Effect of initiation codon mutation within tva gene on Qingyuan partridge chicken resistance to infection by avian leukemia virus subgroup K
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摘要:目的
探究tva受体基因起始密码子突变tva c.3G>A对清远麻鸡感染K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K，ALV-K)的影响。
方法利用直接测序方法对清远麻鸡不同品系tva c.3G>A突变位点进行基因分型。利用流式细胞术和RT-qPCR检测RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒和ALV-K GD1601病毒感染清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)的情况。利用RT-qPCR检测ALV-K GD1601病毒感染清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型雏鸡的情况。
结果tva c.3G>A突变位点的基因分型结果显示，杂合突变基因型tva c.3G/A和纯合突变基因型tva c.3A/A存在于清远麻鸡K、M品系，其频率分别为0.183、0.133和0.116、0.033。流式细胞术和RT-qPCR检测结果显示，tva c.3G>A突变位点野生型tva c.3G/G CEFs对RCASBP(K)-EGFP和ALV-K GD1601病毒易感，而纯合突变基因型tva c.3A/A CEFs有效抗RCASBP(K)-EGFP和ALV-K GD1601病毒的感染，表明tva c.3G>A突变导致清远麻鸡体外抗ALV-K的感染。ALV-K攻毒试验结果表明，tva c.3G>A突变导致清远麻鸡体内抗ALV-K的感染。
结论tva c.3G>A突变引起清远麻鸡体外、体内抗ALV-K的感染，该突变位点可作为清远麻鸡ALV-K抗性选育的遗传标记。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of initiation codon mutation within tva receptor gene (tva c.3G>A) on Qingyuan partridge chicken resistance to infection by avian leukosis virus subgroup K (ALV-K).
MethodThe tva c.3G>A mutation site within Qingyuan partridge chicken lines was genotyped by using direct sequencing method. The infection of RCASBP(K)-EGFP fluorescent reporter virus and ALV-K GD1601 virus to chicken embryo fibroblast (CEFs) with different genotypes of tva c.3G>A mutation site were detected by flow cytometry and RT-qPCR, respectively. The infection of ALV-K GD1601 virus to Qingyuan partridge chicks with different genotypes of tva c.3G>A mutation site were detected by RT-qPCR.
ResultThe genotyping results of tva c.3G>A mutation site showed that the heterozygous mutant genotype tva c.3G/A and the homozygous mutant genotype tva c.3A/A existed in Qingyuan partridge chicken lines K and M, with the frequencies of 0.183, 0.133 and 0.116, 0.033, respectively. The results of flow cytometry and RT-qPCR showed that the tva c.3G>A mutation site wild-type tva c.3G/G CEFs were susceptible to infection by both RCASBP(K)-EGFP and ALV-K GD1601 virus, while the homozygous mutant genetype tva c.3A/A CEFs were effectively resistant to infection by RCASBP(K)-EGFP and ALV-K GD1601 viruses, demonstating that tva c.3G>A mutation causes Qingyuan partridge chicken resistance to infection by ALV-K in vitro. The results of ALV-K challenge test indicated that tva c.3G>A mutation led to Qingyuan partridge chicks resistance to infection by ALV-K in vivo.
ConclusionThe tva c.3G>A mutation confers Qingyuan partridge chicken resistance to infection by ALV-K both in vitro and in vivo, indicating that it can be used as a genetic marker for ALV-K resistance selection in Qingyuan partridge chicken.
