Research on rapid detection of Staphylococcus aureus by fluorescent biosensor based on DNAzyme
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摘要:目的
为解决传统方法检测金黄色葡萄球菌耗时长、操作复杂等问题，研发一种基于脱氧核酶(DNAzyme)的荧光生物传感器，实现金黄色葡萄球菌的快速检测。
方法将特异性DNAzyme和互补链Subatrate相结合制成荧光生物传感器，并对荧光生物传感器进行生物材料浓度和溶液pH优化，并对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、芽孢杆菌、无乳链球菌、变形杆菌等进行特异性检测；最后对牛奶样品进行基于DNAzyme的荧光生物传感器的试验验证。
结果基于DNAzyme的荧光生物传感器在pH为 6.8时，3 min内可以实现对金黄色葡萄球菌的检测，线性范围为1~1×107 cfu·mL−1，最低检测限为1 cfu·mL−1。
结论基于DNAzyme的荧光生物传感器解决了传统检测方法耗时长、操作复杂等问题，实现了对金黄色葡萄球菌的快速检测，具有重要的应用价值。
Abstract:ObjectiveTo solve the problems of time-consuming and complex operation in traditional methods of detecting Staphylococcus aureus, a fluorescent biosensor based on deoxyribonuclease (DNAzyme) was developed to achieve rapid detection of S. aureus.
MethodThe fluorescence biosensor was made by combining DNAzyme with specific complementary chain substrate, and optimized for the concentration of biomaterials and pH of solution. Then, the specific detection of five different bacteria such as S. aureus, Escherichia coli, Bacillus, Streptococcus agalactiae and Proteus was performed. Finally, the DNAzyme-based fluorescent biosensor was tested and verified on milk samples.
ResultThe fluorescent biosensor based on DNAzyme can detect S. aureus within 3 min at a pH of 6.8, with a linear range of 1−1×107 cfu·mL−1 and a minimum detection limit of 1 cfu·mL−1.
ConclusionThe fluorescent biosensor based on DNAzyme solves the problems of time-consuming and complex operation of traditional detection methods, and realizes the rapid detection of S. aureus in milk, which has significant practical value.
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Keywords:
- Staphylococcus aureus /
- DNAzyme /
- Molecular beacon /
- Fluorescence biosensor
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金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus是一种需氧或兼性厌氧、无孢子生殖的革兰阳性细菌，是临床中常见的人畜共患病原菌之一[1-3]。该菌广泛存在于土壤、水源及养殖环境中，在大多数健康动物体内也发现有该菌的分布[4-6]。金黄色葡萄球菌可以感染多种家畜(猪、牛、羊、鹿)，家禽(鸡、鸭、鹅)甚至人类[7]。金黄色葡萄球菌可以引起动物的败血症[8-9]、肺炎[10]、乳房炎[11]、子宫内膜炎[12-13]、腹泻[14]、化脓休克[15]等临床症状，甚至引起人类食物中毒，严重危害动物和人类健康。近年来，关于金黄色葡萄球菌引起疾病的报道越来越多，因此对该菌进行快速可靠的检测对金黄色葡萄球菌防控具有重要意义。
金黄色葡萄球菌传统检测方法主要依赖于细菌分离培养、涂片镜检、生化试验、动物感染试验和血清分型等方法，存在检测样品耗时长、操作复杂、需要专业人员操作[16-18]等问题。因此，研发一种操作简单、可以快速检测金黄色葡萄球菌的方法极为必要。荧光生物传感器是一种利用生物分子与荧光染料的相互作用来检测目标分子的技术[19-20]。它通过将特定的生物分子与荧光染料结合，当目标分子存在时，它们之间发生相互作用，导致荧光信号的变化[21-23]。该方法具有灵敏度高、选择性好、便于操作、响应快速等优点，非常适合金黄色葡萄球菌的即时检测[24]。
DNAzyme (脱氧核酶)对金黄色葡萄球菌有较高的特异性和稳定性，为金黄色葡萄球菌荧光生物传感器研发奠定较好的理论基础[25]。DNAzyme是一种单链DNA序列(ssDNA)，可折叠形成复杂的三级结构，可通过体外指数富集配体系统进化技术筛选出[26-27]。DNAzyme可催化多种反应，包括磷酸二酯骨架在核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸位点裂解[28-30]。
