Study on the functions of the autophagy related gene ChAtg3 in Colletotrichum higginsianum
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摘要:目的
研究希金斯炭疽病菌Colletotrichum higginsianum中自噬相关基因ChAtg3的作用。
方法对ChAtg3进行序列、系统发育和表达模式分析，并观察C. higginsianum侵染拟南芥Arabidopsis thaliana后ChAtg3的表达变化。通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术，进行ChAtg3基因的敲除和回补。
结果拟南芥接种C. higginsianum 8 ~ 40 h内ChAtg3基因表达量显著上升。敲除ChAtg3基因后的突变体(ΔChAtg3)自噬过程受抑制，其黑色素含量、产孢量、附着胞形成率和致病力均显著下降；但与野生型相比，菌丝生长和孢子萌发率并无显著变化。而通过基因回补，突变体CΔChAtg3在生物学表型和致病性上得以恢复。
结论揭示了ChAtg3基因在希金斯炭疽病菌自噬过程、孢子产生和附着胞形成中的关键作用，是该病原菌致病力的关键调节因子。
Abstract:ObjectiveTo study the role of ChAtg3, an autophagy-related gene in Colletotrichum higginsianum.
MethodThe sequence, phylogeny and expression pattern of ChAtg3 were analyzed, and the expression changes of ChAtg3 were observed in Arabidopsis thaliana after infection with C. higginsianum. An Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system was employed to perform specific gene knockouts and their subsequent complementation.
ResultThe expression changes of ChAtg3 were observed after C. higginsianum infected A. thaliana for 8 to 40 h. The mutant ΔChAtg3, created through targeted ChAtg3 gene knockout, exhibited impaired autophagy, with markedly reduced melanin production, conidiation, appressorium formation, and pathogenic potential, although mycelial growth and conidial germination rate had no significant changes compared with wild type. Gene complementation in the CΔChAtg3 strain effectively reinstated its biological phenotype and pathogenicity.
ConclusionThe results reveal that ChAtg3 plays a key role in autophagy, conidiation, and appressorium formation of C. higginsianum, confirming it as a critical determinant of pathogenic capacity of C. higginsianum.
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Keywords:
- Colletotrichum higginsianum /
- Autophagy /
- ChAtg3 gene /
- Functional analysis of gene /
- Pathogenicity
