Phenotypic variation and transcriptomic analysis of extreme plant heights in a hybrid population of Hedychium
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摘要:目的
‘白泰’姜花与金姜花杂交F1代群体内株高差异显著，本研究通过株高表型分析和转录组测序(RNA-seq)分析，深入挖掘影响姜花株高的关键基因，为姜花分子育种和株型改良提供重要的参考依据。
方法选用姜花杂交群体中最高的20株及最矮的20株进行株高、节间长度和节间细胞长度统计。建立节间分区A~D、通过相关性分析确定影响株高差异的主要因素，通过节间长度与节间细胞长度的差异比较分析确定差异生长部位。利用RNA-seq检测高、矮单株差异生长部位的mRNA表达水平。利用生物信息学方法筛选出差异表达基因(DEGs)，结合文献支撑筛选株高调控相关基因并进行RT-qPCR验证。
结果姜花杂交群体植株的节间长度与节间细胞长度之间存在显著正相关，且高矮植株在C区间的节间长度及节间细胞生长差异最为显著。通过对高、矮表型植株进行RNA-seq分析过滤到269个差异表达基因，并基于转录组数据筛选出13个显著差异表达的株高调控相关基因。其中，HcMYB136、HcNAC140、HcEXPA4、HcEXPB3、HcXTH28、HcXTH8、HcCYCB1-1和HcCYCD3-2在3株极端矮单株中表达下调，而HcMYB238、HcMYB254、HcNAC126、HcbZIP50和HcCDC27B在3株极端矮单株中表达上调。qRT-PCR结果表明，这13个基因的表达变化趋势与转录组数据高度一致。
结论姜花杂交群体植株的极端株高的表型差异主要影响因素是节间细胞长度，高、矮植株在C区间的生长差异最为显著。姜花极端株高表型的差异是一个复杂的生物学过程，可能由多个基因的协同调控所致。
Abstract:ObjectiveThere were significant differences in plant height within the F1 hybrid population derived from the cross between Hedychium ‘Baitai’ and Hedychium ‘Jin’. This study was aimed to identify key genes regulating plant height of Hedychium through phenotypic and transcriptome sequencing (RNA-seq) analyses, thereby providing an important reference basis for the molecular breeding and plant architecture improvement of Hedychium.
MethodTwenty tallest and twenty shortest plants in the Hedychium hybrid population were selected for statistics of plant height, internode length, and internode cell length. Internodes were partitioned into A–D parts, and correlation analysis was performed to determine the factors influencing plant height variation. By comparing and analyzing the differences in internode length and internode cell length, the growth parts with differences were determined. RNA-seq was used to detect the mRNA expression levels of the differential growth parts of the tall and dwarf individual plants. Bioinformatics tools were employed to screen differentially expressed genes (DEGs). Combined with literature support, genes related to plant height regulation were screened, and verified by RT-qPCR.
ResultThere was a significant positive correlation between the internode length and internode cell length of the plants in the Hedychium hybrid population. The differences in internode length and internode cell growth in the C part between tall and dwarf plants were the most significant. A total of 269 DEGs were identified through RNA-seq analysis of the plant with tall and dwarf phenotypes. Thirteen genes related to plant height regulation with significant differential expression were screened out based on transcriptome data. Among them, HcMYB136, HcNAC140, HcEXPA4, HcEXPB3, HcXTH28, HcXTH8, HcCYCB1-1, and HcCYCD3-2 were down-regulated in the three extremely dwarf plants, while HcMYB238, HcMYB254, HcNAC126, HcbZIP50, and HcCDC27B were up-regulated in the three extremely dwarf plants. The RT-qPCR results showed that the expression change trends of these 13 genes were highly consistent with the transcriptome data.
ConclusionThe main influencing factor for the phenotypic variation of the extreme plant height in the Hedychium hybrid population is the internode cell length, and the growth differences in the C part of the tall and dwarf plants are the most significant. The phenotypic differences of the extreme plant height of Hedychium are a complex biological process, which may be caused by the coordinated regulation of multiple genes.
