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花生品质性状近红外光谱分析模型构建及应用

蔡海荣, 宋文静, 林建奔, 刘佳伟, 郭圆圆, 李博纹, 杨海洋, 卢家毅, 石翰峰, 王键宽, 李方铭, 郭涛

蔡海荣, 宋文静, 林建奔, 等. 花生品质性状近红外光谱分析模型构建及应用[J]. 华南农业大学学报, 2025, 46(4): 450-458. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202411011
引用本文: 蔡海荣, 宋文静, 林建奔, 等. 花生品质性状近红外光谱分析模型构建及应用[J]. 华南农业大学学报, 2025, 46(4): 450-458. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202411011
CAI Hairong, SONG Wenjing, LIN Jianben, et al. Construction and application of near-infrared spectroscopy analysis model for peanut quality traits[J]. Journal of South China Agricultural University, 2025, 46(4): 450-458. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202411011
Citation: CAI Hairong, SONG Wenjing, LIN Jianben, et al. Construction and application of near-infrared spectroscopy analysis model for peanut quality traits[J]. Journal of South China Agricultural University, 2025, 46(4): 450-458. DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202411011

花生品质性状近红外光谱分析模型构建及应用

基金项目: 

河源市科技计划重大项目(河科2021010)

详细信息
    作者简介:

    蔡海荣,E-mail: amumumu233@163.com

    通讯作者:

    郭 涛,主要从事水稻遗传育种研究,E-mail: guoguot@scau.edu.cn

  • 中图分类号: S335.21

Construction and application of near-infrared spectroscopy analysis model for peanut quality traits

  • 摘要:
    目的 

    开发集合花生主要品质性状的近红外光谱分析模型,为花生品质性状突变体的筛选提供一种高效、便捷的鉴定手段,缩短育种进程,提升育种效率。

    方法 

    在中国主要花生产区收集115份花生种质材料,100份作为定标集,15份作为验证集,使用瑞典波通DA7200近红外光谱分析仪采集光谱信息。分别采用索氏抽提法测定脂肪含量,凯氏定氮法测定蛋白质含量,酸水解−莱因−埃农氏法测定总糖与蔗糖含量以及气相色谱法测定各脂肪酸含量。选用全波长光谱范围,采用偏最小二乘回归法构建模型,对比单一和复合预处理方法,比较不同模型的决定系数(R2)和校准均方根误差(Root mean square error of calibration,RMSEC),选择最佳模型。使用验证集15份花生种质材料对每个性状的最佳模型进行外部验证。利用构建的最佳模型在航天诱变材料后代中筛选突变体,考察模型的应用价值。

    结果 

    构建了12个花生品质性状的近红外光谱分析模型,除脂肪与花生酸含量外,其余性状的R2均高于0.85;同时外部验证也显示,除脂肪与花生酸含量外,模型R2均大于0.85。利用该模型的油酸近红外分析模型,从805份航天诱变SP3材料中筛选出12份花生油酸突变体材料,油酸含量均极显著高于野生型(P<0.001)。

    结论 

    构建的模型可有效预测花生各品质性状,适用于突变体、种质资源以及杂交后代等群体花生籽仁品质的高效检测。

    Abstract:
    Objective 

    To develop a near-infrared spectroscopy analysis model integrating the main quality traits of Arachis hypogaea L. (peanut), provide an efficient and convenient identification method for screening of peanut quality trait mutants, shorten the breeding process, and improve the breeding efficiency.

    Method 

    A total of 115 peanut germplasm materials were collected from major peanut-producing areas in China, 100 of which were utilised as a calibration set and the remaining 15 as a validation set. The Swedish Broadcom DA7200 near-infrared analyzer was used to collect spectral information. The fat content was determined by using the Soxhlet extraction method, the protein content by Kjeldahl determination, the total sugar and sucrose contents by acid hydrolysis-Rein-Einon’s method, and the content of each fatty acid by gas chromatography. The full wavelength spectral range was selected, and models were constructed by using partial least squares regression. The single and composite preprocessing methods were compared to select the best model that performed optimally under this spectral preprocessing by comparing the determination coefficients (R2) and root mean square errors of calibration (RMSEC) of different models. The 15 peanut germplasm materials in validation set were used for external validation of the optimal model for each trait. The mutants in the offspring of aerospace mutagenesis materials were screened by the best model to investigate the application value of the model.

