26, was constructed by using S. choleraesuis C500Δasd deletion strain as vector. The biological characteristic and immune effect of the recombinant strain were then investigated.
ResultResults of PCR and Sanger-sequencing showed that we successfully constructed the recombinant strain C501 (pYA-GAPDH-OmP26), which was able to stably harbor GAPDH and OmP26 (sizes of 1 020 and 798 bp, respectively) . The target fragments were stably amplified from the strain in 100 consecutive passages, and the recombinant strain was consistent with the parent strain C501(pYA3493) in terms of growth curves and biochemical characteristics. The recombinant strain C501 (pYA-GAPDH-OmP26) showed 62.5% and 50.0% protection rates against S. choleraesuis C78-1 and G. parasuis type 5 strong strain SH0165, respectively, while C501 (pYA3493) showed 50.0% protection rate against S. choleraesuis C78-1 and no protection effect against G. parasuis type 5 strong strain SH0165.
ConclusionThe recombinant S. choleraesuis C501 (pYA-GAPDH-OmP26) can stably carry heterologous genes. Compared with the parent strain, the recombinant strain has similar biological and good expression characteristics, can induce the organism’s combined immune response against G. parasuis and S. choleraesuis. The study lays the foundation for the development of the bivalent genetically engineered vaccine for G. parasuis and S. choleraesuis.
-
Keywords:
- Pig /
- Glaesserella parasuis /
- Salmonella choleraesuis /
- C500Δasd deletion strain /
- GAPDH /
- OmP26
-
普通大蓟马Megalurothrips usitatus又名豆大蓟马、豆花蓟马，隶属于缨翅目蓟马科大蓟马属，主要分布于澳大利亚、马来西亚、斯里兰卡、菲律宾、斐济、印度、日本等[1-3]，在我国海南、台湾、广东、广西、湖北、贵州、陕西等地也均有发生为害[4-5]。据报道，该虫有28种寄主，其中16种为豆科植物，目前它已成为危害华南地区豆科作物的主要害虫[6-9]，田间调查和室内试验均表明豇豆为其嗜好寄主[10-11]。普通大蓟马主要以锉吸式口器取食豇豆幼嫩组织的汁液，可造成叶片皱缩、生长点萎缩、豆荚痂疤等，严重影响豇豆品质[12-13]。此外，该虫体积小、发生量大、隐秘性强，大部分时间都躲在花中取食，从豇豆苗期至采收期均可为害[14-15]，以上特点均增加了农户的防治难度。当其为害严重时，农户只能增加施药频率和施药量，这也导致该虫对多种常用化学农药产生了严重的抗药性[16-17]。
目前关于普通大蓟马的研究主要集中在生物学特性[18]及综合防治技术[19-20]等层面，随着抗药性的不断发展与研究的不断深入，从分子层面解析普通大蓟马的抗药性机制和寄主选择机制等以寻求新型绿色防控方法势在必行，室内种群的大规模饲养是展开这些研究的基础。化蛹基质作为影响昆虫种群规模的关键因子，韩云等[21]曾指出普通大蓟马在含水量(w)为15%的砂壤土中羽化率显著高于砂土、壤土和黏土，但不适用于室内大规模饲养，因为实际应用中，存在土壤类型无法明确区分、配制砂壤土会增加人工饲养的工作量等问题。土壤以外的其他基质对普通大蓟马化蛹的适合度鲜见研究报道。