本研究利用特定的DNAzyme识别序列，将荧光染料FAM和猝灭剂BHQ3标记在DNA探针上。当金黄色葡萄球菌存在时，与DNAzyme的相互作用导致酶活性被激活，进而DNAzyme在特定识别位点上剪切DNA探针。剪切后的DNA探针使FAM重新暴露，荧光信号增强，光密度增加，通过酶标仪检测，实现金黄色葡萄球菌的快速检测。
1. 材料与方法
1.1 试验原理
试验中使用金黄色葡萄球菌特异性互补链SA-substrate与SA-DNAzyme 等体积等浓度混合，在室温条件下自发杂交构成荧光生物传感器。其中，SA-DNAzyme的5′端BHQ3为FAM的猝灭基团，当二者杂交后，BHQ3与FAM接触发生荧光猝灭，导致荧光信号下降，同时发生荧光共振能量转移(FRET)使其吸收波长发生偏移。双链混合溶液中加入金黄色葡萄球菌后，金黄色葡萄球菌与SA-substrate上rA位点进行特异性结合使双链结构断开，将含有FAM的SA-DNAzyme片段脱离重新暴露于溶液中，增加光密度。
1.2 材料和仪器
材料：不同pH的Tris-HCl缓冲液、肉汤、琼脂粉(源叶生物，上海)；金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、变形杆菌(北京携诚生物科技有限公司)；本试验使用的是超纯水(Millipore)，所使用的化学试剂均为分析级，无需进一步纯化；特异性互补链、DNAzyme均由生工生物有限公司(中国上海)合成提供，具体序列如表1。
表 1 试验DNA序列Table 1. DNA sequences in the experiments名称
Name核酸序列(5′→3′)
Nucleic acid sequence特异性互补链
SA-substrateCTAATGAGTACCTACTGTCTCTGGATGATCCTATGAACTGACQ/rA/FGACCTCACTACCAAG 脱氧核酶
SA-DNAzymeATGCCATCCTACCAACCACGAAGTACATTTCAAACTCATAACAATCCATCGGTTAGGTCCTGGTTGGAGCTCTGAACTCGAGACAGTAGGTACTCATTAG 仪器：TECAN Spark酶标仪(瑞士帝肯科技公司)、PB-10 pH计(赛多利斯科学仪器公司)、ST8R热电高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司)、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅(Panasonic)、震荡培养器(上海世平有限公司)、赛多利斯天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 DNAzyme链制备
将含有SA-substrate与SA-DNAzyme的离心管分别加入46.4、49.4 μL超纯水配制成浓度均为100 μmol·L−1的SA-substrate与SA-DNAzyme溶液，再对称放于冷冻高速离心机中，12 000 r·min−1离心5 min；使用漩涡震荡仪震荡3 min使溶液充分混匀；使用锡箔纸将配置的试剂完全包裹好后放入4 ℃冰箱中避光冷藏保存。
1.3.2 细菌溶液的制备
将金黄色葡萄球菌溶液进行纯化计数为4.03×107 cfu·mL−1，随后稀释、制备1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101 cfu·mL−1的金黄色葡萄球菌溶液。同理配制芽孢杆菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、变形杆菌溶液。
1.3.3 稳定性与猝灭对比测试
将浓度为3.15、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol·L−1 SA-substrate溶液各取20 μL，依次加入96孔细胞培养板中并放置在酶标仪中进行全光谱检测。取浓度为3.15、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol·L−1 SA-substrate溶液各10 μL，加入等浓度等体积的SA-DNAzyme溶液，用20 μL移液枪反复抽吸，以确保溶液充分混匀，在室温下放置30 min，再用酶标仪进行全光谱检测。
1.3.4 荧光生物传感器的优化
为了选取最适荧光生物传感器浓度，将3.15、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol·L−1 SA-substrate溶液与SA-DNAzyme溶液等浓度等体积混合，放震荡仪上震荡5 min使两者充分混匀后，在室温避光环境下静置5 min。从50.00 μmol·L−1组抽取70 μL均分为7份，随后依次加入10 μL的1×107、1×105、1×103、1×101、1×100 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌溶液，每次加入后均使用移液枪抽吸3次，使两者充分结合后加入96孔细胞培养板中，放入酶标仪检测其光密度图谱。浓度为3.15、6.25、12.50、25.00 μmol·L−1的4组也进行相同操作。
为了选取荧光生物传感器最适pH，将Tris-HCl缓冲液的pH设置为5.0、6.0、6.5、6.8、7.4、8.5，各自均使用25.00 μmol·L−1荧光生物传感器检测1×107 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌。
将1×101、1×103、1×105 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌溶液与25.00 μmol·L−1荧光生物传感器等体积结合1、2、3、4、5 min，并对其光密度进行检测。
1.3.5 选择性分析
将金黄色葡萄球菌检测中10 μL 1×107 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌溶液替换为10 μL 1×107 cfu·mL−1的芽孢杆菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、变形杆菌溶液后，重复金黄色葡萄球菌的检测方法。