    Result 

    A near-infrared spectral analysis model for 12 peanut quality traits was constructed. The R2 of the traits was higher than 0.85, with the exception of fat and arachidic acid contents. External validation also demonstrated that the R2 of the constructed model was greater than 0.85, with the exception of fat and arachidic acid contents. Furthermore, the oleic acid near-infrared analysis model screened 12 peanut oleic acid mutants from 805 aerospace mutagenic materials, with the oleic acid contents significantly higher than that of the wild type (P<0.001).

    Conclusion 

    The constructed model is an effective predictor of quality traits in peanuts and is suitable for the efficient detection of peanut kernel quality in mutants, germplasm resources and hybrid offspring populations.

  • 中药大黄来源于蓼科植物大黄的根茎,最早记载于《神农百草经》,有药中“将军”之美称,被列为中药“四大金刚”之一,已经有2000多年的中医临床用药史[1]。中药大黄主要由大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素等游离蒽醌,番泻苷A/B等二蒽酮苷类结合型蒽醌,二苯乙烯,多糖,单宁等成分组成,具有泻下攻积、抗菌、抗感染、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、保肝利胆等多种药理作用[2]。其中,蒽醌是大黄的主要活性成分,含量(w)约占其成分的3%~5%[3]。大黄酸(Rhein,RH)是大黄蒽醌的主要成分之一,结构式如图1所示,具有抗感染[4]、抗肿瘤[5]、抗糖尿病[6]、降脂[7]、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肾毒性等[8]多种药理作用。然而,大黄酸溶解度低、脂溶性差、毒性强、生物利用度差、易引起胃肠道不适,这些特性限制了其临床应用[9]。近年来,畜禽病原菌的抗生素耐药性逐渐变得严重,导致抗生素敏感性下降,研发抗生素增效剂、复方制剂等的防控策略逐渐成为应对畜禽耐药病原菌的研究热点。大黄酸对幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌等多种厌氧菌有强大的抑菌作用。对大黄酸进行结构改造,通过羟基、羧基取代成酯或酰胺等修饰,改善大黄酸理化性质,降低毒性,提高抗感染、抗癌、抗菌等活性,具有重要意义,可为畜禽病原菌耐药防控提供新思路,也为大黄酸类衍生物的进一步研究提供参考依据。

    图  1  大黄酸的结构式
    Figure  1.  Structural formula of rhein

    目前,大黄酸衍生物双醋瑞因是大黄酸最具代表性的衍生物之一,可阻滞白细胞介素−1β(Interleukin-1β,IL-1β)的作用,减少破骨细胞的形成和抑制吸收因子的合成在临床上广泛应用于治疗骨关节炎[10]。双醋瑞因的上市为后续大黄酸衍生物的研究和开发提供了理论依据;但是,双醋瑞因存在严重的毒副作用,为了控制其重度腹泻及影响肝脏的风险,对其临床使用设置了限制性条件。双醋瑞因又名1, 8−二乙酰基−3−羧基蒽醌,用乙酰氯对大黄酸第1、8位羟基进行保护。有研究表明,第1、8位羟基对大黄酸毒性的影响较小[11],因此,双醋瑞因对大黄酸毒性的改善并不明显。研究表明,大黄酸第3位羧基是大黄酸毒性的关键影响因素[11],对第3位羧基进行修饰能提高大黄酸的跨膜能力,从而可能提高大黄酸的抗感染效果[12]。据报道,游离的脂肪酸在肠道炎症反应中具有潜在的应用价值,它可以与肠道细胞膜的特异性受体结合从而发挥免疫保护作用,降低肠道促炎因子水平,以治疗肠道炎症[13]。一方面,脂肪酸作为能量物质,提供了成年人每日所需能量的30%[14];另一方面,脂肪酸参与生物膜的构成、受体激活、信号转导、神经系统发育和各种基因的调节[15]。脂肪酸衍生化可以使大黄酸具有更好的应用价值,保护大黄酸,避免其在体内快速代谢或降解,提高大黄酸稳定性[16];还可以增强大黄酸分子的亲脂性和跨膜转运能力[17];由于肿瘤组织对脂肪酸的吸收能力较强,也可以促进大黄酸分子对癌细胞的靶向积累。总之,通过脂肪酸对大黄酸进行衍生化具有广阔的应用前景。