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希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsianum，也称希金斯刺盘孢，是引起十字花科植物炭疽病的主要病原真菌，主要寄主包括芸薹属Brassica、萝卜属Raphanus植物以及模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana[1-2]等。这种半活体营养型真菌主要通过侵染十字花科植物的叶片从而影响蔬菜的外观和品质[3]。在侵染过程中，附着胞作为真菌的侵染结构，能突破寄主植物的表皮。随后，真菌通过初生营养菌丝和次生营养菌丝在植物体内定殖和扩散。寄主叶片初期症状为水渍状的褪绿病斑，随后病斑扩大并凹陷，变为极薄且易穿孔的灰白色病斑，最后病斑连成片，导致叶片干枯腐烂[4]。菜心B. parachinensis是华南地区重要的特色蔬菜，其产业对当地农业经济发展有重大影响[5]。由希金斯炭疽菌引起的菜心炭疽病是阻碍产业发展的重要因素[6]。因此，制定以该病菌为目标的防治措施，对于保障菜心产业的健康发展至关重要。
希金斯炭疽菌感染寄主植物时，分生孢子萌发形成附着胞、附着胞内部积累膨压以穿透寄主植物表皮及形成初生营养菌丝等过程所需的物质和能量主要来源于分生孢子内物质的降解[1]。 自噬(Autophagy)在降解过程中发挥着至关重要的作用。自噬是一种依赖溶酶体/液泡的、在真核生物细胞内高度保守的物质降解途径，对维持细胞内环境的稳定、促进生长发育及细胞分化具有重要意义[7-8]。自1987年发现首个自噬相关蛋白LC3(Atg8)以来，科学家已在多种生物中鉴定出43个参与自噬过程的蛋白[9-10]。近年来，植物病原真菌的自噬研究表明，自噬对于丝状真菌在饥饿和非饥饿条件下的生长及致病力均有重要影响[11]。例如，在稻瘟菌Magnaporthe oryzae中，自噬相关基因的缺失会阻断自噬过程，从而导致营养菌丝减少、孢子分化受损、产孢量下降，并抑制附着胞中央液泡中甘油的积累，进而影响附着胞膨压的产生，最终降低致病力[12-13]。其中Atg3蛋白作为自噬过程中泛素样结合系统的重要组分，其所具有的E2连接酶活性，可以通过酯交换作用与被Atg4蛋白剪切修饰以及被E1样泛素激活酶Atg7蛋白激活后的自噬核心蛋白Atg8相连接，从而介导Atg8蛋白在自噬小体膜上的锚定[14-15]。在禾谷镰刀菌Fusarium graminearum中，Atg3基因的缺失导致自噬过程受抑制，最终损害了突变体的营养生长、毒素合成与对水稻的致病力[16]。在禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌F. pseudograminearum中，Atg3基因的缺失均会导致营养生长、毒素合成及致病力的显著下降[17]。这些结果表明，Atg3在植物病原真菌的生长发育和对寄主植物的致病过程中起着关键作用。然而，目前鲜见希金斯炭疽菌中自噬相关基因Atg3的功能研究报告，其在该菌生长发育和致病过程中的潜在影响仍有待探索。
因此本研究基于希金斯炭疽菌的全基因组数据，参照酿酒酵母中Atg3蛋白的序列，通过NCBI的BLASTp比对工具在希金斯炭疽菌中找到了与其序列相似性高的蛋白ChAtg3。进一步，采用了根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation, ATMT)体系进行了ChAtg3基因的敲除和回补试验，以探究该基因在希金斯炭疽菌生长发育及致病过程中的具体作用。研究成果将为深入了解希金斯炭疽菌的致病机制，发现和利用其特异性分子靶标，研发有效的新型杀菌剂，以及构建十字花科植物炭疽病的防治策略提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 菌株、质粒及植物材料
希金斯炭疽菌C. higginsianum IMI349063国际标准菌株由华中农业大学植物科学技术学院黄俊斌教授惠赠，采用PDA培养基置于28 ℃条件下黑暗培养。大肠埃希菌Eschrichia coli DH5α购自生工生物工程股份有限公司，根癌农杆菌A. tumefaciens AGL1及酵母双杂菌株分别由华南农业大学植物保护学院邓懿祯教授和园艺学院陆旺金教授惠赠，华南农业大学植物保护学院真菌研究室留种保存。目的基因敲除载体为p821，大小为8 401 bp，抗性标记为卡那霉素(Kanamycin)和潮霉素(Hygromycin)；目的基因回补载体为pNeo3300，大小为9 369 bp，抗性标记为卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)，均由华南农业大学植物保护学院邓懿祯教授惠赠。质粒pGADT7、pGBKT7和p932(含GFP)由华南农业大学植物保护学院真菌研究室保存。依次用