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Keywords:
- Hedychium /
- plant height /
- internode length /
- cell growth /
- transcriptome sequencing
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株高是影响植物产量和品质的关键农艺性状之一，矮化植株因其抗倒伏、较高的光合效率和更强的抗病虫害能力成为植物育种中备受关注的研究方向之一 [1]。矮化是一个复杂的生物学过程，涉及多种表型、生态生理和生化变化，针对高等植物株高的相关基因挖掘与功能鉴定，已成为生命科学领域的重要研究主题。目前，国内外学者已深入研究了水稻、玉米等粮食作物以及黄瓜、番茄等园艺作物的矮化机制，并建立了较为完善的矮化研究体系 [2]。然而，姜花的矮化种质资源相对匮乏，其调控机制的研究也较为有限，极大地制约了其遗传改良的进程。
植物矮化与一系列转录因子和激素合成相关基因密切相关。研究表明，水稻中DOF家族和GATA家族基因在矮化过程中发挥着重要作用 [3]。此外，已有研究鉴定出WRKY114基因，该基因编码的转录因子能够直接结合OsGA2ox4启动子，调控其表达，抑制水稻中的赤霉素(Gibberellin, GA)水平，从而导致矮化表型的出现 [4]。张贺通 [5]利用分离群体结合目标区段多态性标记开发及转录组测序等技术，在玉米中精细定位到ZmDLE1作为矮化关键基因；另一研究则在玉米中鉴定出MADS-box基因家族成员ZmMads42，并将其应用于玉米转基因，结果显示转基因后代的成熟株高比野生型降低约20cm，且花期提前 [6]。在黄瓜中，研究人员鉴定出矮化关键基因CsERECTA，该基因通过调控GA生物合成，控制茎的伸长并缩短节间 [7]。此外，梨中的PbNAC71基因通过与PbWAT1启动子结合，抑制PbWAT1的表达，进而限制木质部和导管的发育 [8]。
此外，植物激素在植物矮化调控中起着至关重要的作用，一些激素，如生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯等，其水平的升高往往会导致植株矮化。柑橘中BBX22基因功能的丧失促进了节间的伸长，而外源GA3处理BBX22过表达植株可恢复其表型，表明该基因参与了赤霉素的合成或信号转导途径 [9]。除了植物激素，许多非激素途径也参与了植物株高的调控，如EXP、XTH和CYC等基因的功能突变或丧失同样会导致植物矮化。在梨中，油菜素内酯(Brassinosteroid, BR)通过调节XTH家族基因PcBRU1来松动细胞壁，促进细胞形态的变化，从而促进茎的生长 [10]。在桃金娘中，3个CYCD基因通过促进细胞分裂积极调节植株的高度 [11]。
姜花属Hedychium是姜科Zingiberaceae多年生草本花卉，原产于热带和亚热带地区。姜花属植物普遍株型高大，因其较大的体型，难以作为盆栽花卉广泛应用，制约了其在园艺产业中的推广和应用 [12]。因此，培育矮化品种成为姜花产业发展的迫切需求。本研究以群体内部株高差异显著的‘白泰’姜花与金姜花杂交F1代群体为研究材料，进行株高数据的统计分析，并基于株高与节间长度的关系，进一步分析节间生长差异。通过转录组测序技术对群体中极端高株系与极端矮株系的节间进行详细分析，挖掘并分析与姜花株高调控相关的关键基因表达情况，为姜花矮化株型的改良和分子育种提供重要的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料是栽种于华南农业大学花卉研究中心种质资源圃的‘白泰’姜花与金姜花杂交F1代群体共118株，该群体内部株高差异显著，生长情况稳定，无病虫害干扰。
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图 1 ‘白泰’ב金姜花’群体高(右)、矮(左)植株Figure 1. The tall(left) and dwarf(right) plants from the Hedychium ‘Bai Tai’ × Hedychium ‘Jin’ population1.2 形态观测方法
1.2.1 植株高度与节间长度测量
株高的测量标准为地上茎部分底端至花序顶端的高度，节间测量标准为植株剥离叶鞘后各节间的长度。对118株植株进行株高统计后，选取群体中最高的20株单株作为对照组，最矮的20株单株作为试验组进行分析。
1.2.2 节间细胞形态观测
节间细胞观测采用指甲油涂抹撕取法 [13]，将姜花节间分离，截取节间上端5~7 mm区域后纵切节间为2等份，均匀涂抹无色透明的指甲油于任意等份内侧表面，静置风干后小心撕下外层指甲油膜铺于预先滴有纯净水的载玻片上，轻压紧盖玻片并吸干水分，随后使用显微镜观测。细胞测量使用ImageJ软件，每节间随机测量10个细胞，每细胞3次重复，最终长度取平均值。
1.2.3 节间分区统计
因高矮单株各株节间数量在9~13节不等，经过前期试验的大量解剖观察，为了对极端高、矮单株进行相同生长部位的差异比较分析，将植株各节间划分为A、B、C和D共4个区间如图2所示，A区间为近花序端前1~2节，B区间为3~5节，C区间为6~8节，D区间为第9节之后，区间内平均长度La计算公式为：