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K亚群禽白血病是由K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K，ALV-K)感染引起的禽免疫抑制性肿瘤性传染病[1]。ALV-K是感染鸡群的禽白血病病毒新亚群[2-3]；然而，近年来我国鸡种禽白血病流行病学调查研究发现，ALV-K在我国不同类型鸡种中普遍发生与流行[4-9]，已成为我国鸡群禽白血病的主要病原。感染鸡群会产生持续性的病毒血症、生产性能下降以及严重的免疫抑制，给我国养禽业造成重大的经济损失[4, 10]。迄今为止，K亚群禽白血病尚无商品化疫苗和有效的治疗方法，主要通过传统的种群净化措施进行防控[11-12]；然而，种群净化周期长、费用高，且净化后阴性鸡群依然面临再次感染ALV-K的风险，很难维持种群净化的成效[13-14]。因此，迫切需要控制K亚群禽白血病的新策略和技术手段。
鸡tva受体基因编码Tva受体蛋白，介导ALV-A侵入宿主细胞，继而发生感染[15]。有研究表明tva受体基因的遗传突变可能导致宿主对ALV-A的感染产生抗性[16-17]。陈伟国等[18]研究发现，我国黄羽肉鸡品系tva受体基因编码区第3位碱基由G突变为A(tva c.3G>A)，导致tva受体基因起始密码子序列由ATG突变为ATA，致使我国黄羽肉鸡品系抗ALV-A的感染。Přikryl等[19]报道ALV-K与A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A，ALV-A)共用tva受体基因编码的Tva受体蛋白作为细胞受体。本研究前期工作发现清远麻鸡品系中存在tva c.3G>A突变，然而，该突变对清远麻鸡感染ALV-K的影响尚不清楚。因此，本研究将在体外、体内验证tva c.3G>A突变是否致清远麻鸡抗ALV-K的感染，以期鉴定清远麻鸡ALV-K抗性位点，为清远麻鸡K亚群禽白血病抗病育种提供具有育种价值的分子标记。
1. 材料与方法
1.1 试验动物、细胞株、毒株及质粒
清远麻鸡F、K、M、W品系抗凝血样均采自广东爱健康生物科技有限公司，每个品系均随机采血60份，共240份血液样品。tva c.3G>A突变位点野生型tva c.3G/G、杂合突变基因型tva c.3G/A和纯合突变基因型tva c.3A/A种蛋和1日龄雏鸡均由广东爱健康生物科技有限公司清远麻鸡原种场提供。1日龄无特定病原(Specific pathogen free，SPF)鸡苗和9日龄SPF胚蛋均购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。DF-1细胞系和RCASBP(K)-EGFP重组质粒为广东省畜禽健康养殖与环境控制重点实验室保存。ALV-K GD1601毒株为华南农业大学曹伟胜教授惠赠。
1.2 主要试剂
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶DNA回收试剂盒均购自诺维赞(南京)公司；KOD-FX酶购自Toyobo公司；pMD19-T、反转录试剂盒、PrimeScript® One Step RT-PCR Kit购自Takara公司；FastStart SYBR Green Master(Rox)购自Roche公司；DMEM细胞培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、Opti-DMEM无血清培养基、青链霉素、胰蛋白酶均购自Gibco公司；Lipofectamine
3000 转染试剂、TRIZOL reagent购自Invitrogen公司；ELISA试剂盒购自哈尔滨国生公司。1.3 RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒的拯救及ALV-K GD1601株病毒的扩繁
将重组质粒RCASBP(K)-EGFP转染入DF-1细胞，7 d内观察GFP荧光表达情况，从DF-1细胞上清液中分离出表达绿色荧光蛋白的重组病毒RCASBP(K)-EGFP，测定其感染单位(IU)，将106 IU/mL的重组病毒RCASBP(K)-EGFP分装并保存于−80 ℃冰箱备用。用0.22 nm滤膜过滤ALV-K GD1601株病毒液后，接种于80%汇合度的DF-1细胞系，孵育2 h后，换成含2% (φ) FBS的维持培养液继续培养。至DF-1细胞长满后，正常盲传3~4代。收集含ALV-K GD1601株病毒液的DF-1细胞上清液，用ELISA试剂盒检测病毒效价，确保样品与阳性对照的光密度比值(S/P)≥2.0，置于−80 ℃冰箱保存以备后续试验。
1.4 清远麻鸡品系tva c.3G>A突变位点的基因分型
提取清远麻鸡F、K、M、W品系抗凝血样的基因组DNA，采用PCR扩增tva c.3G>A突变位点所在的tva基因序列[21]。将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，应用Chromas 2.4软件分析测序序列中tva c.3G>A突变位点的遗传变异，对清远麻鸡品系的tva c.3G>A突变位点进行基因分型。
1.5 清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型鸡胚成纤维细胞的分离与培养