本研究以普通大蓟马为试验对象，室内观测其在沙子、蛭石和厨房用纸3种基质及无基质条件下的羽化规律，分析该虫对不同化蛹基质的适合度，以期为普通大蓟马的室内大规模饲养提供基础资料，为该虫的综合治理提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
普通大蓟马于2017年采自广东省广州市增城区朱村豇豆田，采回后在RXZ-500C型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂)内用豇豆豆荚饲养，饲养条件为温度(26±6) ℃，光照周期12 h光∶12 h暗，相对湿度(70±5)%。室内饲养多代后，选取发育一致的老熟2龄若虫(以体色变为橙红色为标准)进行室内试验。
供试基质包括沙子、蛭石、锯末和厨房用纸，并以无基质作为空白对照。试验前将沙子、蛭石和锯末置于DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)中105 ℃恒温烘烤6 h备用。
1.2 试验方法
首先称取过筛烘干后的沙子50 g 3组，分别加入2.5、3.5和4.5 mL蒸馏水，充分混匀，配制成含水量(w)分别为5%、7%和9%的沙子化蛹基质；称取过筛烘干后的蛭石10 g 3组，分别加入10.0、12.5和15.0 mL蒸馏水，充分混匀，配制成含水量(w)分别为20%、25%和30%的蛭石化蛹基质；称取过筛烘干后的蛭石10 g 3组，分别加入12.5、15.0和17.5 mL蒸馏水，充分混匀，配制成含水量(w)分别为25%、30%和35%的锯末化蛹基质。将以上基质分别转移至350 mL玻璃组培瓶内，基质深度均为5 cm，将厨房用纸对折成合适大小后平铺在组培瓶底部作为基质。在所有基质上放置纱网，再加入1根新鲜的豇豆豆荚(长度约4~5 cm)，分别接入50头普通大蓟马老熟2龄若虫，用250目纱布封口后置于人工气候箱中饲养，每日观察并记录成虫羽化数量。每个处理设6次重复。设置不加入任何化蛹基质的空白对照。
含水量的测定方法按以下公式[22]进行：
含水量=实际含水质量/烘干后基质质量×100%。
1.3 数据分析
运用SPSS 24.0软件进行试验数据处理分析，不同基质及含水量对普通大蓟马羽化率、蛹历期和性比(雄性∶雌性)的影响采用单因素方差分析，并运用Duncan’s法检验差异显著性。
2. 结果与分析
2.1 不同基质对普通大蓟马羽化率、蛹历期和性比的影响
普通大蓟马在不同基质中的羽化率、蛹历期和性比具有显著差异(图1)。由图1A可知，普通大蓟马在厨房用纸中的羽化率显著高于其他基质，为54.33%，其次为含水量5%(w)的沙子，羽化率为44.67%；锯末最不适宜于普通大蓟马羽化，在含水量(w)为25%、30%、35%的锯末中普通大蓟马的羽化率分别为10.33%、5.33%、16.67%，显著低于空白对照与其他基质。
![]()
图 1 不同基质对普通大蓟马羽化率、发育历期和性比(雄性∶雌性)的影响1~3分别为含水量(w)为5%、7%和1%的沙子，4~6分别为含水量(w)为20%、25%和30%的蛭石，7~9分别为含水量(w)为25%、30%和35%锯末，10：厨房用纸，11：无基质；各图中的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 1. Effects of different substrates on eclosion rate, pupa developmental period and male-female ratio of Megalurothrips usitatus1: Sand with 5% moisture, 2: Sand with 7% moisture, 3: Sand with 10% moisture, 4: Vermiculite with 20% moisture, 5: Vermiculite with 25% moisture, 6: Vermiculite with 30% moisture, 7: Sawdust with 25% moisture, 8: Sawdust with 30% moisture, 9: Sawdust with 35% moisture, 10: Kitchen paper, 11: No substrate; Different lowercase leters in the same figure indicated significant difference among different substrate (P<0.05, Duncan’s method)由图1B可知，普通大蓟马在含水量5%(w)的沙子中蛹的发育历期最短，为5.29 d，其次为含水量7%(w)的沙子，为6.01 d，在其他基质中的蛹期则无显著差异，在6.14~7.16 d。