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图 2 群体高、矮表型植株节间分区a：矮表型单株，b：高表型单株；A、B、C和D为各单株的4个区间；P: 花序；1~10:各节节间。Figure 2. Partition of plants with tall and dwarf phenotypesa: Dwarf individual plant, b: Tall individual plants; A, B, C and D represent the four parts of each plant; P: Panicle; 1~10: internodes of each section.$$ L^{a}= \frac{{\displaystyle\sum }_{i=1}^{n}pi}{n} \text{，} $$ 式中，p为各节间长度，n为节间数量。
1.3 总RNA提取、cDNA文库构建及测序
1.3.1 总RNA提取与检测
用于转录组测序取样时截取其节间分生组织 [14]区域5~7 mm迅速冻存于液氮中，随即放置−80 ℃冰箱中进行保存。将供试材料放置液氮中研磨至粉末状，使用天根多糖多酚试剂盒(TIAGEN，德国)进行样品总RNA的提取，质控方式主要通过Agilent
2100 bioanalyzer进行RNA总量以及完整性的精确检测。总RNA 的提取以及质量检测均委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。1.3.2 cDNA文库构建与测序
在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子将Oligo(dT)磁珠富集到的带有polyA尾的mRNA进行随机打断再进行cDNA文库构建。建库后使用Qubit2.0 Fluorometer进行定量，文库中的insert size 使用Agilent
2100 bioanalyzer进行检测，再通过qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于1.5 nmol/L)后把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pulling并基于Illumina测序进行转录组测序。1.4 测序数据质控、组装与分析
1.4.1 测序数据质控
去除带接头的reads、含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、低质量reads(Qphred<=5的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)，进行测序错误率以及GC含量分布的检查，得到clean reads用于后续测序数据分析。
1.4.2 参考基因组比对与转录本组装、注释
使用HISAT2软件将测序数据质控后获得的clean Reads与参考基因组进行快速精确的比对，在参考基因组上获得Reads的定位信息，比对后，分别统计reads在基因组的内、外显子区域以及基因间区的占比，最后使用StringTie软件进行新转录本组装，并对其进行Pfam、GO、KEGG等数据库注释。采用subread软件中的featureCounts工具分别过滤掉低质量的reads，再进行定量分析，最后得到样本的表达矩阵。
1.4.3 差异基因筛选
表达定量完成后，对原始readcount进行标准化校正测序深度，然后统计学模型进行假设检验概率(P)的计算，再进行多重假设检验校正，得到FDR值。使用平均表达量的数据进行初步筛选，筛选差异基因的条件为｜log2(FoldChange)｜>1 (FoldChange 表示差异倍数)且P<0.05，再对初步筛选差异基因中的无描述基因、组内表达量误差大的基因进行排除。
1.5 关键基因的qRT-PCR验证
根据qRT-PCR引物的设计原则，以GAPDH作为内参基因，使用软件TBtools设计荧光定量引物并进行特异性检测，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系按照Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)试剂盒操作说明进行，使用ABI7500荧光定量PCR系统，每个样品设置3个生物学重复，反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，使用2−ΔΔCT法计算相关基因在不同样品中的表达情况。
1.6 数据分析方法
所有试验数据使用Excel(Microsoft)进行整理，并使用IBM SPSS Statistics 26 (IBM, California, USA)进行数据的处理，对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用最小显著差异法(LSD)进行多重比较检验差异显著性；变量间的相关性采用Pearson相关系数进行分析。
2. 结果与分析
2.1 群体株高差异与节间比较分析
2.1.1 群体极端高和极端矮植株的株高差异
选择群体中株高最高的20株和最矮的20株作为群体的高、矮极端植株池进行数据统计分析，两个植株池的株高比较如图3所示。极端高植株池平均株高为142.2 cm，而极端矮植株池的平均株高为 84.2 cm，结果表明群体中高、矮植株差异显著。