1.3.6 稳定性分析
将3.15、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol·L−1的荧光生物传感器在室温下放置4 h，每隔0.5 h用酶标仪进行全光谱检测。
1.3.7 检测性能
为了评估荧光生物传感器的检测性能，在试验最优条件下分析金黄色葡萄球菌与光密度的关系，每个浓度重复测量3次。选取浓度为25.00 μmol·L−1的荧光生物传感器分别与1×100 ~ 1×107 cfu·mL−1的金黄色葡萄球菌溶液相结合，检测其光密度。
1.3.8 回收率试验
牛奶样本采自北京昌平三石奶牛场，用装有肝素锂的10 mL离心管采集奶牛的牛奶样本。样本在室温下用孔径为0.22 µm的滤膜过滤，保留滤液，用0.1 mmol·L−1 pH为6.8的Tris-HCl缓冲液稀释4倍。用荧光生物传感器分别对加入1×103~1×107 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌溶液后的牛奶样品进行回收率试验。
相对标准偏差 (RSD)、回收率的计算方法如下：
$$ \begin{split} {\mathrm{RSD}}= & 荧光生物传感器标准误差/荧光生物\\ & 传感器检测平均值 \times 100{\text{%}} ， \end{split} $$ (1) $$ \begin{split} 回收率=& 荧光生物传感器检测值/平板计数法\\ & 检测值 \times 100{\text{%}} 。 \end{split} $$ (2) 1.4 数据统计分析
每组试验均重复3次，数据以平均值±标准误表示，使用Excel 表格对数据进行整理分析，使用SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)、Duncan’s多重比较分析和配对t检验，使用GraphPad Prism 8.0.1和Oringin 2021软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 性能表征
图1对浓度分别为3.15 、6.25、12.50、25.00和50.00 μmol·L−1 的SA-substrate溶液，加入等浓度等体积的SA-DNAzyme溶液，测定加入SA-DNAzyme前后光密度变化，结果如图1所示。5组SA-substrate溶液的光密度均高于其加入SA-DNAzyme后的，验证了SA-substrate与SA-DNAzyme结合后，其3′端所含的FAM被SA-DNAzyme中5′端所含的BHQ3猝灭，导致光密度下降。
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图 1 不同浓度SA-substrate与SA-DNAzyme等浓度等体积结合前后的光密度变化“*”“****”分别表示在P<0.05和P<0.000 1水平差异显著(t检验)Figure 1. Optical density changes of different concentrations of SA-substrate before and after binding to the same concentration and volume of SA-DNAzyme“*” and “****” indicate significant differences at P<0.05 and P<0.0001 levels, respectively (t test)2.2 性能优化
生物材料浓度和溶液pH对荧光生物传感器的检测性能有直接影响。选取5种不同生物材料浓度(3.15、6.25 、12.50、25.00、50.00 μmol·L−1)加入相同体积金黄色葡萄球菌溶液，静置5 min后通过对比各组间光密度变化进行优化。图2是不同浓度生物敏感材料中分别加入1×100、1×101、1×103、1×105、1×107 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌溶液前后的光密度变化，随着加入的金黄色葡萄球菌数量增加，敏感材料的光密度也呈升高趋势，表明金黄色葡萄球菌切割生物敏感材料上的rA结合位点，使荧光基团FAM重新暴露。对比发现，25.00 μmol·L−1组的光密度相比于3.15、6.25、12.50 μmol·L−1组变化更大，虽然50.00 μmol·L−1组光密度相对变化率较高，但结合检测成本的因素，本试验选用25.00 μmol·L−1的生物敏感材料用于荧光生物传感器的制备。
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图 2 不同浓度生物敏感材料与金黄色葡萄球菌结合后光密度变化Figure 2. Optical density changes of different concentrations of biosensitive materials after combining with Staphylococcus aureusSA-DNAzyme的切割效率对缓冲液的pH变化较为敏感[31]，pH过低或过高都会影响其切割rA的速率。试验选取了pH分别为5.0、6.0、6.5、6.8、7.4、8.5的Tris-HCl缓冲溶液，观察生物敏感材料溶液在不同pH条件下与1×107 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌反应后在525 nm处的光密度变化。如图3所示，当pH为5.0~6.5时，光密度较小；pH为6.8时，光密度变化率最大；当pH处于7.4~8.5时，随着pH升高，光密度变化率降低。以上结果表明当pH为6.8时，金黄色葡萄球菌与生物敏感材料的反应速率最快。由于牛奶pH为6.5~6.8，因此本试验选取pH 6.8作为试验条件。
