Community structure and functional features of soil microbes in the rice-fish co-culture system
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摘要:目的
研究稻鱼共生系统(Rice-fish co-culture system，RF)土壤微生物群落结构特征，并分析其碳氮循环相关功能与水稻单作系统(Rice monoculture system，RM)的差异。
方法水稻生长季在全球重要农业文化遗产——青田稻鱼共生系统的保护地开展稻田土壤取样，采用高通量测序技术，比较RF和RM中土壤细菌和古菌群落结构和功能差异。
结果RF土壤细菌和古菌的优势菌门和优势菌属与RM保持一致，但α多样性均显著提高；RF促进土壤微生物间相互作用和网络优势模块功能多样化，但是对于群落网络稳定性的影响并不明确。基于FAPROTAX功能预测，相较于RM，RF增强了甲烷氧化和氮固定作用之间的正相关关系，减弱了硝化作用与甲烷产生和反硝化作用之间的相关性以及甲烷氧化与反硝化作用之间的相关性。典型关联分析结果表明，与RM相比，RF降低了土壤有机质、速效氮和速效磷含量对土壤微生物群落结构的影响，同时增强了土壤总磷含量和土壤pH的影响。
结论青田传统稻鱼共生系统有助于提高稻田土壤微生物群落α多样性，整体上增强土壤微生物间的相互作用和网络复杂性，但是减弱了甲烷和氮素循环过程相关微生物功能群的相互关系。本研究结果为进一步揭示水稻−水生动物共生系统的微生物生态学过程提供了研究基础。
Abstract:ObjectiveThis study aimed to investigate the soil microbial community structure of the rice-fish co-culture system (RF), and compare its microbial functions on carbon and nitrogen cycling to those of rice monoculture system (RM).
MethodWe sampled soil from paddies during the rice growth season at the site of the Qingtian rice-fish co-culture system, a globally important agricultural cultural heritage. Using high-throughput sequencing technology, we compared the structure and function of soil bacterial and archaeal communities between RF and RM.
ResultRF significantly increased the α-diversity of bacterial and archaeal communities, while the dominant phyla or genera remained the same as RM. RF also improved the interactions among soil microbes and the functional diversity of dominant network modules, but its effect on network stability was unclear. Based on FAPROTAX prediction of functions, RF strengthened the positive relationship between methane oxidation and nitrogen fixation compared to RM. However, RF weakened the relationship between nitrification and methane production/denitrification, as well as the relationship between methane oxidation and denitrification. The canonical correlation analysis results demonstrated that, compared with RM, RF reduced the effects of soil organic matter, available N, and available P contents on soil microbial community structure but enhanced the effects of soil total phosphorus content and soil pH.
ConclusionIn Qingtian, the traditional rice-fish co-culture system increases the α-diversity of soil microbial communities, global microbial interactions, and the complexity of microbial networks. However, traditional RF weakens the relationships between different microbial functional groups involved in methane and nitrogen cycling. These findings provide a basis for further research on the microbial ecological processes in rice-aquatic animal co-culture systems.
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Keywords:
- Rice-fish co-culture /
- Soil microbe /
- Microbial network /
- Function prediction