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图 3 20株高、矮表型植株株高柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，LSD法)。Figure 3. Heights of 20 plants with tall and dwarf phenotypesDifferent lowercase letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, LSD test).2.1.2 植株节间长度与细胞长度相关性分析
为了比较高单株和矮单株的节间差异，我们分别对20株高株和20株矮株的节间进行分析。通过分离各节间并纵切节间组织，对细胞进行观察和统计，各区间节间长度与节间细胞长度的相关性分析散点图如图4所示。相关性分析结果表明，A区间高株与矮株的节间长度与节间细胞长度的Pearson相关系数分别为0.67和0.62；B区间高株与矮株的Pearson相关系数分别为0.63和0.66；C区间高株与矮株的Pearson相关系数分别为0.63和0.68；D区间高株与矮株的Pearson相关系数分别为0.89和0.63。四个区间的节间长度与节间细胞长度之间均呈显著正相关，表明姜花节间长度的主要影响因素是节间细胞的长度，从而导致了高株与矮株的表型差异。
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图 4 高(上)、矮(下)表型植株各区间节间长度与细胞长度相关性分析Figure 4. Correlation analysis between internode length and cell length in different segments for plants with tall and dwarf phenotypes2.1.3 群体高和矮表型植株不同分区的节间和细胞长度差异
为了研究高、矮植株在生长发育时期节间生长的差异，我们对不同区间内的平均节间长度和平均节间细胞长度进行了统计对比分析。高、矮植株的节间及节间细胞的观测图如图5所示，结合单因素方差分析的结果(图6)，尽管在四个区间内高、矮植株的节间长度和节间细胞长度均表现出显著差异，但通过比较各区间节间长度差异的P值发现：C区间 < B区间 < A区间 < D区间；各区间节间细胞长度的差异分析P值为：C区间 < B区间 < D区间 < A区间。由此可见，C区间无论在节间长度还是节间细胞长度上的差异都最为显著，表明高、矮植株在C区间的节间生长差异最为突出，因此，C区间可以作为后续测序和采样的优选部位。
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图 5 高、矮表型植株的节间细胞观测Figure 5. Observations of internode cells in plants with tall and dwarf phenotypes![]()
图 6 高、矮表型植株各区间内平均节间长度比较与区间内平均细胞长度比较*和****分别表示在0.05和0.0001 水平差异显著(单因素方差分析)。Figure 6. Comparison of average internode length and average cell length within different segments for plants with tall and dwarf phenotypes* and **** indicate significant differences at the 0.05 and0.0001 levels, respectively (One-way ANOVA).2.2 测序数据分析
2.2.1 数据质量评估
分别选取3株最高的和3株最矮的极端植株截取第8叶期第5节间(处于C区间的节间)分生组织送测转录组。测序共获得273 709 874个 Raw reads，经过过滤后获得40.01 Gb Clean data。进行数据质量评估，各样本的Clean reads与姜花参考基因组的比对效率从91.23%到92.34%不等，数据整体的测序错误率不超过 0.03%，Q20 为 96.95%~97.67%，Q30为 92.06%~93.44%之间，GC 含量为 47.44%~49.73%，表明测序质量良好，基于以上质量评估结果，进行后续基因表达分析。
2.2.2 参考基因组比对
不同样品中比对到基因组上的reads数为
39286014 到49157570 个不等，占总reads数为91.23%~92.34%，而比对到参考基因组唯一位置的reads数为33943449 到42751921 之间，占比为84.8%~87.31%.其中，各样本比对到外显子区域bases总数为4346983713 到5692208664 个不等，占参考基因组bases数的80.94%~84.07%之间；比对到内含子区域bases总数有308149163 到447425658 个不等，占参考基因组bases数的4.97%~6.87%之间；比对到基因间区的bases总数有556 545 424到768 601 293个不等，占参考基因组bases数的9.87%~12.44%之间。2.2.3 新基因功能注释
新转录本组装后,我们对新转录本进行Pfam、GO、KEGG等数据库注释，其中新基因获得KEGG数据库注释共860条，获得GO数据库注释共13 805条。