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图 3 溶液pH对荧光生物传感器相应信号的影响“*”“**”“****”分别表示在P<0.05、P<0.01和P<0.000 1水平差异显著(t检验)Figure 3. Effect of pH on the corresponding signal of fluorescent biosensor“*” “**” and “****” indicate significant differences at P<0.05、P<0.01 and P<0.0001 levels, respectively (t test)2.3 检测时间
检测时间是生物传感器的重要参数，图4显示了荧光生物传感器检测1×101、1×103、1×105 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌随着时间变化的光密度。在1~5 min内，光密度相对检测时间呈正比增加，由于3 min之前变化较为明显，因此最优检测时间选为3 min。
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图 4 荧光生物传感器检测细菌随时间变化的光密度相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)Figure 4. Optical density changes of bacteria detected by fluorescent biosensor over timeDifferent lowercase letters on columns of the same time indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)2.4 抗干扰性
牛奶中含有多种细菌(如芽孢杆菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、变形杆菌)，可能会干扰荧光生物传感器的光密度变化，进而影响检测性能。试验使用体积为10 μL、浓度为25.00 μmol·L−1的 SA-substrate和SA-DNAzyme的混合溶液，分别加入等体积、1×107 cfu·mL−1的金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、变形杆菌溶液，混合均匀放置5 min后，检测加入不同细菌后溶液在525 nm处的光密度变化，根据图5可发现，加入金黄色葡萄球菌组的光密度相比于空白对照组升高，而加入芽孢杆菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、变形杆菌组的光密度相比于空白对照组变化不大，表明SA-DNAzyme链上rA位点只能和金黄色葡萄球菌特异性结合，切割特异性互补链。因此荧光生物传感器具有良好的抗干扰性能。
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图 5 荧光生物传感器检测不同细菌后的光密度变化1：空白，2：大肠埃希菌，3：芽孢杆菌，4：金黄色葡萄球菌，5：无乳链球菌，6：变形杆菌；柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)Figure 5. Optical density changes after detection of different bacteria by fluorescent biosensors1: Blank, 2: Escherichia coli, 3: Bacillus, 4: Staphylococcus aureus, 5: Streptococcus agalactiae, 6: Proteus; Different lowercase letters on bars indicate significant differences among treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.5 稳定性
图6为室温状态下5种不同浓度的荧光生物传感器溶液4 h内在525 nm处的光密度变化。结果表明，荧光生物传感器的光密度在4 h内变化不明显，证明荧光生物传感器结构较为稳定，在室温下放置一段时间对其影响不大。
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图 6 不同浓度荧光生物传感器溶液随时间变化的光密度Figure 6. Optical density changes of different concentrations of fluorescence biosensor solutions over time2.6 线性关系
图7结果表明，溶液的光密度(y)与1×100~1×107 cfu·mL−1 (x)的荧光信号呈现良好的线性关系，线性方程为
$ y=0.049\;6 \lg x+0.592\;8 $ ，R2为0.994，最低检出限为1 cfu·mL−1。![]()
图 7 不同菌落数量金黄色葡萄球菌的光密度(A)及线性关系(B)图A中，柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)；菌落数量0~8分别代表0、1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107 cfu·mL−1Figure 7. Optical densities of different colony amounts of Staphylococcus aureus and their linear relationshipIn figure A, different lowercase letters on bars indicate significant differences among treatments (P<0.05, Duncan’s method); The colony amounts from zero to eight are 0, 1×100, 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106 and 1×107 cfu·mL−1, respectively2.7 回收率试验