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水稻种植和水产养殖的结合(即稻田综合种养，在稻田中养殖各种水生动物，包括鲤鱼、螃蟹、小龙虾等)被认为是一种可减少农业化学品投入、有效利用耕地和淡水资源，从而实现碳水化合物(水稻)和动物蛋白(水生动物)绿色生产的可持续农业模式。稻鱼共生系统(Rice-fish co-culture system，RF)在我国和东南亚国家具有悠久历史[1-2]，传统养殖的对象以鲤鱼和鲫鱼为主。截至2022年，我国稻田综合种养面积达2.86×106 hm2，其中，稻鱼共生系统占比34.92%，为现阶段第二大模式[3]。
与水稻单作相比，水稻和水生动物的种养结合可促进稻田资源的高效利用和生态系统服务的提升[4-5]。文献整合分析表明，稻田综合种养系统水稻产量较水稻单作系统(Rice monoculture system，RM)提高1.45%~27.00%[6]。水生动物的觅食和排泄活动增加了土壤氮、磷元素及有机质的含量，且长期淹水环境减缓了养分的流失[7]，因此稻鱼共生系统能够显著增加稻田土壤有机碳和总氮含量[8]。研究表明，稻鱼共生系统可以减少化肥施用，提高养分利用效率[4]，减少NH3挥发、N径流和N淋溶等途径的氮素流失[9]，并减缓稻田温室气体排放[10-11]。
近年来，微生物测序与分析技术被用于稻田土壤微生物群落研究。其中，微生物网络分析逐渐被应用于探索群落聚集模式、可视化展示不同类群对农艺措施的响应模式和识别微生物群落关键种等方面[12]。对于稻鱼共生系统的研究表明，该系统不仅能够增加土壤微生物多样性[13]，还能够提高土壤微生物共现网络节点、连接数等，增加微生物群落的复杂性[14]。此外，稻鱼共生系统也对土壤微生物群落功能产生影响。例如，稻鱼共生系统产甲烷菌和甲烷氧化菌丰度显著高于水稻单作[15-16]。鱼类活动增加水体氧气含量，增加土壤微生物对土壤氮等物质的矿化作用[17]，且鱼类对于沉积物的取食进一步增加了土壤细菌丰度[18]，加速微生物土壤营养元素循环。但是现阶段稻鱼共生系统土壤微生物的分析方法还多集中于土壤微生物多样性和丰富度等群落组成和结构方面，对于微生物功能的研究也多基于对微生物功能基因片段的测定。依据可培养分类群数据对土壤微生物群落进行原核分类群生态相关功能注释的FAPROTAX算法[19]与基于KEGG代谢通路对微生物潜在功能基因分析方法的出现，为稻田土壤微生物研究的发展提供了新的思路。功能预测或能够帮助我们进一步了解该系统中土壤微生物群落特征，揭示水稻和动物共存如何影响稻田土壤微生物群落结构与功能的机理。
为此，本研究以全球重要农业文化遗产——青田稻鱼共生系统为研究对象，在水稻分蘖后期对9个自然村稻鱼共生系统和水稻单作系统田块土壤进行采样，分析土壤细菌和古菌群落结构及生态功能特征，以阐明当地农户的生产管理下稻鱼共生系统对土壤微生物的影响特征。
1. 研究方法
1.1 研究地点简介
青田稻鱼共生系统作为首批全球重要农业文化遗产，主要分布在青田县东南部的方山乡及其周边的仁庄镇和小舟山乡等乡镇[20]。当地保留了较为传统的山区稻田养鱼方式，养殖品种为‘青田田鱼’Cyprinus carpio qingtianensis，是经历稻田生境长期驯化得到的地方品种，具有丰富的体色和遗传多样性[21]。生长季内稻田保持流水淹灌，投喂以农家饲料为主(小麦、豆饼和稻谷等)，鲤鱼产量较低(大多低于375 kg·hm−2)。
本研究开展于青田县(120.17°E, 28.08°N)西南部的仁庄镇(120.25°E, 28.04°N)。仁庄镇与方山乡毗邻，海拔80 m，地属中亚热带季风气候，温暖湿润，四季分明，全年平均气温18 ℃，无霜期280 d，年降雨量
1897 mm。该地区水稻土的质地为砂壤土，容重约为1.12 g·cm−3，土壤呈弱酸性。1.2 土壤样本采集和保存
于2018年7月20日—7月25日(属当地一季稻的分蘖后期)，在仁庄镇随机选择的9个自然村(半坑、东坪、莲头、外垟、小令、新彭、垟坑、严寮和垟心)内，随机选择毗邻的稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)田块各2~4块(图1)。在每个田块内随机采集6个土芯(深度0~10 cm)后合并为1份混合样本。共采集土壤混合样本48份，其中RF样本24份，RM样本24份。
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图 1 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)研究区域示意图RF和RM后面的数字代表取样田块的数量。Figure 1. Map of the research area of rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)The numbers following RF and RM represent the number of sampling fields.每份土壤混合样本充分混匀后平均分为2个部分。一部分过20目网筛后在4 ℃条件下保存，用于土壤微生物DNA提取；另一部分放于阴凉通风处干燥，用于土壤理化性质测定。
1.3 土壤DNA提取、PCR扩增及测序
土壤样本在采集后1周内采用BioFast土壤基因组提取试剂盒(杭州博日)提取微生物DNA，样品用量0.5 g。DNA提取后经过7 g·L−1琼脂糖凝胶电泳质检，不合格的样品进行重提。
使用引物组515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′) 和907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′) 从土壤基因组DNA中扩增细菌16S rRNA基因的V4~V5高可变区，使用引物组Arch344F (5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′) 和Arch915R (5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)从土壤基因组DNA中扩增古菌16S rRNA基因的 V3~V4高可变区[22]。引物由上海生工生物合成。对于正向引物(515F和Arch334F)，在其5′端添加barcode序列(6个碱基的随机序列)用以测序时区分不同样本，本研究中实际使用48个不同的barcode序列。PCR反应体系总体积25 μL，由2.5 μL Buffer，2.0 μL dNTPs，0.5×2 μL 引物，0.5 μL DNA模板，0.5 μL rTaq酶和18.5 μL ddH2O构成。PCR反应程序为：94 ℃ 预变性3 min， 94 ℃ 30 s、45 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s下进行5个循环，94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s进行20个循环，72 ℃ 5 min。PCR产物质检、文库构建和高通量测序均由广州美格生物科技有限公司完成，测序方案为Illumina Hiseq 2500双末端测序。