$\varphi $ 为70%乙醇和次氯酸钠溶液对拟南芥A. thaliana Col-0种子进行消毒，再将种子均匀分布到MS培养基上22 ℃、光照16 h黑暗8 h育苗7 d，然后光照12 h黑暗12 h移栽培养约25 d。1.2 ChAtg3基因的鉴定与系统发育分析
在NCBI数据库及希金斯炭疽菌基因组数据库(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html)中进行基因相似序列比对，搜索与酿酒酵母ScAtg3相似的蛋白序列，得到ChAtg3蛋白，确定其基因大小、cDNA和氨基酸序列，并设计引物。分析ChAtg3蛋白与其相似蛋白序列之间的进化关系，以不同物种中Atg3蛋白氨基酸序列为对象采用MEGA X进行进化分析，使用Neighbor-Joining来构建系统发育树。
1.3 ChAtg3基因的表达模式分析
将保存的希金斯炭疽菌菌种置于150 mL PDB培养基中，在28 ℃、200 r·min−1的恒温摇床内摇菌7~9 d，用纱布过滤得到孢子悬浮液，并离心将孢子富集，然后用ddH2O进行重悬，最后在显微镜下用血球计数板统计孢子数，并用ddH2O调节孢子悬浮液至1×106 mL−1。随后将孢子悬浮液喷雾接种于25日龄、生长状况相似的拟南芥叶片上，置于28 ℃培养箱内保湿培养。培养条件为28 ℃、光照12 h黑暗12 h。分别于接种后的0、8、22、40、60和72 h收集拟南芥叶片。每个时间段均采集3株拟南芥的叶片作为重复。使用Takara RNAiso Plus*试剂盒提取上述样品的RNA，再使用YEASEN反转录试剂盒Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得cDNA。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用全式金PerfectStartTM Green qPCR SuperMix。以希金斯炭疽菌的actin基因作为内参基因，相对表达量采用2−ΔΔCt法计算，qRT-PCR所需引物见表1。
表 1 本研究中使用的PCR引物Table 1. Primers used in this study引物名称 Primer name 引物序列(5′→3′) Primer sequence Actin-F CCCCAAGTCCAACAGAGAGA Actin-R CATCAGGTAGTCGGTCAAGTCA qAtg3-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA qAtg3-R TTATACCCCCATCGTGAAATCGT ADAtg3-F ggaggccagtgaattcATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGAAC ADAtg3-R cgagctcgatggatccTTATACCCCCATCGTGAAATCGTG ADAtg8-F ggaggccagtgaattcCCGTCGCCGCATTCG ADAtg8-R cgagctcgatggatccCCGTCCTCGTCCTTGTGC BDAtg3-F catggaggccgaattcATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGAAC BDAtg3-R gccgctgcaggtcgacgTTATACCCCCATCGTGAAATCGTG BDAtg8-F catggaggccgaattcCCGTCGCCGCATTCG BDAtg8-R gccgctgcaggtcgacgCCGTCCTCGTCCTTGTGC Atg3up-F acgacggccagtgccaagcttGACTCTGCTGAAAGTTCCCTAAAGG Atg3up-R tgccgaccggaaccagtcgacTCGCGAAGACGTCCAAGATT Atg3ds-F gactctagaactagtggatccCGACGATTGTTTTTTCCCCTG Atg3ds-R tatggagaaactcgagaattcCTTTAGATTGGAAGGGTCTCGC