由图1C可知，普通大蓟马在含水量30%(w)的蛭石中性比最高，为0.60，含水量10%(w)的沙子和30%(w)的蛭石性比相对较低，分别为0.12和0.06，在其他基质中性比无显著差异。
2.2 不同基质条件下普通大蓟马的羽化情况
由表1数据可知，沙子含水量(w)为5%时普通大蓟马羽化最早，始于第2天；其次为蛭石，羽化始于第4天，其他条件下羽化均始于第3天；以锯末为基质时羽化最晚，始于第5天。沙子含水量(w)为5%和厨房用纸条件下，羽化高峰出现在第5天，羽化率分别为21%和22.67%；次高峰在第6天，羽化率分别为14.33%和21%。沙子含水量(w)为9%、锯末以及空白对照下羽化高峰出现在第7天，其他条件下羽化高峰均出现在第6天。不同基质类型及含水量条件下，普通大蓟马的羽化均结束于第8天或第9天，与不同基质培养条件下普通大蓟马蛹期之间的差异相对应。
表 1 不同基质对普通大蓟马逐日羽化率的影响1)Table 1. Effects of differents substrates on daily eclosion rate of Megalurothrips usitatus% t/d 沙子含水量(w) Water content in sand 蛭石含水量(w) Water content in vermiculite 5% 7% 9% 20% 25% 30% 1 0 0 0 0 0 0 2 1.67±0.42c 0 0 0 0 0 3 1.00±1.68c 0 0 0 0 0 4 1.33±0.67c 5.33±0.33c 0.33±0.33b 0 0 0 5 21.00±3.82a 5.33±2.17b 2.67±1.91b 3.00±2.30bc 10.33±3.48ab 0.33±0.33b 6 14.33±4.66b 17.33±1.76a 2.67±1.91b 11.67±2.09a 14.67±3.33a 7.67±2.22a 7 2.33±0.80c 5.00±0.85b 8.67±1.84a 6.33±2.28b 7.67±1.74bc 6.67±1.52a 8 0.67±0.42c 0.67±0.67c 0.67±0.42b 4.00±1.35bc 4.00±1.37cd 1.67±0.94b 9 0 0 0.33±0.33b 0.67±0.42b 0 0.67±0.42b 10 0 0 0 0 0 0 3. 讨论与结论
化蛹基质的类型对普通大蓟马化蛹具有一定影响，本研究发现锯末和蛭石不适宜于普通大蓟马化蛹，锯末和蛭石不同含水量条件下大蓟马的羽化率都显著低于空白对照。有研究指出土壤中砂土含量低于30%时，蓟马若虫不能化蛹[23]，蓟马在砂壤土中的羽化率也显著高于砂土、黏土、壤土等单一土壤[21]。
化蛹基质的含水量对普通大蓟马化蛹具有显著影响，本研究发现当沙子含水量(w)为5%时，羽化率仅次于厨房用纸，高达44.67%，与孟国玲等[23]关于豆带蓟马Taenithripsglycines在含水量(w)为5.7%时羽化率最高(43.63%)的报道相对一致。韩云等[21]研究发现普通大蓟马在含水量(w)为15%的砂壤土中羽化率最高，为52.08%，而土壤含水量(w)5%时羽化率仅为6.67%。这与本研究结果不符，究其原因可能是不同类型的基质吸水力与保水力不同，导致在相同的绝对含水量下湿度有差异。此外，有研究曾指出高含水量不利于蓟马化蛹[24]，这与本研究结果相一致，沙子含水量(w)5%时的羽化率显著高于含水量(w)7%和10%。
在本研究中，成虫性比普遍低于1∶1，含水量(w)30%的蛭石羽化性比最高，为0.6，含水量(w)30%锯末最低，为0.06，其他处理的性比无显著差异，为0.12~0.48。张念台[8]和谭柯[24]在田间调查的结果也显示其成虫性比低于1∶1，后代总是偏于雌性，谭柯[24]则表示后代偏雌性可能是蓟马暴发的原因之一。这与本研究结果相一致，后代偏于雌性。
本研究发现普通大蓟马在厨房用纸中的羽化率最高，蛹发育历期与其他基质相比无明显差异，且以厨房用纸为化蛹基质时，可以清楚地观察到普通大蓟马蛹期的形态特征变化，可以随时根据试验需求收集不同时期的若虫或成虫。虽然沙子含水量(w)5%时蛹发育历期最短且羽化率也较高，但蓟马一旦入土化蛹便无法继续观察形态或收集虫体。因此，本试验条件下，厨房用纸是最适合室内普通大蓟马大量饲养的化蛹基质。
-
![]()
图 1 目的基因PCR扩增片段
Figure 1. PCR amplified fragments of target genes
M: DNA Marker, 1: GAPDH, 2: OmP26.
![]()
图 2 重组质粒pYA-GAPDH和pYA-OmP26的酶切鉴定
Figure 2. Enzymatic identification of recombinant plasmids pYA-GAPDH and pYA-OmP26
M: DNA Marker, 1: pYA-GAPDH, 2: pYA-OmP26.