1.4 微生物群落特征和功能分析
细菌和古菌群落16sRNA高通量测序数据分析参考Callahan等[23]的方法进行。对原始数据 (Reads) 删除barcode和引物序列，剔除质检不合格的Reads，通过DADA模型推断实际序列变异数 (Actual sequence variants, ASV)。根据ASV进行物种注释。
在对所得ASV数据进行抽平处理后，使用vegan包进行土壤细菌和古菌群落α多样性分析，分析群落内分类群的数量和丰度。
对细菌和古菌丰度分别进行归一化处理后，应用在线LEfSe分析方法(https://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse)，基于LDA 得分默认值寻找RF和RM之间差异显著的细菌和古菌类群(Biomarker)。
为分析RF和RM土壤微生物群落结构的差异，我们使用igraph包[24]分别针对RF和RM土壤样本进行微生物共现网络的构建。绘制网络前先将土壤细菌和古菌群落丰度数据分别进行线性函数归一化处理，汇总后再次进行线性归一化处理，以此消除2种引物扩增速率差异。微生物网络的节点为ASV，节点之间的连线代表ASV之间显著的相关性。ASV相关性的计算基于FastSpar的SparCC方法[25]，保留连线的阈值为r>0.6，P<0.05。采用9999 Fruchterman-Reingold的布局方式在Gephi中实现网络可视化[26]。利用贪婪算法分析网络模块结构并计算各网络属性指标，根据优化得分对识别出的模块进行排序命名。使用ggClusterNet [27]包分别计算RM和RF网络中各节点的模块内连通性(Zi)、参与系数(Pi)。Zi得分大于2.50的ASV为模块中心点，而Pi得分大于0.62的ASV为模块连接点。模块中心点和连接点在微生物群落中均扮演着关键种(Keystone species)的作用[28]。
为了评估微生物网络的稳定性，使用ggClusterNet包对反映网络稳定性的脆弱性指数(Vulnerability)和鲁棒性指数(Robustness)进行计算[29]。脆弱性指数为微生物共现网络中各点脆弱值中的最大值，脆弱性指数越小，表示网络稳定性越高。鲁棒性指数指人为随机去除网络中50%物种条件下模拟网络物种灭绝后剩余物种数占原物种数比例，鲁棒性指数越大，表示网络稳定性越高。在网络鲁棒性测定时，分别使用了随机去除所有物种和随机去除靶向物种(针对关键种) 2种模拟方式。
使用FAPROTAX v.1.1算法[30]对相对丰度大于1%的ASV的元素循环相关功能进行预测。对RF、RM土壤微生物功能群分别进行相关性网络构建，并采用9999 Fruchterman-Reingold的布局方式在Gephi中实现网络可视化[26]。使用ggalluvial包对RF和RM微生物群落中碳氮相关功能的ASV在优势模块之间的流动进行可视化展示。
1.5 土壤理化性质的测定
采用重铬酸钾氧化−外加热法测定土壤有机碳含量[31]。采用硫酸−催化剂消解，凯式法测定土壤全氮质量[32]。分别采用双波长比色法[33]和靛酚蓝比色法[34]测定土壤硝态氮和铵态氮含量。采用碳酸氢钠法测定速效磷含量[34]。
1.6 统计分析
为分析RF与RM土壤微生物群落结构变化的主控环境因子，使用vegan包将土壤微生物群落结构与土壤理化性质进行典型关联分析(Canonical correlation analysis, CCA)。
采用单因素方差分析(SPSS V26.0)对RF和RM间土壤微生物多样性指数与土壤微生物各功能群相对丰度的差异进行显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 稻鱼共生系统和水稻单作系统土壤微生物群落组成和多样性
根据高通量测序结果，平均每份土壤样本细菌和古菌单向序列数分别为
36348 和47799 条，对正反向序列比对合并后平均片段长度分别为373、383 bp。去除重复序列及嵌合体后，使用DADA模型推断获得细菌和古菌的ASV数量分别为8495 和3433 个。其中，RF和RM共有的土壤细菌ASV数量为2196 个，分别占RF(总ASV数量5535 )和RM(总ASV数量5156 )的39.67%和42.59%；共有的土壤古菌ASV数量为831个，分别占RF(总ASV数量2123 )和RM(总ASV数量2141 )的39.14%和38.81%。经注释后，细菌划分为15个门、28个纲、50个目、77个科和153个属，古菌则为7个门、14个纲、16个目、17个科和17个属。
在门分类水平上，细菌群落中相对丰度较高的为变形菌门Proteobacteria (RF: 25.53%, RM: 27.82%)、绿弯菌门Chloroflexi (RF: 16.78%, RM: 14.38%)、酸杆菌门Acidobacteria (RF: 15.65%, RM: 17.61%)和拟杆菌门Bacteroidetes (RF: 14.11%, RM: 13.22%)(图2a)。古菌群落中相对丰度较高的为泉古菌门Crenarchaeota (RF: 34.16%, RM: 26.10%)、奇古菌门Thaumarchaeota (RF: 21.94%, RM: 33.27%)、佩斯古菌门Pacearchaeota (RF: 13.66%, RM: 14.67%)、广古菌门Euryarchaeota (RF: 11.71%, RM: 9.53%)和乌斯古菌门Woesearchaeota (RF: 8.84%, RM: 6.82%)(图2b)。虽然RF显著提高了稻田土壤中泉古菌门(P=0.008)与绿弯菌门(P=0.026)的相对丰度，但RF和RM土壤微生物群落优势菌门的种类并无显著差异。