Hyg-F CTATTTCTTTGCCCTCGGACG Hyg-R ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG Atg3ko-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA Atg3ko -R TTATACCCCCATCGTGAAATCGT pAtg3-F CTCGCAGAAGATACACTCAACGAG pAtg3-R GCGGGGTTGTCTCACGATT Atg3F1-F acgacggccagtgccaagcttGCGAGCCATTTCCTGATATATATAGC Atg3R1-R gaagattcatGGTTGGTCGCGAAGACGTC Atg3F2-F gcgaccaaccATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA Atg3R2-R ttgctcaccatTACCCCCATCGTGAAATCGT Atg3F3-F atgggggtaATGGTGAGCAAGGGCGAGG Atg3R3-R tcgtcgtTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC Atg3F4-F gctgtacaagtaaACGACGATTGTTTTTTCCCCT Atg3R4-R gccgccaccgcggtggagctcTTAGATTGGAAGGGTCTCGCAC Atg3HB-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTG Atg3HB-R TACCCCCATCGTGAAATCGTG GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCG GFP-R CTTGTACAGCTCGTCCATGC NeoR-F TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC NeoR-R ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG 1.4 ChAtg3与ChAtg8的酵母双杂试验
参照杨滢滢[18]的方法，利用同源重组的方法分别将ChAtg3与ChAtg8基因的cDNA序列连接至质粒pGADT7与pGBKT7质粒上，以此构建AD-Atg3、AD-Atg8、BD-Atg3与BD-Atg8质粒。随后分别将质粒组合AD-Atg3与BD-Atg8、AD-Atg8与BD-Atg3转入酵母感受态细胞，并涂布于SD/Trp-Leu-平板上。在菌落长出后，将同时含有AD和BD重组质粒的酵母涂布在SD/Trp-Leu-His-Ade−且带AbA+抗性筛选的平板上，观察酵母菌落的生长情况。如果有酵母菌落长出，使用移液枪向酵母菌落上面滴加X-α-gal溶液，然后静置观察酵母菌落颜色的变化并拍照记录。如果酵母菌落变蓝，则说明蛋白之间存在互作关系，激活了酵母中HIS3、ADE2、MEL1和AbAr 4个报告基因的表达，否则不互作。
1.5 ChAtg3基因的敲除与验证
在NCBI上查找并下载ChAtg3基因上、下游各1 000 bp序列，使用SnapGene设计引物，在上、下游PCR引物的5′端引入载体的末端序列用于扩增带有载体同源臂的上、下游片段，以希金斯炭疽菌基因组DNA为模板克隆所需基因片段。利用限制性内切酶Hind III、和Sal I对质粒p821进行双酶切，将ChAtg3基因上游臂连接进p821后得到改造质粒p821-Atg3-up。然后再次利用限制性内切酶BamH I和EcoR I对改造质粒p821-Atg3-up进行双酶切，利用重组酶将目的基因下游臂连接进改造质粒p821-Atg3-up得到敲除质粒p821-Atg3-ko。随后参考祝一鸣[1]的方法，通过ATMT将敲除质粒转入希金斯炭疽菌野生型菌株中，利用含有50 μg·mL−1潮霉素的PDA平板对所获得的转化子进行抗性筛选。
对于通过抗性筛选的敲除候选转化子，提取其DNA进行PCR与Southern blot验证。其中，潮霉素基因验证引物Hyg-F/R，可以在ChAtg3基因的敲除突变体基因组DNA中扩增到1条大小为1 026 bp的条带，而以野生型为模板没有扩增到相应条带。引物Atg3ko-F/R在ChAtg3基因的敲除突变体基因组DNA中不能扩增出条带，在野生型菌株中可以扩增得到1条大小为1 044 bp的条带。而以引物pAtg3-F/R所扩增出的探针，通过Southern blot可以在ChAtg3基因的敲除突变体基因组DNA中杂交到1条大小为3 772 bp的条带，在野生型菌株中则是杂交出1条大小为2 429 bp的条带。