将清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型(野生型tva c.3G/G、杂合突变基因型tva c.3G/A和纯合突变基因型tva c.3A/A)的9日龄胚蛋消毒后，用弯头镊子打开气室、壳膜，挑出鸡胚置于含PBS溶液的平皿中，用眼科剪和镊子剔除四肢、内脏，漂洗2次去除血污。将清洗后的肌肉组织块置于2 mL离心管中，使用眼科剪剪成肉糜状，加入0.25%(w)胰酶溶液后，置于37 ℃水浴箱中充分消化20~30 min，最后加入适量FBS停止消化。使用200 μm细胞滤膜过滤后，组织滤液于800 r/min离心4 min，保留底部消化细胞，用完全培养基对其进行重悬，分装入无菌培养皿中，获取纯化的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)，置于CO2体积分数为5%、39 ℃的培养箱中培养。
1.6 利用流式细胞术检测RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒的体外感染
将清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型的CEFs分别接种于24孔板中，3次重复，每孔接种5×104个细胞。培养24 h左右细胞长至约80%后，向每孔CEFs加入250 μL RCASBP(K)-EGFP病毒液(终浓度为5×105 IU/mL)。孵育2 h后，移除病毒液，使用含1% (φ) FBS的维持培养基继续培养。在感染后的第5天，利用BD FACSVerseTM流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)分析tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs中GFP阳性细胞的百分率。
1.7 利用RT-qPCR检测ALV-K GD1601病毒的体外感染
将清远麻鸡tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs分别接种于24孔板中，3次重复，每孔接种5×104个细胞。培养24 h后，利用250 μL ALV-K GD1601株病毒液(S/P=2.2)感染CEFs。感染后24 h，将培养基替换为新鲜培养基，将CEFs置于5% (φ) CO2、39 ℃下孵育4 d。感染后第1、2、3和4天，分别收集细胞上清液，进行RNA提取和cDNA合成，参照前期建立的ALV-K RT-qPCR方法检测ALV-K GD1601毒株感染tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs后的病毒滴度[20]。
1.8 ALV-K体内攻毒试验
利用清远麻鸡K品系tva c.3G>A突变位点不同基因型种鸡进行配种，收集种蛋进行孵化，随机挑选40只孵化的1日龄雏鸡分为2组，每组20只，每组另选3只1日龄SPF雏鸡作为攻毒对照，饲养于2个隔离器，提供饲料和水。1日龄时，每只雏鸡腹腔接种0.4 mL ALV-K GD1601株病毒液(S/P=2.2)，5日龄时，使用相同的方法再次进行ALV-K攻毒。攻毒后2周，采集每只雏鸡的抗凝血样，通过直接测序方法对每只雏鸡tva c.3G>A突变位点进行基因分型，确定每只雏鸡的基因型[19]。攻毒后4周，采集每只雏鸡的抗凝血样，抽提总RNA并合成cDNA，利用前期建立的RT-qPCR方法检测tva c.3G>A突变位点不同基因型雏鸡对ALV-K GD1601毒株的感染情况[22]。
1.9 统计分析
使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析和绘图，数据结果以平均值±标准差表示。利用Popgene软件分析tva c.3G>A突变位点在清远麻鸡F、K、M、W品系中的基因型频率分布。
2. 结果与分析
2.1 清远麻鸡不同品系tva c.3G>A突变位点的基因型频率
清远麻鸡F、K、M、W品系tva c.3G>A突变位点的基因分型结果如表1所示。在清远麻鸡K、M品系中存在杂合突变基因型tva c.3G/A和纯合突变基因型tva c.3A/A，其频率分别为0.183、0.133和0.116、0.033。在清远麻鸡F、W品系中没有检测到tva c.3G>A突变位点。
表 1 清远麻鸡品系tva c.3G>A突变位点的基因型频率Table 1. Genotypic frequency of tva c.3G>A mutation site in Qingyuan partridge chicken lines品系
Line样品数
No. of samples基因型 Genotype tva c.3G/G tva c.3G/A tva c.3A/A F 60 1.000 0 0 K 60 0.701 0.183 0.116 M 60 0.834 0.133 0.033 W 60 1.000 0 0 2.2 RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒的拯救
将RCASBP(K)-EGFP表达质粒转染入DF-1细胞，转染后72 h，用倒置荧光显微镜观察DF-1细胞中GFP荧光标记蛋白的表达情况。结果如图1所示，DF-1细胞高度表达GFP绿色荧光，表明成功拯救了RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒。