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图 2 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤细菌(a、c)和古菌(b、d)群落组成Figure 2. Community compositions of soil bacteria (a, c) and archaea (b, d) in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)在属分类水平上，细菌群落中相对丰度较高的菌属为鲍特氏菌属Smithella (RF: 2.95%, RM: 3.74%)、伊格纳维菌属Ignavibacterium (RF: 1.97%, RM: 1.53%)和厌氧黏细菌菌属Anaeromyxobacter (RF: 1.54%, RM: 1.53%)(图2c)。古菌群落中仅有5个菌属被鉴定，为大洋球形菌属Caldisphaera(RF: 18.91%, RM: 12.30%)、甲烷杆菌属Methanobacterium(RF: 0.20%, RM: 0.18%)、甲烷粒菌属Methanolinea(RM: 0.001%)、甲烷螺菌属Methanomassiliicoccus(RF: 10.65%, RM: 8.02%)和热丝菌属Thermofilum(RF: 2.40%, RM: 2.01%)(图2d)。其中，大洋球形菌属和甲烷罗菌属占比最高，而甲烷粒菌属仅在RM中被检出。RF和RM土壤微生物群落优势菌属的种类并无显著差异。
LEfSe分析结果（图3）表明，RF土壤显著富集的细菌类群隶属3个菌门。其中，绿弯菌门中有5个类群：暖绳菌属Bellilinea、Leptolinea、厌氧绳菌属Anaerolinea、长绳菌属Longilinea和厌氧绳菌科Anaerolineaceae (科分类名，以下水平未注释)；变形菌门有4个类群：Rivicola、罗斯氏菌属Roseateles、脱氯菌属Dechloromonas和未分类(门分类以下水平未注释)；拟杆菌门有2个类群：Phaeodactylibacter和乳酸杆菌Lacibacter。而RM中显著富集的细菌类群共11个，主要分布于变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门。
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图 3 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤细菌和古菌群落LEfSe分析各名称前小写字母代表所能鉴别到的最小分类单元(p：门，c：纲，o：目，f：科，g：属)。Figure 3. LEfSe analysis of soil bacteria and archaea in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)The lowercase letters before each name represent the smallest identifiable taxonomic unit ( p: Phylum, c: Class, o: Order, f: Family, g: Genus).RF土壤显著富集的古菌类群分布在泉古菌门，为暖球形菌属Caldisphaera 和1个未知类群(门分类以下水平未注释)；而 RM中无显著富集的古菌类群。
RF和RM的土壤微生物群落α多样性存在显著差异(表1)。对于细菌群落而言，RF中3个物种丰富度指标(Richness、 Chao1、 ACE)分别比RM提高19.79% (P=0.003)、20.79%(P=0.004)和20.59%(P=0.003)，而Shannon多样性指标比RM增加3.19% (P=0.003)。对于古菌群落而言，RF中3个物种丰富度指标(Richness、 Chao1、 ACE)分别比RM提高7.56% (P<0.001)、9.21% (P=0.001)和8.63% (P=0.001)，2个多样性指标(Shannon和Simpson)分别比RM增加3.80% (P=0.001)和1.04% (P=0.009)。
表 1 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)的土壤微生物群落α多样性1)Table 1. Alpha diversity of soil microbial communities in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)界
Kingdom系统
SystemShannon Simpson Richness Chao1 ACE 细菌 Bacteria RF 5.83±0.05** 1.00±0.000 470.54±23.79** 486.73±26.32** 481.69±25.75)** RM 5.65±0.05 1.00±0.000 392.79±24.71 402.97±27.41 399.46±26.57 古菌 Archaea RF 4.37±0.09*** 0.97±0.004** 177.25±12.79*** 191.93±14.97*** 192.28±15.66*** RM 4.21±0.12 0.96±0.006 164.79±14.75 175.75±17.01 177.00±17.58 1)表中数据为平均值±标准误；“**” “***”分别表示处理间差异达到0.01和 0.001的显著水平（单因素方差分析）。
1) Data in the table is mean±standard error; “**” and “***” indicate the differences between treatments reach 0.01 and 0.001 significance levels, respectively(One-way ANOVA).2.2 稻鱼共生系统和水稻单作系统土壤微生物网络结构
为进一步了解RF和RM土壤微生物群落差异，构建基于相对丰度相关性的微生物网络(图4)并计算网络的拓扑性质(表2)。