1.6 ChAtg3基因的回补与验证
以希金斯炭疽菌野生型菌株基因组DNA为模板，分别设计引物克隆出ChAtg3基因上游1 500 bp序列作为内源启动子序列、下游1 000 bp序列作为终止子序列；以希金斯炭疽菌野生型菌株cDNA为模板克隆出ChAtg3基因的cDNA序列；以质粒p932为模板，克隆出绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的基因序列。使用限制性内切酶Sac I和Hind III对质粒pNeo3300进行双酶切，然后利用同源重组将启动子、目的基因、绿色荧光蛋白和终止子序列重组得到回补质粒pNeo3300-Atg3HB。而后将回补质粒利用ATMT技术转入ChAtg3基因的敲除突变体中，获得回补菌株的候选转化子，利用含有100 μg·mL−1 G418的PDA平板对转化子进行抗性筛选。
对于通过抗性筛选的回补候选转化子，提取其DNA进行PCR验证，其中，引物Atg3HB-F/R在野生型菌株与回补菌株的基因组DNA中均可扩增到到1条大小为1 044 bp的条带，而敲除突变体由于目的基因被潮霉素替换不能扩增得到条带。引物GFP-F/R与NeoR-F/R分别可以在回补菌株的基因组DNA中扩增得到大小为717 和795 bp的条带，在野生型菌株与敲除菌株的基因组DNA中则无法扩增出条带。
1.7 ChAtg3基因敲除与回补突变体的生物学性状观察与测量
使用直径为6 mm的灭菌打孔器在希金斯炭疽菌野生型、ChAtg3基因敲除突变体及回补突变体的菌落边缘打取菌块接种于PDA平板中央，每个菌株重复3次，于28 ℃培养箱内黑暗培养7 d，观察菌落形态，并拍照记录。同时将相应菌株的菌饼接入铺有无菌玻璃纸的PDA平板中央，每个菌株重复3次，于28 ℃培养箱内黑暗培养7 d，撕下玻璃纸使用分析天平进行称量并记录。
同上将相应菌株的菌饼接入分别含有5 mmol·L−1 H2O2溶液、
$\varphi $ 为0.01%的SDS溶液、200 μg·mL −1刚果红(Congo red，CR)溶液和200 μg·mL−1荧光增白剂(Calcoflour white，CFW)溶液的PDA平板中央，每个菌株重复3次，于28 ℃培养箱内黑暗培养7 d，最后以未经处理的PDA平板上的各菌落生长状况为对照，使用十字交叉法测量各菌株菌落直径，并计算其抑制率。将各个菌株的菌饼置于PDB培养基中，在28 ℃、200 r·min−1的摇床内黑暗培养7 d，用纱布过滤得到孢子悬浮液，然后使用血球计数板在光学显微镜下统计孢子数，每个菌株重复3次。得到各菌株的孢子悬浮液后，使用无菌水将各菌株孢子悬浮液统一调节至1×105 mL−1，依次吸取20 µL孢子悬浮液滴加到疏水载玻片上，再将疏水载玻片置于铺有浸湿滤纸片的培养皿内，28 ℃光照条件下保湿培养16 h，盖上盖玻片用光学显微镜拍照并记录孢子萌发形态。此外，于培养24 h后统计附着胞形成率，每个菌株统计随机统计100个孢子，重复3次。
1.8 ChAtg3基因敲除与回补突变体的致病力分析
制备各菌株1×106 mL−1的孢子悬浮液，随后对生长状况相似的25日龄的拟南芥进行喷雾接种，均匀喷洒于拟南芥叶片的正面和背面，每个菌株重复3次，然后置于28 ℃培养箱内保湿培养5 d，培养条件为28 ℃、光照12 h黑暗12 h。接种5 d后，对发病植株进行拍照，随后剪下各处理所有叶片，按照以下病级分级标准对发病拟南芥叶片的发病程度进行分级：0级，叶片未感病；1级，发病面积未超过叶片面积的1/3；2级，发病面积占叶片面积的1/3 ~ 2/3；3级，发病面积超过叶片面积的2/3。最后按照式(1)计算病情指数。
$$ \begin{split} 病情指数 = &[\displaystyle\sum (病级叶片数 \times 病级数值)/(叶片总数\times\\[-3pt] & 发病最高级的代表数值)] \times 100。 \end{split} $$ (1) 1.9 拟南芥叶片的离体接种及台盼蓝染色
制备各菌株1×106 mL−1的孢子悬浮液，在拟南芥叶片的背面叶脉两侧滴加5 µL孢子悬浮液和5 µL ddH2O，每个菌株重复3次，然后将拟南芥叶片的叶柄插入