采用该荧光生物传感器对1×103~1×107 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌加标的牛奶样品进行回收率试验，验证该方法的可行性。如表2所示，加标回收率为92.8%~103.8%，证明荧光生物传感器能够检测牛奶样品中金黄色葡萄球菌。
表 2 荧光生物传感器对含有金黄色葡萄球菌牛奶样品的回收率结果Table 2. Recovery rate results of the fluorescent biosensor to milk samples containing Staphylococcus aureus菌落数量/(cfu·mL−1) Colony amount 相对标准
偏差/%
RSD回收率/%
Recovery
rate真实
Actual平板计数法检测
Detected by counting method荧光生物传感器检测
Detected by fluorescent biosensors1×103 (0.973±0.052)×103 (0.903±0.069)×103 7.64 92.8 1×104 (1.024±0.059)×104 (1.059±0.046)×104 4.34 97.7 1×105 (1.046±0.049)×105 (1.083±0.061)×105 5.63 103.5 1×106 (0.997±0.073)×106 (1.032±0.059)×106 5.72 103.5 1×107 (1.037±0.055)×107 (1.076±0.057)×107 5.30 103.8 3. 讨论与结论
由于金黄色葡萄球菌诱发奶牛病变事例时有发生，因此建立一种简单、高效的检测金黄色葡萄球菌的方法具有重要意义。常规检测金黄色葡萄球菌的方法需要多种昂贵仪器和专业的操作人员，检测成本高、耗时长，无法满足养殖场快速、低成本的检测需求。荧光生物传感器对目标物有较高特异性以及良好稳定性，本研究利用SA-DNAzyme与金黄色葡萄球菌代谢物结合，切割特异性互补链SA-substrate上的rA位点，使得SA-substrate结构发生，进而导致BHQ3无法猝灭荧光基团FAM，通过光密度变化实现金黄色葡萄球菌的检测。
本研究建立的金黄色葡萄球菌检测方法的最适pH为6.8，最优检测时间为3 min，最低检测下限达到1 cfu·mL−1。Cui等[32]开发了一种量子点免疫荧光生物传感器检测金黄色葡萄球菌，检测限为1×103 cfu·mL−1。Chen等[33]设计了检测金黄色葡萄球菌的一种荧光检测传感器，检测下限为1.23 cfu·mL−1，检测范围为1~108 cfu·mL−1，所需检测时间约1.5 h。Ouyang等[31]基于介孔二氧化硅修饰的上转换纳米粒子(UCNPs-mSiO2)设计了一种新型荧光生物传感器，快速检测金黄色葡萄球菌，其低检测限达到25 cfu·mL−1，宽检测范围达到63~6.3×106 cfu·mL−1。本研究建立的金黄色葡萄球菌的检测下限均低于上述方法。为了评估该方法的准确性，对实际牛奶样品进行了金黄色葡萄球菌检测，其结果与平板计数法相差不大。平板法检测金黄色葡萄球菌准确性高，却需要专业人员在特定实验室操作，样品预处理耗时且成本昂贵，不适合快速检测。该方法的检测过程简单，不需大量复杂准备工作，且检测时无需在专业实验室使用体积庞大、价格昂贵的精密仪器，可全程在室温下操作，并对检测人员要求不高，待测样品也无需进行大量复杂预处理，将样品过滤后检测即可。
本研究所用荧光生物传感器在室温下检测样品时，若待测样品中存在金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌代谢产物与SA-DNAzyme结合，切割互补链SA-substrate上的rA位点，使荧光基团重新暴露，提高溶液光密度，对1~107 cfu·mL−1金黄色葡萄球菌有良好线性关系。加入其他菌溶液时，溶液的光密度变化不明显，说明荧光生物传感器对金黄色葡萄球菌有着良好特异性，结合操作方便简单、无需大量准备工作等优点，在金黄色葡萄球菌的快速检测方面有良好的应用前景。
综上所述，本研究建立的基于DNAzyme与特异性互补链检测金黄色葡萄球菌的方法有着灵敏度高、特异性强、选择性好、便于操作等优点，可以实时快速检测金黄色葡萄球菌。当pH为6.8时对1~107 cfu·mL−1的金黄色葡萄球菌具有良好的线性关系，最优检测时间为3 min，最低检测限为1 cfu·mL−1。本研究为快速检测金黄色葡萄球菌提供了新的思路和解决方案。
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图 1 不同浓度SA-substrate与SA-DNAzyme等浓度等体积结合前后的光密度变化
“*”“****”分别表示在P<0.05和P<0.000 1水平差异显著(t检验)
Figure 1. Optical density changes of different concentrations of SA-substrate before and after binding to the same concentration and volume of SA-DNAzyme
“*” and “****” indicate significant differences at P<0.05 and P<
0.0001 levels, respectively (t test)![]()
图 2 不同浓度生物敏感材料与金黄色葡萄球菌结合后光密度变化
Figure 2. Optical density changes of different concentrations of biosensitive materials after combining with Staphylococcus aureus
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图 3 溶液pH对荧光生物传感器相应信号的影响
“*”“**”“****”分别表示在P<0.05、P<0.01和P<0.000 1水平差异显著(t检验)
Figure 3. Effect of pH on the corresponding signal of fluorescent biosensor