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图 4 稻鱼共生系统(a)和水稻单作系统(b)的土壤微生物群落共现网络节点代表ASV，节点连接线代表节点之间相对丰度具有显著相关性(r>0.60, P<0.01，单因素方差分析)；模块排序基于其模块化得分。Figure 4. The co-occurrence network of soil microbial community in the rice-fish co-culture system (a) and rice monoculture system (b)Nodes represent ASVs and edges indicate significant correlations of relative abundance between nodes (r>0.60, P<0.01, One-way ANOVA); Modules were ranked based on their modularity score.表 2 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤微生物网络主要拓扑性质Table 2. Major topological properties of microbial networks in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)网络属性
Network propertyRF RM 节点数量 Number of nodes 475 480 连接数量 Number of edges 4590 3253 连接密度 Edges density 0.041 0.028 平均度 Average degree 19.326 13.555 平均路径长 Average path length 4.932 5.654 聚类系数 Clustering coefficient 0.419 0.409 模块数量 Number of modules 31 26 模块性 Modularity index 0.916 0.716 脆弱性 Vulnerability 0.009 0.011 鲁棒性(随机去除) Random robustness 0.414 0.434 鲁棒性(靶向去除) Targeted robustness 0.926 0.922 结果表明，RF和RM的微生物网络节点数量差异微小，分别包含475和480个节点。RF网络中表征物种共现性的连接数、平均度、连接密度以及平均聚类系数分别较RM提高41.1%、42.6%、46.4%和2.4%，而平均路径长下降12.7%，表明RF土壤微生物之间存在更多的共生关系。在模块化结构性方面，RF网络模块数量较RM增加19.2%，分别是31和26，其模块性指数较RM增加27.9%，分别为0.916和0.716(网络模块指数理论范围为−0.5~1.0，越接近1代表模块性越高)。综合以上网络拓扑性质，表明RF土壤微生物群落比RM具有更高的网络复杂性，模块内物种之间具有更强的相关性。
RF和RM微生物网络均具有明显的模块聚集效应，即少数优势模块包含了绝大部分的ASV，而大部分模块仅包含微量ASV (ASV总数小于10)。在RF网络中，模块1、2、3、4和5包含了90.32%的节点；而在RM网络中，模块1、2、3、4和6包含了90.46%的节点。进一步分析各ASV的拓扑结构属性，发现RF网络中模块中心点和连接点的ASV数量较RM分别增加60.0%和28.6%(图5)。
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图 5 稻鱼共生系统(a)和水稻单作系统(b)土壤微生物拓扑角色横线表示模块内连通性(Zi)为2.50，竖线表示参与系数(Pi)为0.62，图中点代表不同ASV。Figure 5. Topological roles of soil microbial communities in the rice-fish co-culture system (a) and rice monoculture system (b)The horizontal line indicates that the connectivity (Zi) within the module is 2.5, the vertical line indicates that the participation factor (Pi) is 0.62, and the dots represent different ASVs.在网络稳定性方面，RF脆弱性指数较RM降低18.0%，分别为0.009和0.011；在随机移除情况下，RF网络鲁棒性较RM降低6.2%(P=0.043)；而关键物种的去除对于RF和RM网络影响的差异相对微小(表2)。
2.3 稻鱼共生系统和水稻单作系统土壤微生物群落功能特征
功能预测分析发现，土壤微生物各功能群相对丰度在RF和RM之间无显著差异(P>0.05)，排序为硝化作用>甲烷产生作用>甲烷氧化作用>氮固定作用>反硝化作用(图6a)。功能群丰度相关性分析(图6b、6c)表明，甲烷产生和甲烷氧化在RF、RM中均呈现显著正相关关系(RF: r=0.40, P=0.042; RM: r=0.43, P=0.046)，甲烷产生和氮固定(RF: r=−0.40, P<0.001; RM: r=−0.46, P=0.030)、甲烷氧化和硝化(RF: r=−0.01, P=0.028; RM: r=−0.48, P=0.025)则均呈现显著负相关关系。RF中甲烷氧化和氮固定存在显著正相关关系(r=0.05, P=0.049)，但在RM中相关性并不显著(r=0.17, P>0.05)；与之相反，仅在RM中存在显著关系但在RF中相关性不显著的有：甲烷产生与硝化之间的负相关关系(RF: r=−0.52, P>0.05; RM: r=−0.66, P<0.001)，硝化与反硝化作用的正相关关系 (RF: r=0.38, P>0.05; RM: r=0.46, P=0.032)以及甲烷氧化和反硝化之间的负相关关系(RF: r=0.11, P=0.072; RM: r=−0.58, P=0.004)。
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图 6 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤功能微生物相对丰度(a)和相关性网络(b、c)图a中，不同箱型图上方，相同的小写字母表示差异不显著(P>0.05, 单因素方差分析)。Figure 6. Relative abundance (a) and correlation networks (b, c) of functional microbes in the soils of rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)In figure a, the same lowercase letters above the boxes indicate no significant difference (P>0.05, One-way ANOVA).RF和RM网络的优势模块中，功能微生物群落结构存在显著差异。其中，RF优势模块的甲烷产生(P<0.001)与反硝化(P=0.001)相关微生物丰度均显著高于RM。另一方面，不同功能在优势模块之间的分布也存在差异。RM优势模块中的功能较为分散，如硝化作用分散于模块1、2、3和6而反硝化作用同时存在于模块1和4，但是在RF网络中硝化和反硝化作用均集中于模块2中；氮固定作用在RM网络中分散于模块3和4，但是在RF网络则集中于模块1中(图7)。