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图 1 RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒的拯救绿色荧光为表达GFP的细胞；标尺=100 μmFigure 1. Rescue of RCASBP(K)-EGFP fluorescence reporter virusGreen fluorescence represents cells expressing GFP; Scale=100 μm2.3 tva c.3G>A突变致清远麻鸡体外抗RCASBP(K)-EGFP的感染
RCASBP(K)-EGFP病毒对tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs的感染情况如图2、3所示。RCASBP(K)-EGFP病毒对野生型tva c.3G/G、杂合突变基因型tva c.3G/A CEFs的感染率分别约为97%和81%，而对纯合突变基因型tva c.3A/A CEFs的感染率低于0.3%，呈不感染状态，表明tva c.3G>A突变导致清远麻鸡体外抗RCASBP(K)-EGFP的感染。
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图 2 RCASBP(K)-EGFP感染tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs 5 d后的GFP阳性细胞率Figure 2. GFP positive cell rates for CEFs of different genotypes of tva c.3G>A mutation site after 5 d infection with RCASBP(K)-EGFP![]()
图 3 流式细胞术检测RCASBP(K)-EGFP感染tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs 5 d后GFP阳性细胞率的代表图Figure 3. Flow cytometry detection representative diagram of GFP positive cell rates for CEFs of different genotypes of tva c.3G>A mutation site after 5 d infection with RCASBP(K)-EGFP为进一步验证RCASBP(K)-EGFP感染的结果，利用ALV-K GD-
1601 毒株分别感染tva c.3G>A突变位点不同基因型，ALV-K在tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs中的增殖情况如图4所示。ALV-K GD-1601 毒株在野生型tva c.3G/G CEFs中复制和生长迅速，感染后第4天滴度达到约108.0病毒拷贝数/mL。相比之下，在纯合突变基因型tva c.3A/A CEFs中，ALV-K GD-1601 毒株没有明显的生长趋势。杂合突变基因型tva c.3G/A CEFs被ALV-K野毒有效感染，ALV-K的生长动力学特征与野生型tva c.3G/G CEFs相似，感染后第4天滴度约为106.5病毒拷贝数/mL。结果表明tva c.3G>A突变引起清远麻鸡在体外抗ALV-K GD-1601 病毒的感染。![]()
图 4 ALV-K在tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs中的增殖过程Figure 4. Proliferation process of ALV-K in CEFs of different tva c.3G>A mutation site genotypes2.4 tva c.3G>A突变致清远麻鸡体内抗ALV-K的感染
tva c.3G>A突变对清远麻鸡体内感染ALV-K的影响如图5所示。感染ALV-K GD-
1601 毒株4周后，6只SPF雏鸡均为ALV-K阳性，血清病毒滴度介于104.5~106.0病毒拷贝数/mL，说明ALV-K体内攻毒试验成立。野生型tva c.3G/G雏鸡(16只)攻ALV-K GD-1601病毒后，血清病毒滴度介于103.0~105.5病毒拷贝数/mL，均为ALV-K阳性；杂合突变基因型tva c.3G/A雏鸡(13只)攻ALV-K野毒后有10只为ALV-K阳性，其血清病毒滴度介于103.5~105.5病毒拷贝数/mL，另外3只雏鸡未检测到ALV-K拷贝数；而纯合突变基因型tva c.3A/A雏鸡(11只)均为ALV-K阴性。结果表明，tva c.3G>A突变导致清远麻鸡在体内抗ALV-K的感染。![]()
图 5 tva c.3G/G、tva c.3G/A和tva c.3A/A雏鸡感染ALV-K的情况Figure 5. Infection of ALV-K in tva c.3G/G, tva c.3G/A and tva c.3A/A genotypes chicks3. 讨论与结论
近年来禽白血病的分子流行病学调查研究发现，ALV-K在我国地方鸡种、黄羽肉鸡、白羽肉鸡、蛋鸡中普遍发生与流行[4, 7-9]。ALV-K持续不断地感染鸡群，赋予鸡群极大的选择压力，导致某些个体为适应或逃逸病毒的侵染而对ALV-K的感染产生遗传抗性。本研究鉴定发现清远麻鸡品系tva受体基因中存在tva c.3G>A突变，致使清远麻鸡在体外、体内均抗ALV-K感染，证实tva c.3G>A突变位点为ALV-K抗性位点。