    本研究前期工作发现,大黄酸与脂肪酸具有协同抗感染作用,并且脂肪酸能在一定程度上降低大黄酸的毒性;但是,大黄酸和脂肪酸在体内代谢速率、生物利用度等因素影响下很难发挥协同作用。因此,本研究通过对大黄酸第3位羧基与羟基癸酸和癸醇进行酯化衍生化,制备出4种大黄酸衍生物,通过核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)和傅里叶变换红外光谱(Fourier transforme infrared spectroscopy,FTIR)表征其结构,进一步探究其毒性、抗感染和抗氧化活性变化,筛选出具有应用前景的大黄酸衍生物,以期为大黄酸衍生物的结构设计及其生物活性等研究提供参考依据。

    核磁共振波谱(德国Bruker公司);磁力搅拌器(上海龙跃仪器设备有限公司);流式细胞计数仪(美国贝克曼库尔特);傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher Nicolet公司);酶标定量测定仪(美国Beckman公司);CO2细胞培养箱(新加坡艺思高科技有限公司);RT-qPCR仪(美国Bio-Rad生命医学产品有限公司);旋转蒸发仪N-1200B(日本EYELA东京理化);小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7(武汉普诺赛生命科技有限公司);一氧化氮(NO)检测试剂盒(上海碧云天生物技术股份有限公司);DMEM、特级胎牛血清、青链霉素(赛默飞生命科学产品与服务旗舰店);总RNA极速提取试剂盒(广州晖鼎生物科技有限公司);4−(二甲氨基)吡啶(4-Dimethylaminopyridine,DMAP)、N,N′−二环己基碳二亚胺(N, N′-Dicyclohexylcarbodiimide,DCC)(上海麦克林生化科技有限公司);氘代二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(上海源叶生物科技有限公司);大黄酸(上海麦克林生化科技有限公司);1−癸醇(1-Decanol,DA)、10−羟基癸酸(10-Hydroxydecanoic acid,10-HA)、10−羟基−2−癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)、5−羟基癸酸钠(5-Hydroxydecanoate sodium,5-HD)(上海毕得医药科技股份有限公司)结构式如图2所示;双氯荧光黄乙酸乙酯(2, 7-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)(广州市齐云生物技术有限公司)。

    图  2  癸醇(A)和羟基癸酸(B、C、D)的结构式
    Figure  2.  Structural formulas of decanol (A) and hydroxydecanoic acid (B, C, D)

    精密称取0.5 g(1.70 mmol)大黄酸,置于20 mL DMSO溶液中,于50 ℃、200 r/min搅拌1 h,完全溶解后,加入DA/10-HA/10-HDA/5-HD、DCC 3.40 mmol和DMAP 0.85 mmol,反应摩尔比按照大黄酸∶DA/10-HA/10-HDA/5-HD∶DCC∶DMAP=1.0∶1.0∶2.0∶0.5。在50 ℃条件下反应,每间隔1 h,用薄层层析法监测反应情况,确认产物生成,直至产物不再增加(展开剂为乙酸乙酯和石油醚,体积比为2∶3),停止反应。大黄酸与羟基脂肪酸的反应结构式如图3所示。反应结束后待温度降至室温,将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液透析1 d (透析袋截留相对分子质量为500),去离子水透析2 d,每隔12 h更换透析液,除去未反应的物质。随后,在−75 ℃、0.001 MPa条件下冷冻干燥48 h,得到冻干粗产物。将上述得到的粗产品用38~48 μm孔径的硅胶柱层析进行干法上样,使样品层与硅胶层之间的高度比为1∶20。洗脱液乙酸乙酯∶石油醚=2∶3(V/V),直至监测到产物完全洗脱,获得最终产物。用旋转蒸发器除去溶剂,于50 ℃真空烘箱干燥24 h,得到黄色粉末固体产物。