“*” “**” and “****” indicate significant differences at P<0.05、P<0.01 and P<
0.0001 levels, respectively (t test)![]()
图 4 荧光生物传感器检测细菌随时间变化的光密度
相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)
Figure 4. Optical density changes of bacteria detected by fluorescent biosensor over time
Different lowercase letters on columns of the same time indicate significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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图 5 荧光生物传感器检测不同细菌后的光密度变化
1：空白，2：大肠埃希菌，3：芽孢杆菌，4：金黄色葡萄球菌，5：无乳链球菌，6：变形杆菌；柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)
Figure 5. Optical density changes after detection of different bacteria by fluorescent biosensors
1: Blank, 2: Escherichia coli, 3: Bacillus, 4: Staphylococcus aureus, 5: Streptococcus agalactiae, 6: Proteus; Different lowercase letters on bars indicate significant differences among treatments (P<0.05, Duncan’s method)
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图 6 不同浓度荧光生物传感器溶液随时间变化的光密度
Figure 6. Optical density changes of different concentrations of fluorescence biosensor solutions over time
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图 7 不同菌落数量金黄色葡萄球菌的光密度(A)及线性关系(B)
图A中，柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著 (P<0.05，Duncan’s 法)；菌落数量0~8分别代表0、1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107 cfu·mL−1
Figure 7. Optical densities of different colony amounts of Staphylococcus aureus and their linear relationship
In figure A, different lowercase letters on bars indicate significant differences among treatments (P<0.05, Duncan’s method); The colony amounts from zero to eight are 0, 1×100, 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106 and 1×107 cfu·mL−1, respectively
表 1 试验DNA序列
Table 1 DNA sequences in the experiments
名称
Name核酸序列(5′→3′)
Nucleic acid sequence特异性互补链
SA-substrateCTAATGAGTACCTACTGTCTCTGGATGATCCTATGAACTGACQ/rA/FGACCTCACTACCAAG 脱氧核酶
SA-DNAzymeATGCCATCCTACCAACCACGAAGTACATTTCAAACTCATAACAATCCATCGGTTAGGTCCTGGTTGGAGCTCTGAACTCGAGACAGTAGGTACTCATTAG 
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表 2 荧光生物传感器对含有金黄色葡萄球菌牛奶样品的回收率结果
Table 2 Recovery rate results of the fluorescent biosensor to milk samples containing Staphylococcus aureus
菌落数量/(cfu·mL−1) Colony amount 相对标准
偏差/%
RSD回收率/%
Recovery
rate真实
Actual平板计数法检测
Detected by counting method荧光生物传感器检测
Detected by fluorescent biosensors1×103 (0.973±0.052)×103 (0.903±0.069)×103 7.64 92.8 1×104 (1.024±0.059)×104 (1.059±0.046)×104 4.34 97.7 1×105 (1.046±0.049)×105 (1.083±0.061)×105 5.63 103.5 1×106 (0.997±0.073)×106 (1.032±0.059)×106 5.72 103.5 1×107 (1.037±0.055)×107 (1.076±0.057)×107 5.30 103.8
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