ALV受体基因的遗传突变可能导致受体蛋白表达完全缺失或表达一个不适合作为病毒受体的缺陷型受体蛋白，从而缺失或降低ALV表面糖蛋白与受体蛋白的结合亲和力，致使宿主细胞对特定亚群ALV的感染产生抗性[20-22]。Přikryl等[19]报道鸡tva基因编码的Tva蛋白是ALV-K与ALV-A的共用细胞受体，其可有效地介导ALV-K感染并进入宿主细胞。Tva受体中的几个区域和特定的氨基酸残基已被确认为是与ALV-K包膜糖蛋白结合亲和力的关键决定因子，并介导病毒的有效感染与进入。决定Tva受体蛋白相关功能的LDL-A(Low-density lipoprotein A)结构域，由40个氨基酸构成，位于Tva受体蛋白成熟肽氨基端胞外区域第11—51残基之间，6个半胱氨酸之间的3个二硫键维持Tva受体蛋白的稳定结构，从而充分介导ALV-K进入宿主细胞[23]。Li等[24]研究报道Tva受体蛋白残基E53、L55、H59和G70是Tva受体蛋白介导ALV-K感染的关键氨基酸残基。tva c.3G>A突变引起tva受体基因始密码子序列由ATG突变为ATA，致使Tva蛋白氨基酸序列的第1个氨基酸由甲硫氨酸改变为异亮氨酸，推测该突变可能导致Tva蛋白表达缺失或表达一个不适合作为ALV-K受体的缺陷型Tva受体蛋白，解释了tva c.3G>A突变致使清远麻鸡抗ALV-K感染的原因。
陈伟国等[18]前期研究发现我国黄羽肉鸡品系存在tva c.3G>A突变，致使我国黄羽肉鸡品系对ALV-A的感染产生抗性。因此，tva c.3G>A突变位点可作为ALV-A、ALV-K的共同抗性位点。抗病育种是控制禽白血病的重要手段和有效策略，本研究发现清远麻鸡K、M品系中存在杂合抗性基因型tva c.3G/A和纯合抗性基因型tva c.3A/A，其频率分别为0.183、0.133和0.116、0.033，表明清远麻鸡K、M品系具有良好的ALV-A、ALV-K协同抗性改良潜力，可用于筛选抗ALV-A、ALV-K新品种(品系)的育种素材，为实现清远麻鸡A、K亚群禽白血病的抗性选育提供技术支撑。
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图 1 RCASBP(K)-EGFP荧光报告病毒的拯救
绿色荧光为表达GFP的细胞；标尺=100 μm
Figure 1. Rescue of RCASBP(K)-EGFP fluorescence reporter virus
Green fluorescence represents cells expressing GFP; Scale=100 μm
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图 2 RCASBP(K)-EGFP感染tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs 5 d后的GFP阳性细胞率
Figure 2. GFP positive cell rates for CEFs of different genotypes of tva c.3G>A mutation site after 5 d infection with RCASBP(K)-EGFP
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图 3 流式细胞术检测RCASBP(K)-EGFP感染tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs 5 d后GFP阳性细胞率的代表图
Figure 3. Flow cytometry detection representative diagram of GFP positive cell rates for CEFs of different genotypes of tva c.3G>A mutation site after 5 d infection with RCASBP(K)-EGFP
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图 4 ALV-K在tva c.3G>A突变位点不同基因型CEFs中的增殖过程
Figure 4. Proliferation process of ALV-K in CEFs of different tva c.3G>A mutation site genotypes
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图 5 tva c.3G/G、tva c.3G/A和tva c.3A/A雏鸡感染ALV-K的情况
Figure 5. Infection of ALV-K in tva c.3G/G, tva c.3G/A and tva c.3A/A genotypes chicks
表 1 清远麻鸡品系tva c.3G>A突变位点的基因型频率
Table 1 Genotypic frequency of tva c.3G>A mutation site in Qingyuan partridge chicken lines
品系
Line样品数
No. of samples基因型 Genotype tva c.3G/G tva c.3G/A tva c.3A/A F 60 1.000 0 0 K 60 0.701 0.183 0.116 M 60 0.834 0.133 0.033 W 60 1.000 0 0 
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