    图  3  大黄酸与羟基脂肪酸的反应结构式
    F-A为接枝脂肪酸或癸醇,R为F-A反应掉羟基的部分结构,R-FA为接枝后的大黄酸衍生物。
    Figure  3.  Structural formula for the reaction of rhein with hydroxy fatty acids
    F-A is grafted fatty acid or decanol, R is the part of the structure where F-A reacts to drop the hydroxyl group, R-FA is the grafted rhein acid derivative.

    为验证大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率的影响,选用CCK-8试剂盒对RAW 264.7细胞存活率进行检测。分别用10~160 μmol/L的大黄酸及其衍生物处理RAW 264.7细胞24 h,10%($\varphi $) CCK-8试剂孵育0.5~4.0 h,酶标仪设定波长为450 nm,测定每孔光密度。

    为验证大黄酸衍生物的抗感染效果,构建脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW 264.7细胞模型,测定大黄酸及其衍生物处理后RAW 264.7中NO释放量以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达量变化。用20 μmol/L的大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA在37 ℃、5%($\varphi $) CO2条件下预孵育8 h,加入LPS,终质量浓度为 1 μg/mL,在37 ℃、5%($\varphi $) CO2条件下孵育16 h(另外设置LPS阳性对照组,不加药物处理)。用细胞培养液上清液[DMEM+10% (φ) FBS溶液+1% (φ) 青链霉素溶液]稀释NaNO2标准品至0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL每孔,在96孔板中加入标准品及样品(每组设置3个复孔),用酶标仪于540 nm波长处测定光密度,计算NO含量。提取RAW 264.7的RNA,反转录,利用RT-qPCR测定肿瘤坏死因子−α (Tumour necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、白细胞介素−6 (Interleukin-6,IL-6)的表达量变化,具体步骤如下。首先,投入总量为1 μg的RNA,2 μL 4× gDNA wiper Mix,用RNase-free ddH2O定容至10 μL,充分混匀,于42 ℃离心2 min后,得到去DNA的反应液。然后,在上述反应液中加入4 μL 5× Hiscript Ⅲ qRT SuperMix,用RNase-free ddH2O定容至20 μL,得到反转录体系,充分混匀,短暂离心,经37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的PCR反应后,得到cDNA。最后,按照下述反应程序进行RT-qPCR:95 ℃ 30 s,循环1次;95 ℃ 10 s,循环40次;60 ℃ 30 s,循环40次;72 ℃ 30 s,循环40次。RT-qPCR反应体系中所需的引物序列见表1

    表  1  RT-qPCR引物
    Table  1.  RT-qPCR primer
    引物名称
    Primer name
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence
    扩增序列
    Amplified sequence
    GAPDH-F ACCCAGAAGACTGTGGATGG GAPDH mRNA
    GAPDH-R CACATTGGGGGTAGGAACAC GAPDH mRNA
    TNF-ɑ-F CTCTTCAAGGGACAAGGCTG TNF-ɑ mRNA
    TNF-ɑ-R CGGACTCCGCAAAGTCTAAG TNF-ɑ mRNA
    IL-6-F CCGGAGAGGAGACTTCACAG IL-6 mRNA
    IL-6-R TCCACGATTTCCCAGAGAAC IL-6 mRNA
    IL-1β-F GACCTTCCAGGATGAGGACA IL-1β mRNA
    IL-1β-R AGGCCACAGGTATTTTGTCG IL-1β mRNA
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    为验证大黄酸及其衍生物对LPS诱导的RAW 264.7细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生的影响,用20 μmol/L的大黄酸以及大黄酸衍生物处理RAW 264.7细胞。ROS荧光探针DCFH-DA可穿透活细胞膜进入细胞内,并可被细胞内的ROS氧化,生成氧化乙啶;氧化乙啶可嵌入染色体DNA中,产生红色荧光。根据此原理可以评估细胞内ROS含量及其变化情况。用DCFH-DA染色,通过流式细胞计数仪检测大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞中ROS产生的影响,评估大黄酸及其衍生物抗氧化水平。