2.3 差异表达基因筛选
为了筛选出影响株高的关键基因，基于基因表达定量分析的结果，结合高、矮表型组内的平均表达量，我们采用｜log2(FoldChange)｜>1 且P<0.05的标准(FoldChange 表示差异倍数)，初步筛选出947个差异表达基因，其中371个基因相较高表型组植株上调，576个基因相较高表型组植株下调。筛选得到的差异表达基因的火山图如图7所示。在初步筛选出的差异基因中，我们进一步过滤并排除了无描述信息以及组内误差较大的基因，最终得到269个显著差异表达基因，其中134个基因相较高表型组上调，135个基因相较高表型组下调，我们将基于这些过滤后得到的差异基因进一步筛选株高调控相关基因。
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图 7 姜花节间转录组初步筛选的矮表型组相较高表型组差异表达基因火山图Figure 7. Volcano plot of differentially expressed genes in dwarf phenotype group compared with tall phenotype group in the preliminary screening of the Hedychium internodal transcriptome2.4 群体极端高和极端矮姜花植株节间关键差异基因的挖掘
为了精准定位姜花株高的主要调控基因，结合前人的研究成果，我们从筛选出的转录组差异基因中挖掘出可能参与株高调控的关键基因。经过筛选，在姜花节间转录组中共识别出13个显著差异的株高调控关键基因(表1)，其中6个为转录因子，HcMYB136和HcNAC140在3株极端矮单株中表现为下调，而HcMYB238、HcMYB254、HcNAC126和HcbZIP50则在这些矮株中上调；另外7个非转录因子中，HcEXPA4、HcEXPB3、HcXTH28、HcXTH8、HcCYCB1-1和HcCYCD3-2在3株极端矮单株中均呈下调趋势，而HcCDC27B则表现为上调，这些基因的表达差异为揭示姜花株高调控机制提供了潜在的靶标。
表 1 群体高和矮表型植株节间的关键差异基因1)Table 1. Key differential genes in internodes of plants with tall and dwarf phenotypes within the population基因ID
Gene ID基因名称
Gene name基因注释
Gene annotationFPKM 参考文献
ReferenceDW1 DW2 DW3 T1 T2 T3 novel.500 HcEXPA4 Alpha-expansin-4 10.92 2.10 46.68 249.99 5305.36 1658.42 [15-17] evm_TU_scaf_66_113 HcEXPB3 Expansin-B3 168.34 97.81 130.27 244.10 425.52 232.23 [18,19] evm_TU_scaf_840_27 HcXTH28 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 28 0 0 2.17 2.94 33.54 15.95 [10,20] evm_TU_scaf_365_3 HcXTH8 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 8 45.50 18.93 27.14 76.47 81.75 83.32 [10,20,21] evm_TU_scaf_911_24 HcCYCB1-1 Cyclin-B1-1 0.91 0 0 6.87 8.38 30.14 [22,23] evm_TU_scaf_331_25 HcCYCD3-2 Cyclin-D3-2 0 2.10 0 4.90 44.02 5.32 [11,22] evm_TU_scaf_ 1003 _7HcCDC27B Cell division cycle protein 27 homolog B 148.31 45.22 217.11 0 1.05 5.32 [23] evm_TU_scaf_802_15 HcMYB136 Transcription factor MYB136 65.51 18.93 40.17 113.72 100.62 80.66 [24] evm_TU_scaf_493_73 HcMYB238 Transcription factor MYB238 213.83 387.04 179.12 43.13 133.12 86.87 [25] evm_TU_scaf_36_7 HcMYB254 Transcription factor MYB254 296.63 511.85 242.81 81.69 154.42 106.66 [25,26] evm_TU_scaf_183_72 HcNAC126 NAC domain-containing protein 126 18.20 49.43 47.77 12.74 10.48 10.64 [22] evm_TU_scaf_293_89 HcNAC140 NAC domain-containing protein 140 0.00 0.00 0.00 4.90 5.24 9.75 [15,27,28] evm_TU_scaf_ 1003 _6HcbZIP50 bZIP transcription factor 50 175.61 87.29 197.57 5.88 3.14 0.89 [29] 1) DW1、DW2和DW3分别为群体最矮的3个单株；T1、T2和T3分别为同一群体最高的3个单株。