![]()
图 3 重组菌株遗传稳定性
M：DNA Marker；1~4：C501(pYA-GAPDH) 25、50、75、100代；6~9：C501(pYA-OmP26) 25、50、75、100代；11~14：C501(pYA-GAPDH-OmP26) 25、50、75、100代；5、10：pYA3493。
Figure 3. Genetic stability of recombinant strains
M: DNA Marker; 1−4: C501(pYA-GAPDH) 25, 50, 75, 100 generations; 6−9: C501(pYA-OmP26) 25, 50, 75, 100 generations; 11−14: C501(pYA-GAPDH-OmP26) 25, 50, 75, 100 generations; 5, 10: pYA3493.
![]()
图 4 重组菌株C501(pYA-GAPDH-OmP26)与对照菌株C501(pYA3493)的生长曲线
Figure 4. Growth curves of recombinant strain C501 (pYA-GAPDH-OmP26) and control strain C501 (pYA3493)
![]()
图 5 重组菌株Western-Blot分析
Mr：相对分子质量，M：Marker，1：C501(pYA3493)，2：C501(pYA-GAPDH)，3：C501(pYA-OmP26)。
Figure 5. Western-Blot analysis of recombinant strains
Mr: Relative molecular mass, M: Marker, 1: C501(pYA3493), 2: C501(pYA-GAPDH), 3: C501(pYA-OmP26).
表 1 重组沙门氏菌对不同碳源的利用情况1)
Table 1 Utilization of different carbon sources by recombinant Salmonella spp.
菌株
Strain阿拉伯糖Arabinose 乳糖Lactose 棉子糖Raffinose 山梨醇Sorbitol 淀粉Starch 半乳糖Galactose 葡萄糖Glucose 甘露醇Mannitol 果糖Fructose 鼠李糖Rhamnose 麦芽糖Maltose C501(pYA3493) − − − − − − + + + + + C501(pYA-GAPDH) − − − − − − + + + + + C501(pYA-OmP26) − − − − − − + + + + + C501(pYA-GAPDH-OmP26) − − − − − − + + + + + 1) −：阴性；+：阳性。
1) −: Negative; +: Positive.
下载: 导出CSV
-
[1] 赵谦. 猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗的研制[D]. 北京: 中国农业科学院, 2019. [2] OLVERA À, CALSAMIGLIA M, ARAGON V. Genotypic diversity of Haemophilus parasuis field strains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(6): 3984-3992. doi: 10.1128/AEM.02834-05
[3] 薛国聪, 任涛. 副猪嗜血杆菌病流行病学及致病因子的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(5): 168-171. [4] 蒋征, 李军星, 姜平, 等. 副猪嗜血杆菌病分离与基因分型鉴定[J]. 畜牧与兽医, 2008, 40(6): 47-49. [5] ZHANG P, ZHANG C Y, ARAGON V, et al. Investigation of Haemophilus parasuis from healthy pigs in China[J]. Veterinary Microbiology, 2019, 231: 40-44. doi: 10.1016/j.vetmic.2019.02.034
[6] ZHAO Y D, GUO L L, LI J, et al. Characterization of antimicrobial resistance genes in Haemophilus parasuis isolated from pigs in China[J]. PeerJ, 2018, 6: e4613. doi: 10.7717/peerj.4613
[7] 董婉玉, 王馨雨, 张聚民, 等. 2020年~2021年我国副猪嗜血杆菌和链球菌的血清型、耐药基因型流行情况分析[J]. 中国预防兽医学报, 2022, 44(10): 1045-1051. [8] 穆永才, 罗天瑶, 徐铭. 副猪嗜血杆菌病多价油乳剂灭活疫苗的研制[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2015(6): 108-109. [9] 王金合, 石冬梅, 郭素琴, 等. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及自家灭活苗的研制[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(8): 144-147. [10] 张昆丽, 李春玲. 副猪嗜血杆菌病研究进展[J]. 广东农业科学, 2020, 47(12): 166-174. [11] 孔里程, 王兆飞, 孙建和. 猪链球菌保护性抗原表位串联亚单位疫苗设计及小鼠免疫保护效力分析[J]. 上海交通大学学报(农业科学版), 2019, 37(3): 1-8. [12] FU S L, ZHANG M M, OU J W, et al. Construction and immune effect of Haemophilus parasuis DNA vaccine encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in mice[J]. Vaccine, 2012, 30(48): 6839-6844. doi: 10.1016/j.vaccine.2012.09.014
[13] MINIATS O P, SMART N L, ROSENDAL S. Cross protection among Haemophilus parasuis strains in immunized gnotobiotic pigs[J]. Canadian Journal of Veterinary Research, 1991, 55(1): 37-41.