    采用Orgin Pro 9.0和Graph Pad 8进行统计分析,试验分组均至少有3次重复,采用t检验比较组别之间的差异性。若P>0.05,则无统计学意义;若P<0.05、P<0.01或P<0.001,则其有显著差异;若P<0.000 1,则其有极显著差异。

    为了表征大黄酸衍生物是否成功合成,用FTIR和1H NMR表征其结构。R-5HD的FTIR表征结果如图4A所示。大黄酸的羟基(—OH)峰位于3 420.40 cm−1,羰基(—C=O)峰位于1 648.98 cm−1;5-HD的羟基峰位于3 410.34 cm−1,羰基峰位于1 703.44 cm−1;R-5HD的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基(—COOH)氢对应g1(13.79×10−6);5-HD碳链上的氢对应b2(2.33×10−6)、c2(1.54×10−6)、d2(1.38×10−6)、e2(3.10×10−6)、g2(1.38×10−6)、h2/i2(1.25×10−6)、j2(1.28×10−6)、k2(0.88×10−6),羟基氢对应f2(3.41×10−6),羧基氢对应a2(11.87×10−6)。由大黄酸衍生物R-5HD的1H NMR表征(图4B)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和5-HD碳链上的羟基峰消失,与5-HD对比,R-5HD中峰h3(4.02×10−6)发生明显的偏移。以上结果均表明R-5HD成功合成。

    图  4  大黄酸衍生物结构表征
    Figure  4.  Structural characterization of rhein derivatives

    R-DA的FTIR表征结果如图4C所示,大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1,羰基峰位于1 648.98 cm−1;R-DA的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6);DA碳链上的氢对应b2/d2/e2/f2(1.26×10−6)、g2(1.30×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.50×10−6)、j2(4.35×10−6),羟基氢对应k2(3.23×10−6)。由R-DA的1H NMR表征(图4D)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和DA碳链上的羟基峰消失,与DA对比,R-DA中羟基相邻烷烃链上氢对应的h3(4.33×10−6)发生明显偏移。以上结果均表明R-DA成功合成。

    R-10HA FTIR结构表征如图4E所示。大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1,羰基峰位于1 648.98 cm−1;10−HA的羟基峰位于3 410.34 cm−1,羰基峰位于1703.44 cm−1;R-10HA的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6);10-HA碳链上的氢对应c2(1.54×10−6)、d2(1.33×10−6)、e2/f2(1.26×10−6)、g2(1.30×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.58×10−6)、j2(3.62×10−6),羟基的氢对应k2(4.7×10−6),羧基的氢对应a2(11.87×10−6)。由R-10HA的1H NMR 表征(图4F)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和10-HA碳链上的羟基峰消失,与10-HA对比,R-10HA中峰h3(4.02×10−6)发生明显的偏移。以上结果均表明R-10HA成功合成。