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图 7 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤微生物网络优势模块相对丰度和功能分布RFT：RF网络优势模块的微生物功能组成；RMT：RM网络优势模块的微生物功能组成；柱间连线基于共有ASV绘制。Figure 7. Relative abundance and functional distribution of dominant modules in the microbial networks of the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)RFT: Functional composition of the dominant modules in the RF network; RMT: Functional composition of the dominant modules in the RM network; Belts connect the same ASVs among all columns.2.4 土壤微生物群落与土壤理化性质的关系
CCA结果表明，土壤理化性质对RF和RM土壤微生物群落结构的影响存在差异(图8)。土壤pH和总磷含量主要决定RF中ASV在轴1的分布，有效氮和总氮含量则为轴2分布的主要决定因素(图8a、8b)。RM中ASV沿轴1与轴2的分布则分别由土壤有效磷和总磷含量、有效氮和有效磷含量决定(图8d、8e)。相较于RM，土壤速效氮(R2=0.63, P=0.001)和速效磷含量(R2=0.39, P=0.007)均只影响RF中ASV的分布，总磷含量则对RF碳氮相关功能菌群也表现出显著影响(R2=0.56, P=0.002)，土壤有机碳的影响在RF中消失。
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图 8 稻鱼共生系统(RF)(a、b、c)和水稻单作系统(RM)(d、e、f)土壤微生物群落与土壤理化性质的典型关联分析图c和f展示了a、b、d和e中不同土壤理化性质对土壤微生物群落的影响；AN：土壤有效氮含量，AP：土壤有效磷含量，TN：土壤总氮含量，TP：土壤总磷含量，OC：土壤有机碳含量； “*”表示影响显著（P<0.05，CCA法）。Figure 8. Canonical correlation analysis of the relationship between soil microbial communities and soil physicochemical properties in the rice-fish co-culture system (RF)(a, b, c) and rice monoculture system (RM)(d, e, f)Figures c and f show the effects of soil properties on the soil microbial structures in a, b, d and e; AN: Available nitrogen content, AP: Available phosphorus content, TN: Total nitrogen content, TP: Total phosphorus content, OC: Organic carbon content; “*” indicates the effect is significant (P<0.05, CCA method).3. 讨论
3.1 稻鱼共生提高土壤微生物群落多样性
针对仁庄镇9个村落稻田土壤的16S rRNA扩增子分析表明，该地区水稻生长季中古菌优势菌门分别为泉古菌门、奇古菌门、佩斯古菌门、广古菌门和乌斯古菌门，而细菌优势菌门为变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和拟杆菌门。前人研究表明，变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、拟杆菌门是稻鱼综合种养模式中普遍存在的优势菌门[35-36]，具有代谢有机质、反硝化作用等土壤碳氮循环过程相关的重要作用[35, 37]。在属水平上，细菌群落中，稻鱼共生系统与水稻单作系统中优势菌属均为鲍特氏菌属、伊格纳维菌属和厌氧黏细菌菌属；古菌群落中则为大洋球形菌属、甲烷螺菌属和热丝菌属。与水稻单作系统相比，青田传统稻鱼共生系统并不会对这些菌门和菌属的优势地位产生影响，但是两系统中富集的微生物种类存在明显差异。稻鱼共生系统相较于水稻单作系统显著富集细菌群落中的绿弯菌门暖绳菌属、Leptolinea、厌氧绳菌属、长绳菌属和厌氧绳菌科，以及古菌群落中的泉古菌门暖球形菌属。厌氧绳菌属的分布已被证明受到铵态氮和溶解氧的影响，稻鱼共生系统中较高的铵态氮含量和氧气浓度可能是其富集存在的主要原因[38]。
此外，稻鱼共生系统能够显著提高细菌和古菌群落的α多样性水平。前人研究表明，稻鱼共生系统[13]与其他稻田综合种养模式，如稻鳖系统[39]、稻蟹系统[40]、稻虾系统[41]和稻蛙系统[42]，均能显著提高土壤微生物多样性水平。Chen等[43]认为，稻虾共生系统中更多的植物源营养物质(例如纤维素)是土壤微生物群落多样性增加的可能原因之一。肖力婷等[44]研究发现，中华鳖的觅食和翻耕等活动促进了土壤团聚体的形成，增强了土壤透气性，促进微生物生长繁殖，进而提高了微生物的多样性；养殖动物肠道微生物随排泄物进入稻田也影响着稻田土壤微生物群落多样性。此外，排泄物还能够降低稻田土壤碳氮比，从而影响稻田土壤微生物的群落结构。进一步对α多样性指标分析发现，在物种丰富度方面，稻鱼共生系统土壤古菌与细菌群落中无论是观察到的物种丰富度(Richness)还是基于估计得到的未被观察到的物种丰富度(Chao1、ACE)均较水稻单作系统显著提高。Shannon指数和Simpson指数都考虑了物种丰富度和均匀度这2个多样性维度，但是Shannon指数赋予了丰度较低物种更大的权重而Simpson指数则相反。稻鱼共生系统中古菌和细菌群落的Shannon指数均较水稻单作显著增加，但是仅有古菌群落的Simpson指数较水稻单作显著提高。由此可见，稻鱼共生系统可能主要通过增加低丰度微生物种类以提高土壤微生物α多样性。若将相对丰度在所有样本中均小于1%的ASV看作是稀有微生物[45]，稻鱼共生系统中共包含439个稀有ASV，占其ASV总量的38.57%，在数量和比例上均大于水稻单作系统(426个稀有ASV，占其ASV总量的36.57%)，支持了以上的猜测。