1) DW1, DW2, and DW3 represent the three shortest individuals in the population, while T1, T2, and T3 represent the three tallest individuals in the same population.2.5 群体极端高和极端矮姜花植株节间转录组测序qRT-PCR验证
为了验证转录组数据的可靠性，我们对筛选出的13个差异表达的株高调控关键基因进行了qRT-PCR验证(图8)。结果表明，这13个关键基因在极端高株和极端矮株中的相对表达量变化趋势与转录组数据中FPKM值的变化一致。具体而言，HcMYB136、HcNAC140、HcEXPA4、HcEXPB3、HcXTH28、HcXTH8、HcCYCB1-1和HcCYCD3-2在3株极端矮单株中表达下调，而HcMYB238、HcMYB254、HcNAC126、HcbZIP50和HcCDC27B则在3株极端矮单株中表达上调。这些结果表明，转录组测序数据的可靠性较高，进一步验证了筛选出的关键基因在姜花株高调控中的潜在作用。
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图 8 姜花高、矮表型植株节间转录组差异表达基因qRT-PCR验证DW1、DW2和DW3分别为群体最矮的三个单株；T1、T2和T3分别为群体最高的三个单株。Figure 8. qRT-PCR verification of differentially expressed genes in internodal transcriptome of Hedychium with tall and dwarf phenotypes3. 讨论
本研究对‘白泰’和金姜花杂交F1代群体中极端高株与极端矮株的节间进行RNA测序和转录组分析。各样本的转录组中，比对到参考基因组的unigenes数量在33 943 449到45 308 304之间，mapping率介于91.23%至92.34%之间，表明该转录组数据质量较高。该数据为进一步研究姜花的生长发育分子机制及姜花矮化的分子育种提供了可靠的理论基础。在转录组分析中，共筛选出269个差异表达基因，其中135个基因上调，134个基因下调。
在先前的数据统计和调查中发现，该群体的矮化植株与高植株相比，节间的数量没有显著差异，但节间的长度却显著缩短。进一步观察植株的节间细胞，发现矮化植株的节间细胞缩短是导致节间缩短的主要原因，最终造成了极端高株与矮株的株高表型差异。植物的形态和功能特征通常依赖于细胞的分化与分裂能力[30]。在本研究中，我们从转录组差异表达基因中筛选出2个EXP基因。扩张蛋白(Expansins，EXP)是存在于植物细胞中的一种重要蛋白质，首次于1992年在黄瓜中被发现，并且研究表明α-expansins基因编码的蛋白能影响黄瓜细胞壁的伸展[31]。扩张蛋白通常分为五类，分别是α-expansins(EXPA)、β-expansins(EXPB)、expansin-like A(EXLA)、expansin-like B(EXLB)和expansin-like X(EXLX)[32,33]。学者在菊花中鉴定出了一个编码扩张蛋白的基因CmEXPA4，通过病毒沉默该基因，发现菊花根系的伸长受到抑制。研究还发现，外源吲哚丁酸能够诱导CmEXPA4表达上调，而外源脱落酸则抑制其表达[34]。水稻中的OsEXPBs基因通过CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，研究表明OsEXPBs通过裂解纤维素和半纤维素之间的氢键，进而促进花粉发芽和花粉管的伸长 [19]。在本研究中，我们通过筛选极端高株系与极端矮株系节间转录组差异基因，发现一个EXPA4基因和一个EXPB3基因在矮化株系中显著下调。这两个基因的下调与节间细胞缩短的现象相一致，与前述研究结果相符。因此，我们推测这些基因可能参与了姜花节间细胞伸长的相关调控途径。
XTHs(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases)是一类细胞壁修饰酶，能够催化木葡聚糖的断裂与重组[35]。在转录组分析中鉴定出的HcXTH28是拟南芥AtXTH28的同源基因，在拟南芥中，该家族的AtXTH31/AtXTH32基因在扩张组织中高度表达，然而，但单独敲除或同时敲除AtXTH31/AtXTH32后，拟南芥表型未出现显著变化 [20]。这一现象可能表明，这两个基因对植物形态的影响较为微弱，或其功能被其他生物学机制所补偿。此外，HcXTH8也是水稻OsXTH8的同源基因，已有研究表明，赤霉素能够上调OsXTH8的表达，并参与细胞伸长过程[21]。在关键基因筛选中，两个显著差异表达的编码细胞周期蛋白(Cyclins)的基因值得关注。细胞周期蛋白可分为CYCA、CYCB、CYCD和CYCP(CYCU)四大类[36,37]，在本研究中筛选到的基因为HcCYCB1-1与HcCYCD3-2。