    R-10HDA FTIR表征结果如图4G所示,大黄酸的羟基峰位于3 420.40 cm−1,羰基峰位于1 648.98 cm−1;10-HDA的羟基峰位于3 410.34 cm−1,羰基峰位于1 703.44 cm−1;R-10HDA的羟基峰位于3 447.58 cm−1,羰基峰位于1 740.69 cm−1,新生成的酯键为1 275.67 cm−1。大黄酸蒽醌母核上的氢在1H NMR上分别对应a1(7.40×10−6)、b1/c1(7.70×10−6)、d1(7.82×10−6)、e1(8.09×10−6),酚羟基的氢对应h1/f1(11.87×10−6),第3位羧基的氢对应g1(13.79×10−6);10-HDA碳链上的氢对应b2(6.02×10−6)、c2(7.11×10−6)、d2(2.16×10−6)、e2(1.29×10−6)、f2(1.33×10−6)、g2(1.26×10−6)、h2(1.43×10−6)、i2(1.58×10−6),羟基的氢对应k2(4.70×10−6),羧基的氢对应a2(12.05×10−6)。由R-10HDA的1H NMR表征(图4H)可以看出,大黄酸第3位羧基峰和10-HDA碳链上的羟基峰消失,与10-HDA对比,R-10HDA中峰h3(4.02×10−6)发生明显偏移。以上结果均表明R-10HDA成功合成。

    结果如图5所示,大黄酸浓度高于40 μmol/L时具有明显的毒性,RAW 264.7细胞存活率降低至60%;DA浓度为160 μmol/L时,RAW 264.7细胞存活率降低至60%。而R-DA、R-10HA、R-10HDA、R-5HD浓度为160 μmol/L时,RAW 264.7细胞存活率仍接近100%。由此可见,大黄酸衍生物显著降低大黄酸的细胞毒性。

    图  5  不同浓度大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率的影响
    “*”“**”“***”分别表示相同处理浓度大黄酸衍生物组与大黄酸组在0.05、0.01和0.001水平差异显著(t检验)。
    Figure  5.  Effect of different concentrations of rhein and its derivatives on survival rates of RAW 264.7 cells
    “*” “**” “***” indicate significant differences between rhein derivative group and rhein group at 0.05, 0.01 and 0.001 levels respectively in the same treatment concentration (t test).

    大黄酸及其衍生物对NO释放量的影响如图6A所示。与空白对照组(CK)相比,阳性对照组(LPS模型组)NO释放量极显著增加(P<0.0001)。与LPS模型组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均能够极显著抑制LPS诱导的RAW 264.7中NO的释放量,说明4种大黄酸衍生物均具有较强的抗感染活性,对第3位羧基进行结构修饰不会丧失大黄酸的抗感染活性。

    图  6  大黄酸及其衍生物的抗感染作用
    “*”“**”“***”“****”分别表示与LPS组(阳性对照组)在0.05、0.01、0.001和0.000 1水平差异显著(t检验)。
    Figure  6.  Anti-inflammatory effects of rhein and its derivatives
    “*” “**” “***” “****” indicate significant differences differed from LPS group (positive control group) at 0.05, 0.01, 0.001 and 0.000 1 levels respectively (t test).

    大黄酸及其衍生物均能显著降低LPS诱导的RAW 264.7中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA相对表达量,结果如图6B~6D所示。与空白对照组(CK)相比,阳性对照组(LPS组)的TNF-α mRNA表达水平增加了47倍;与LPS组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了TNF-α mRNA表达水平(P<0.05)。LPS组的IL-1β mRNA表达水平比CK增加了8 813倍;与LPS组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了IL-1β mRNA表达水平。LPS组的IL-6表达水平比CK增加了4 885倍;与LPS组相比,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA均显著降低了IL-6 mRNA表达水平。以上结果表明,大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA和R-10HDA均能显著抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平,对大黄酸进行结构修饰使其抗感染效果更强,且R-DA的抗感染效果最强。

    图7所示,DCFH-DA探针孵育后,空白对照组(CK)的荧光强度为1 319.66;经过LPS刺激后细胞内ROS水平显著升高,荧光强度为60 968.00,比空白对照组增加了46倍(P<0.0001)。药物处理后大黄酸、R-5HD、R-DA、R-10HA以及R-10HDA组的荧光强度均显著下降,且R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA的抑制效果均优于大黄酸。以上结果表明,修饰后的R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA显著增强了大黄酸的抗氧化活性。

    图  7  大黄酸及其衍生物对LPS诱导RAW 264.7细胞释放ROS的影响
    “**”“***”“****”分别表示与LPS组(阳性对照组)在0.01、0.001和0.000 1水平差异显著(t检验)。
    Figure  7.  Effect of rhein and its derivatives on LPS-induced ROS release from RAW 264.7 cells
    “**” “***” “****” indicate significant differences differed from LPS group (positive control group) at 0.01, 0.001 and 0.000 1 levels respectively (t test).