本研究中稻鱼共生系统和水稻单作系统土壤的各项理化指标在平均水平上没有显著差异。借助典型关联分析，我们发现土壤理化性质中除土壤总氮含量外，对于微生物群落结构的影响水平均在稻鱼共生系统和水稻单作系统间发生改变。土壤速效氮、速效磷和有机碳含量均未在稻鱼共生系统中碳氮相关功能菌群中表现出与水稻单作系统一致的显著影响，且土壤有机碳含量对于土壤微生物群落结构也不存在显著影响。在稻鱼共生系统中，人工投入的饵料中未经鱼类摄食和同化的部分，增加了稻田土壤的有机质和氮磷养分输入[35, 45-47]，为土壤微生物提供了额外能量和养分来源。另一方面，鱼类的活动能够促进土壤有机氮的分解释放，并提高磷元素的流动性和可利用性[48-49]。因此，土壤中的有机质、速效氮和速效磷或许不是稻鱼共生系统中土壤微生物群落的主要限制因素，进而促使土壤总磷含量和土壤pH成为稻鱼共生模式中土壤微生物群落结构的重要影响因素。
3.2 稻鱼共生系统改变土壤微生物互作关系
在特定的微生物群落装配条件下，各微生物通过相互作用维持土壤微生物的稳态，形成复杂的微生物共现网络[50-51]。在微生物网络中，网络边缘紧密度、网络直径和平均路径长是反映网络紧密度的重要指标，而网络平均聚类系数和模块化指数则主要反映了网络的复杂度[52]。刘平平[53]针对稻鱼共生模式表层土壤微生物群落网络研究表明，稻鱼共生能够增加土壤微生物网络节点数、模块化指数，降低平均聚类系数和平均连接性，从而改善网络稳定性。针对稻虾、稻蟹和稻鳝等共生系统的研究也被证明同样能够提高土壤微生物网络稳定性[54-57]。在本研究中，与水稻单作相比，稻鱼共生系统土壤微生物网络节点连接更为紧密，模块数量更多，模块性指数更高，且网络连接节点和模块中心点数量显著增加，表明稻鱼共生系统能够提高稻田土壤微生物间的相互联系[58]。鱼类活动提高了稻田土壤的同质性[59]，而环境同质性的提高或将导致微生物生态位共用程度的增加，从而促进微生物间的相互作用[60]。
本研究采用3个指标对网络稳定性进行评定。稻鱼共生系统降低了微生物网络脆弱性指数；而在鲁棒性指数方面，稻鱼共生系统虽然提高了靶向去除情况下的网络鲁棒性，但却显著降低了随机去除情况下的网络鲁棒性。因此，稻鱼共生系统对于土壤微生物网络稳定性的影响并不明确。
宏观生物学和微生物学研究都表明，资源和食物的可获得性是群落网络结构的重要驱动因素[58]。Zhou等[61]对高CO2水平下土壤微生物分子生态网络响应的研究也表明，微生物的网络结构变化与土壤碳氮含量显著相关。因此我们推测，稻鱼共生系统中可能由于鱼类游动摄食等活动以及饲料中氮、磷等营养元素投入的原因，土壤微生物代谢活动更为活跃，使得该系统中整体网络以及模块内部的相互作用更为紧密。
3.3 稻鱼共生系统改变土壤微生物功能
总体上而言，稻鱼共生系统土壤微生物的甲烷和氮相关功能群丰度与水稻单作系统并无显著差异，甲烷产生和硝化作用的功能微生物丰度显著高于其他功能群；甲烷和氮相关功能群内部均呈正相关关系，而甲烷和氮相关功能群之间呈负相关关系。
一方面，稻鱼共生系统维持了与水稻单作相同的甲烷产生−甲烷氧化的显著正相关关系，以及甲烷产生−氮固定和甲烷氧化−硝化的显著负相关关系。由于长期淹灌，稻田0~10 cm土层处于较为严重的厌氧状态，甲烷相关的生态功能中以甲烷产生为主导，而甲烷氧化微生物会随着甲烷产生量的增加而增加[62]，因此甲烷产生作用和甲烷氧化作用通常会表现出正相关关系。基于甲烷相关功能与氮相关功能之间的负相关关系，在稻田生态系统服务的管理目标上可以实现降低甲烷排放和改善水稻氮营养条件的双重目标。
另一方面，与水稻单作相比，稻鱼共生系统增强了甲烷氧化−氮固定的正相关关系，并减弱了甲烷产生−硝化、甲烷氧化−反硝化的负相关关系，以及硝化−反硝化的正相关关系。稻鱼共生系统中甲烷和氮素相关功能群关系的减弱，可能是由于鱼类的扰动和摄食作用导致了土壤中微生物可利用性碳氮比例的改变[61]，抑或是相关微生物对pH和氧化还原电位等其他理化性质变化的响应不同所导致的[12]。这种变化对于稻田生态系统多功能效应会产生怎样的影响，还有待进一步研究。
由以上两方面可知，稻鱼共生系统中甲烷和氮相关功能的相关性整体上呈现下降的趋势，这在网络模块分析中得到了印证。具体体现在稻鱼共生系统微生物网络优势模块之间的功能相对独立，即不同功能分布于不同的模块中；而水稻单作系统中各功能在模块间的分布相对均匀，即不同功能往往共同存在于多个模块中。
需要注意的是，FAPROTAX功能预测分析只涉及数据库中已有的分类群或基因[63-64]，这是该方法的局限性，因此本研究的发现仍有待进一步验证。
4. 结论
稻鱼共生系统对土壤微生物优势菌门和优势菌属的影响不显著，但是能够显著提高稻田土壤微生物群落α多样性；稻鱼共生系统促进土壤微生物间相互作用和网络优势模块功能多样化，但是对于群落网络稳定性的影响并不明确；与水稻单作相比，土壤总磷含量和土壤pH在稻鱼共生模式中对于土壤微生物群落结构的影响得到了增强。此外，相较于水稻单作模式，稻鱼共生系统增强了甲烷氧化和氮固定作用之间的正相关关系，减弱了硝化作用与甲烷产生和反硝化作用之间的相关性以及甲烷氧化与反硝化作用之间的相关性。但是，对于土壤微生物群落功能相关性的研究和功能预测结果还有待进一步的试验验证。
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图 1 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)研究区域示意图
RF和RM后面的数字代表取样田块的数量。
Figure 1. Map of the research area of rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)
The numbers following RF and RM represent the number of sampling fields.