[14] LI M, LI C L, SONG S, et al. Development and antigenic characterization of three recombinant proteins with potential for Glässer’s disease prevention[J]. Vaccine, 2016, 34(19): 2251-2258. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.03.014
[15] ZHANG B, TANG C, YANG F L, et al. Molecular cloning, sequencing and expression of the outer membrane protein A gene from Haemophilus parasuis[J]. Veterinary Microbiology, 2009, 136(3/4): 408-410.
[16] 刘栋, 薛少华, 龙凡利, 等. 副猪嗜血杆菌OMP5抗原免疫刺激复合物的制备及其对小鼠免疫功能的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2023(9): 67-72. [17] MARTÍNEZ-MARTÍNEZ S, FRANDOLOSO R, FERRI E F R, et al. Immunoproteomic analysis of the protective response obtained with subunit and commercial vaccines against Glässer’s disease in pigs[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2013, 151(3/4): 235-247.
[18] 赵战勤, 徐引弟, 吴斌, 等. 猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用[J]. 生物工程学报, 2009, 25(1): 29-36. [19] 徐引弟, 郭爱珍, 刘维红, 等. 绿荧光蛋白基因在猪霍乱沙门氏菌C500株asd−缺失株平衡致死载体系统中的表达[J]. 中国兽医学报, 2007, 27(4): 493-496. [20] 赵战勤, 王臣, 丁轲, 等. 表达T+ Pm保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及其生物学特性[J]. 微生物学报, 2010, 50(1): 91-97. [21] TAKAHASHI K, NAGA S, YAGIHASHI T, et al. A cross-protection experiment in pigs vaccinated with Haemophilus parasuis serovars 2 and 5 bacterins, and evaluation of a bivalent vaccine under laboratory and field conditions[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2001, 63(5): 487-491. doi: 10.1292/jvms.63.487
[22] PANG M N, TU T, WANG Y, et al. Design of a multi-epitope vaccine against Haemophilus parasuis based on pan-genome and immunoinformatics approaches[J]. Frontiers in Veterinary Science, 2022, 9: 1053198. doi: 10.3389/fvets.2022.1053198.
[23] 房晓文, 李扬陇, 黄昌炳, 等. 仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究[J]. 畜牧兽医学报, 1981, 12(2): 29-34. [24] 韩国全, 郭万柱, 林华, 等. 减毒猪霍乱沙门菌C500作为基因疫苗运载体的研究现状[J]. 猪业科学, 2009, 26(6): 80-83. [25] 胡娇. 猪霍乱沙门菌C500Δasd缺失株的构建及其作为疫苗活载体的初步应用[D]. 扬州: 扬州大学, 2010. [26] XU Y D, GUO A Z, LIU W H, et al. Construction and characterization of delta crp delta asd mutant host-vector balanced lethal system of Salmonella choleraesuis C500 strain[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2006, 22(3): 366-372.
[27] FRANDOLOSO R, MARTÍNEZ-MARTÍNEZ S, RODRÍGUEZ-FERRI E F, et al. Haemophilus parasuis subunit vaccines based on native proteins with affinity to porcine transferrin prevent the expression of proinflammatory chemokines and cytokines in pigs[J]. Clinical & Developmental Immunology, 2013, 2013: 132432. doi: 10.1155/2013/132432.
-
期刊类型引用(2)
1. 胡溧，胡远生，谭征宇，王华伟，王博，王佳. 汽车冷却风扇噪声主动控制仿真及声品质评价. 噪声与振动控制. 2024(02): 202-207 . 
百度学术
2. 李瑞，窦青青，魏志明，陈刚，李青龙，孙永佳，孙宜田. 农业机械振动噪声控制技术研究现状与展望. 农业装备与车辆工程. 2024(09): 1-8+18 . 百度学术
其他类型引用(1)
计量
- 文章访问数: 0
- HTML全文浏览量: 0
- PDF下载量: 0
- 被引次数: 3