    本研究以大黄酸为原料,以羟基癸酸和癸醇为修饰物,经一步酯化反应合成了4种大黄酸衍生物(R-5HD、R-DA、R-10HA、R-10HDA),通过FTIR以及1H NMR对合成的化合物进行结构鉴定,证实4种衍生物合成成功,经对大黄酸及其衍生物进行毒性研究以及抗感染、抗氧化活性研究,主要结论及其分析如下。

    通过大黄酸及其衍生物对RAW 264.7细胞存活率影响的分析,经过羟基癸酸和癸醇修饰之后的大黄酸衍生物对RAW 264.7细胞的毒性降低,安全性增加。羟基癸酸和癸醇与药物分子的化学偶联可能会引起它们在体内的药效学/药代动力学变化,从而降低它们的毒性。经羟基癸酸和癸醇修饰之后的大黄酸衍生物具有更强的抗感染效果,能显著降低LPS诱导的NO释放水平和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的转录水平。综合来讲,在体外炎症模型下,R-DA的抗感染效果最为突出。

    ROS作为LPS诱导炎症的重要中介,可引起DNA、蛋白质和脂质的损伤[18]。此外,过量的ROS产生和积累可诱导细胞损伤和氧化应激[19]。本研究中,LPS刺激后,ROS水平显著升高,经大黄酸以及4种衍生物孵育后,LPS诱导的RAW 264.7细胞中ROS水平显著降低,R-DA抑制ROS效果与大黄酸有显著差异,相比其他3种衍生物有更好的ROS抑制效果。有研究发现,大黄酸可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶的表达起到抗感染作用,经修饰后的大黄酸衍生物作用后,细胞NO释放水平显著降低[20],这与Ge等[21]研究结果一致。

    在大黄酸构效关系研究中,大黄酸分子上第3位碳上的取代基是羧基,增大了大黄酸的极性,是溶解性的关键基团,因此,本研究采用酯化反应的方法,将第3位碳上的羧基转化为酯键,以制备具有良好脂溶性和抗感染活性的大黄酸衍生物。据调查,对蒽醌类药物的修饰改性主要是通过在羟基和羧基引入侧链基团增加药物的吸收,引入脂肪酸可以克服母体药物的脂溶性、吸收率、生物利用度等限制。此外,多数脂肪酸具有抗菌、抗感染、抗氧化活性,例如Omega-3和Omega-6等,在人体内发挥至关重要的作用。通过引入脂肪酸可以增强大黄酸的抗感染活性,降低毒性,同时也为机体的正常运转和代谢提供必需的化学物质。前期工作中经对大黄酸衍生物的抗菌活性进行初步验证,发现其能显著增强大黄酸对金黄色葡萄球菌和肠球菌的抗菌活性,相关研究后续将继续展开,为畜禽耐药性防控提供思路,也为大黄酸进一步的研究提供基础数据。

    在体外抗感染过程中,R-DA可能通过抑制NF-κB途径减少LPS刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子的产生,也可能是由于R-DA中羟基癸醇的脂溶性作用,与细胞膜上的蛋白受体靶向结合,增加细胞膜的通透性,使药物进入细胞内发挥作用,从而起到抗感染、抗氧化的作用。

    本研究中,虽然制备的大黄酸衍生物具有更低的毒性以及更优的抗感染效果,但大黄酸衍生物的纯化方法、合成产率需要进一步优化和提高。因此,在本文的基础上,仍有许多工作值得深入探究,并且要对衍生物的抗感染机制做深入性研究,如衍生物的抗感染机制是否与大黄酸的作用机制一致,以及通过结构修饰后衍生物的生物利用度是否有所增加,以期为新药的开发利用提供参考价值。