CYCB和CYCD是与有丝分裂密切相关的关键基因，分别在细胞周期的G2/M期和G1/S期发挥重要作用 [38,39]。研究表明，使用苯甲酸和肉桂酸对黄瓜进行一定剂量处理后，细胞周期基因CYCB的水平快速下调，进而抑制根系的生长 [40]。在水稻中，生长素(GAs)通过调节周期蛋白CYCB2的表达，促进细胞分裂，从而调控水稻叶片的生长 [16]。HcCDC27B是拟南芥AtCDC27B的同源基因，CDC27B是APC/C(Anaphase-promoting complex/cyclosome)复合物的重要组成部分，APC/C复合物通过介导包括周期蛋白在内的几种细胞周期调节蛋白的降解，在细胞周期和有丝分裂中发挥着至关重要的作用。拟南芥中，APC/C复合物通过复杂的调控网络影响AtCYCB1-1的表达，进而调控细胞分裂与伸长，影响植物细胞的生长 [23]。在本研究中，CYCB1-1和CYCD3-2在矮化株系的转录组中显著下调，推测这两个基因可能参与了节间缩短的相关生长机制。
此外，在转录组分析中筛选出的与生长发育相关的关键基因还包括6个转录因子，其中包括3个MYB家族转录因子HcMYB136、HcMYB238、HcMYB254；2个NAC家族转录因子HcNAC126、HcNAC140；以及1个bZIP家族转录因子HcbZIP50。MYB家族是植物中最大的转录因子家族之一，广泛参与新陈代谢、木质素合成和植物发育等过程。HcMYB136在矮化植株中的表达下调，已有研究报道MYB转录因子在植物生长中的正向调节作用。例如，黄瓜中的CsMYB36通过直接与CsEXLA3启动子结合，正向调节果颈的伸长。转录组中鉴定出的HcMYB238和HcMYB254在矮化植株中表达上调，最近的研究表明，水稻OsMYB14的过表达降低了植株的高度，表明OsMYB14可能通过调节GA生物合成及辅助蛋白代谢，负向调节水稻植株高度 [25]。HcMYB254是拟南芥AtMYB3的同源基因，研究发现AtMYB3在盐度应激条件下通过转录抑制作用调控木质素和花青素的积累 [26]。因此，推测HcMYB238和HcMYB254可能参与类似的植物生长负调控机制。NAC转录因子在植物生长发育中具有至关重要的作用。在本研究中，姜花转录组中鉴定出的HcNAC126在矮化植株中显著上调，已有研究表明，水稻中OsNAC103通过调节植物激素，负向调节水稻的高度 [22]。进一步的研究表明，OsNAC103过表达抑制了细胞周期的进展，并通过调节细胞周期相关基因OsCYCP2-1的活性，阻止了细胞周期的正常进行。此外，水稻中的OsNAC3作为种子萌发的正向调节因子，通过参与脱落酸合成转导途径，直接结合OsABA8ox1和OsEXP4启动子来影响胚胎的细胞伸长，从而调控种子萌发 [15]。在李Pyrus spp.中，PbNAC71通过调节PbWalls are thin 1基因的表达并与E3泛素连接酶PbRNF217相互作用，最终促进PbNAC71的降解，从而调控植物的高度、木质部及导管发育。苹果中MdNAC1的过度表达导致植株矮化，研究表明，MdNAC1通过调节ABA和BR的合成，影响植物的高度及细胞大小 [28]。而在姜花的转录组中，HcNAC140在矮化植株中显著下调，推测该基因可能参与了类似的调控机制，从而影响姜花的株高。此外，bZIP转录因子家族在植物生长发育过程中同样发挥重要作用。大豆中的bZIP家族基因GmFDL19的过表达使转基因植物的相对高度增加 [41]。此外，水稻中的OsEXPA7通过调节与产量相关的关键数量性状位点的表达，正向调节bZIP50基因的表达水平，进而参与种子贮藏蛋白的合成 [29]。本研究中鉴定出一个显著差异的HcbZIP50基因，在矮化植株中表达上调，此外，另有两个显著差异的EXP基因在矮化植株中下调，推测这些基因可能共同参与姜花株高调控的相同生物学通路，并由复杂的机制协同调控。
综上所述，本研究对‘白泰’姜花与金姜花杂交F1代群体中的极端高表型植株和极端矮表型植株进行了转录组分析,并筛选出大量差异表达基因。进一步分析中，我们筛选出了一些可能影响姜花株高的关键基因，并通过实时荧光定量PCR验证了转录组数据的可靠性。这些研究结果为深入揭示姜花株高的调控网络和分子机制提供了重要的理论依据，并为后续的分子育种和植物生长调控研究奠定了坚实基础。
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图 1 ‘白泰’ב金姜花’群体高(右)、矮(左)植株
Figure 1. The tall(left) and dwarf(right) plants from the Hedychium ‘Bai Tai’ × Hedychium ‘Jin’ population
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图 2 群体高、矮表型植株节间分区
a：矮表型单株，b：高表型单株；A、B、C和D为各单株的4个区间；P: 花序；1~10:各节节间。
Figure 2. Partition of plants with tall and dwarf phenotypes
a: Dwarf individual plant, b: Tall individual plants; A, B, C and D represent the four parts of each plant; P: Panicle; 1~10: internodes of each section.