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图 2 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤细菌(a、c)和古菌(b、d)群落组成
Figure 2. Community compositions of soil bacteria (a, c) and archaea (b, d) in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)
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图 3 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤细菌和古菌群落LEfSe分析
各名称前小写字母代表所能鉴别到的最小分类单元(p：门，c：纲，o：目，f：科，g：属)。
Figure 3. LEfSe analysis of soil bacteria and archaea in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)
The lowercase letters before each name represent the smallest identifiable taxonomic unit ( p: Phylum, c: Class, o: Order, f: Family, g: Genus).
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图 4 稻鱼共生系统(a)和水稻单作系统(b)的土壤微生物群落共现网络
节点代表ASV，节点连接线代表节点之间相对丰度具有显著相关性(r>0.60, P<0.01，单因素方差分析)；模块排序基于其模块化得分。
Figure 4. The co-occurrence network of soil microbial community in the rice-fish co-culture system (a) and rice monoculture system (b)
Nodes represent ASVs and edges indicate significant correlations of relative abundance between nodes (r>0.60, P<0.01, One-way ANOVA); Modules were ranked based on their modularity score.
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图 5 稻鱼共生系统(a)和水稻单作系统(b)土壤微生物拓扑角色
横线表示模块内连通性(Zi)为2.50，竖线表示参与系数(Pi)为0.62，图中点代表不同ASV。
Figure 5. Topological roles of soil microbial communities in the rice-fish co-culture system (a) and rice monoculture system (b)
The horizontal line indicates that the connectivity (Zi) within the module is 2.5, the vertical line indicates that the participation factor (Pi) is 0.62, and the dots represent different ASVs.
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图 6 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤功能微生物相对丰度(a)和相关性网络(b、c)
图a中，不同箱型图上方，相同的小写字母表示差异不显著(P>0.05, 单因素方差分析)。
Figure 6. Relative abundance (a) and correlation networks (b, c) of functional microbes in the soils of rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)
In figure a, the same lowercase letters above the boxes indicate no significant difference (P>0.05, One-way ANOVA).
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图 7 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤微生物网络优势模块相对丰度和功能分布
RFT：RF网络优势模块的微生物功能组成；RMT：RM网络优势模块的微生物功能组成；柱间连线基于共有ASV绘制。
Figure 7. Relative abundance and functional distribution of dominant modules in the microbial networks of the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)
RFT: Functional composition of the dominant modules in the RF network; RMT: Functional composition of the dominant modules in the RM network; Belts connect the same ASVs among all columns.
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图 8 稻鱼共生系统(RF)(a、b、c)和水稻单作系统(RM)(d、e、f)土壤微生物群落与土壤理化性质的典型关联分析
图c和f展示了a、b、d和e中不同土壤理化性质对土壤微生物群落的影响；AN：土壤有效氮含量，AP：土壤有效磷含量，TN：土壤总氮含量，TP：土壤总磷含量，OC：土壤有机碳含量； “*”表示影响显著（P<0.05，CCA法）。
Figure 8. Canonical correlation analysis of the relationship between soil microbial communities and soil physicochemical properties in the rice-fish co-culture system (RF)(a, b, c) and rice monoculture system (RM)(d, e, f)
Figures c and f show the effects of soil properties on the soil microbial structures in a, b, d and e; AN: Available nitrogen content, AP: Available phosphorus content, TN: Total nitrogen content, TP: Total phosphorus content, OC: Organic carbon content; “*” indicates the effect is significant (P<0.05, CCA method).
表 1 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)的土壤微生物群落α多样性1)
Table 1 Alpha diversity of soil microbial communities in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)
界
Kingdom系统
SystemShannon Simpson Richness Chao1 ACE 细菌 Bacteria RF 5.83±0.05** 1.00±0.000 470.54±23.79** 486.73±26.32** 481.69±25.75)** RM 5.65±0.05 1.00±0.000 392.79±24.71 402.97±27.41 399.46±26.57 古菌 Archaea RF 4.37±0.09*** 0.97±0.004** 177.25±12.79*** 191.93±14.97*** 192.28±15.66*** RM 4.21±0.12 0.96±0.006 164.79±14.75 175.75±17.01 177.00±17.58 1)表中数据为平均值±标准误；“**” “***”分别表示处理间差异达到0.01和 0.001的显著水平（单因素方差分析）。
1) Data in the table is mean±standard error; “**” and “***” indicate the differences between treatments reach 0.01 and 0.001 significance levels, respectively(One-way ANOVA).
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表 2 稻鱼共生系统(RF)和水稻单作系统(RM)土壤微生物网络主要拓扑性质
Table 2 Major topological properties of microbial networks in the rice-fish co-culture system (RF) and rice monoculture system (RM)
网络属性
Network propertyRF RM 节点数量 Number of nodes 475 480 连接数量 Number of edges 4590 3253 连接密度 Edges density 0.041 0.028 平均度 Average degree 19.326 13.555 平均路径长 Average path length 4.932 5.654 聚类系数 Clustering coefficient 0.419 0.409 模块数量 Number of modules 31 26 模块性 Modularity index 0.916 0.716 脆弱性 Vulnerability 0.009 0.011 鲁棒性(随机去除) Random robustness 0.414 0.434 鲁棒性(靶向去除) Targeted robustness 0.926 0.922
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期刊类型引用(1)
1. 田孟成，赖春燕，黄艺，任丽平. 不同共生鱼种对稻田作物产量土壤养分及酶活性的影响. 农业与技术. 2025(04): 26-30 . 
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