  • 图  1   不同种皮颜色(A)和果仁大小(B)的部分花生样品

    Figure  1.   Partial peanut samples with different seed coat colors (A) and kernel sizes (B)

    图  2   花生定标集样品近红外光谱

    Figure  2.   Near-infrared spectra of peanut calibration set samples

    图  3   验证集花生品质性状近红外模型预测值的验证

    Figure  3.   Validation of near-infrared model prediction values for quality traits of peanuts in validation set

    图  4   SP3油酸含量近红外光谱模型预测值分布

    Figure  4.   Distribution of near-infrared spectral model predicted values for oleic acid content in SP3

    图  5   花生SP3突变体与野生型(WT)油酸含量的差异

    ***表示与WT在P<0.001水平差异显著(t检验)。

    Figure  5.   Difference in oleic acid content between peanut SP3 mutant and wild type (WT)

    *** indicates signicant differences compared to WT (t test).

    表  1   定标集花生籽仁营养组分含量化学测定值

    Table  1   Chemical determination values of nutrient component contents for peanut seed kernels in calibration set $\omega $/%

    特征
    Characteristic
    脂肪
    Fat
    蛋白质
    Protein
    蔗糖
    Sucrose
    总糖
    Total sugar
    油酸
    Oleic acid
    亚油酸 Linoleic acid 棕榈酸Palmitic acid 硬脂酸 Stearic acid 山嵛酸
    Behenic acid
    花生酸
    Arachidic acid
    花生一烯酸Eicosenoic acid 二十四烷酸 Tetracosanoic acid
    最大值
    Maximum value
    52.70 27.70 10.00 11.00 80.62 42.29 17.31 4.58 10.60 3.48 1.75 2.20
    最小值
    Minimum value
    40.50 18.10 2.50 3.00 34.73 2.43 6.08 1.81 1.95 1.07 0.49 0.82
    平均值
    Average value
    47.15 22.98 4.07 4.48 55.24 23.29 10.19 2.60 4.19 1.69 0.96 1.37
    标准差
    Standard deviation
    2.74 1.93 1.40 1.51 0.17 0.15 0.03 0.01 0.01 0.00 0.00 0.00
    变异系数/%
    Coefficient of variation
    5.80 8.39 34.36 33.74 30.61 62.15 27.42 18.07 26.85 17.43 34.38 19.98
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    表  2   定标集花生籽仁各品质性状最佳光谱预处理方法

    Table  2   The optimal spectral pretreatment method for each quality trait of peanut seed kernels in calibration set

    品质性状
    Quality trait
    预处理方法
    Preprocessing method
    校准均方根误差
    RMSEC
    决定系数
    R2
    脂肪含量 Fat content 去趋势+基准化 1.512 0.609
    蛋白质含量 Protein content 去趋势+基准化 0.340 0.968
    蔗糖含量 Sucrose content 基准化 0.307 0.952
    总糖含量 Total sugar content 去趋势 0.321 0.955
    油酸含量 Oleic acid content 原始光谱 0.026 0.977
    硬脂酸含量 Stearic acid content 标准正态变量(SNV) 0.001 0.895
    亚油酸含量 Linoleic acid content Savitzky-Golay 滤波拟合法+SNV+去趋势 0.033 0.950
    棕榈酸含量 Palmitic acid content SNV+去趋势+基准化 0.008 0.906
    山嵛酸含量 Behenic acid content SNV+去趋势 0.003 0.859
    花生酸含量 Arachidic acid content SNV+去趋势 0.001 0.803
    花生一烯酸含量 Eicosenoic acid content SNV+去趋势+基准化 0.001 0.923
    二十四烷酸含量 Tetracosanoic acid content SNV+去趋势 0.001 0.881
    下载: 导出CSV
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图(5)  /  表(2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-11-06
  • 网络出版日期:  2025-05-21
  • 发布日期:  2025-06-15
  • 刊出日期:  2025-07-09

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