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图 3 20株高、矮表型植株株高
柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，LSD法)。
Figure 3. Heights of 20 plants with tall and dwarf phenotypes
Different lowercase letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, LSD test).
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图 4 高(上)、矮(下)表型植株各区间节间长度与细胞长度相关性分析
Figure 4. Correlation analysis between internode length and cell length in different segments for plants with tall and dwarf phenotypes
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图 5 高、矮表型植株的节间细胞观测
Figure 5. Observations of internode cells in plants with tall and dwarf phenotypes
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图 6 高、矮表型植株各区间内平均节间长度比较与区间内平均细胞长度比较
*和****分别表示在0.05和
0.0001 水平差异显著(单因素方差分析)。Figure 6. Comparison of average internode length and average cell length within different segments for plants with tall and dwarf phenotypes
* and **** indicate significant differences at the 0.05 and
0.0001 levels, respectively (One-way ANOVA).![]()
图 7 姜花节间转录组初步筛选的矮表型组相较高表型组差异表达基因火山图
Figure 7. Volcano plot of differentially expressed genes in dwarf phenotype group compared with tall phenotype group in the preliminary screening of the Hedychium internodal transcriptome
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图 8 姜花高、矮表型植株节间转录组差异表达基因qRT-PCR验证
DW1、DW2和DW3分别为群体最矮的三个单株；T1、T2和T3分别为群体最高的三个单株。
Figure 8. qRT-PCR verification of differentially expressed genes in internodal transcriptome of Hedychium with tall and dwarf phenotypes
表 1 群体高和矮表型植株节间的关键差异基因1)
Table 1 Key differential genes in internodes of plants with tall and dwarf phenotypes within the population
基因ID
Gene ID基因名称
Gene name基因注释
Gene annotationFPKM 参考文献
ReferenceDW1 DW2 DW3 T1 T2 T3 novel.500 HcEXPA4 Alpha-expansin-4 10.92 2.10 46.68 249.99 5305.36 1658.42 [15-17] evm_TU_scaf_66_113 HcEXPB3 Expansin-B3 168.34 97.81 130.27 244.10 425.52 232.23 [18,19] evm_TU_scaf_840_27 HcXTH28 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 28 0 0 2.17 2.94 33.54 15.95 [10,20] evm_TU_scaf_365_3 HcXTH8 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 8 45.50 18.93 27.14 76.47 81.75 83.32 [10,20,21] evm_TU_scaf_911_24 HcCYCB1-1 Cyclin-B1-1 0.91 0 0 6.87 8.38 30.14 [22,23] evm_TU_scaf_331_25 HcCYCD3-2 Cyclin-D3-2 0 2.10 0 4.90 44.02 5.32 [11,22] evm_TU_scaf_ 1003 _7HcCDC27B Cell division cycle protein 27 homolog B 148.31 45.22 217.11 0 1.05 5.32 [23] evm_TU_scaf_802_15 HcMYB136 Transcription factor MYB136 65.51 18.93 40.17 113.72 100.62 80.66 [24] evm_TU_scaf_493_73 HcMYB238 Transcription factor MYB238 213.83 387.04 179.12 43.13 133.12 86.87 [25] evm_TU_scaf_36_7 HcMYB254 Transcription factor MYB254 296.63 511.85 242.81 81.69 154.42 106.66 [25,26] evm_TU_scaf_183_72 HcNAC126 NAC domain-containing protein 126 18.20 49.43 47.77 12.74 10.48 10.64 [22] evm_TU_scaf_293_89 HcNAC140 NAC domain-containing protein 140 0.00 0.00 0.00 4.90 5.24 9.75 [15,27,28] evm_TU_scaf_ 1003 _6HcbZIP50 bZIP transcription factor 50 175.61 87.29 197.57 5.88 3.14 0.89 [29] 1) DW1、DW2和DW3分别为群体最矮的3个单株；T1、T2和T3分别为同一群体最高的3个单株。
1) DW1, DW2, and DW3 represent the three shortest individuals in the population, while T1, T2, and T3 represent the three tallest individuals in the same population.
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