$\varphi $ 为1%的WA培养基，于28 ℃培养箱内黑暗保湿培养4 d。随后按照乙醇∶三氯甲烷∶乙酸=6∶3∶1的体积比配制Farmer’s试剂，将接种4 d后的离体拟南芥叶使用Farmer’s溶液浸泡30 s，再使用$\varphi $ 为0.05%的台盼蓝溶液对病斑染色(溶剂为PBS缓冲液)，22 ℃黑暗孵育12 h，然后取出叶片，浸泡在含有无水乙醇的玻璃皿中，使用脱色摇床60 r·min−1进行脱色，期间每3~4 h更换1次无水乙醇，直到叶片变得透明，脱色成功后对叶片进行拍照记录。1.10 数据处理
本试验数据分析所使用的软件为GraphPad Prism version 8.0.2，图表类型选择柱状图，导入数据后通过单因素方差分析(One-way ANOVA)得出最终的差异显著性结果。
2. 结果与分析
2.1 ChAtg3的基因序列分析及系统发育树
ChAtg3基因全长1 170 bp，CDS区1 044 bp，位于7号染色体，在基因组中的位置为NW_017263917.1 (798 235，
$\cdots $ ，799 404)，内部有3个外显子和2个内含子，编码347个氨基酸。为了分析希金斯炭疽菌自噬相关蛋白ChAtg3与其相似蛋白序列之间的进化关系，我们以希金斯炭疽菌与其他物种中的Atg3蛋白氨基酸序列为对象，进行系统进化分析。结果(图1)表明，Atg3蛋白在丝状真菌中的序列相似性均较高，尤其在炭疽菌属中的序列相似性非常高。说明希金斯炭疽菌的ChAtg3蛋白与丝状真菌中相应的同源蛋白之间进化关系较近，而与酵母、拟南芥等的同源蛋白在进化上存在明显的距离。![]()
图 1 希金斯炭疽菌ChAtg3蛋白的系统进化分析Figure 1. Phylogenetic analysis of the ChAtg3 protein of Colletotrichum higginsianum2.2 ChAtg3的表达模式与互作分析
为探索希金斯炭疽菌在侵染寄主过程中ChAtg3基因的表达情况，我们制备了希金斯炭疽菌野生型菌株的孢子悬浮液对拟南芥进行喷雾接种，并分别于接种后0、8、22、40和60 h取样，提取样品RNA并反转录为cDNA，利用qRT-PCR检测ChAtg3基因的表达情况。结果(图2A)表明，ChAtg3基因在接种后的0~22 h内均上调表达，且于22 h达到最大值，之后表达量逐步下降，说明ChAtg3基因可能在希金斯炭疽菌的孢子萌发、附着胞形成乃至整个活体营养阶段发挥关键作用。
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图 2 希金斯炭疽菌ChAtg3基因的表达模式与互作分析柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。Figure 2. Expression pattern and interaction analysis of the ChAtg3 gene of Colletotrichum higginsianumDifferent lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).由于Atg8与PE的结合需要泛素蛋白E2连接酶Atg3的激活，所以Atg8与Atg3之间存在相互作用。为了检验在希金斯炭疽菌中Atg3与Atg8是否相互作用，我们对ChAtg3蛋白和ChAtg8蛋白进行了酵母双杂交试验。试验结果(图2B)表明，ChAtg3在酵母中能与ChAtg8相互作用。
2.3 ChAtg3基因敲除与回补菌株的构建与验证
为了分析ChAtg3基因在希金斯炭疽菌中的生物学功能，我们通过ATMT技术将ChAtg3基因的敲除质粒p821-Atg3-ko转入了希金斯炭疽菌的野生型菌株。随后通过潮霉素抗性筛选与PCR验证，获得了ΔChAtg3-1、ΔChAtg3-5、ΔChAtg3-11、ΔChAtg3-13和ΔChAtg3-15菌株作为ChAtg3基因的敲除候选转化子(图3A、3B)。而后从中挑选出ΔChAtg3-13菌株进行Southern blot验证，结果(图3C)显示ChAtg3基因敲除成功，且ChAtg3基因在希金斯炭疽菌基因组中为单拷贝。
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图 3 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除与回补菌株的验证M：DNA 2000 Marker ；A、B中1为阴性对照，2~7分别为野生型菌株、ΔChAtg3-1、ΔChAtg3-5、ΔChAtg3-11、ΔChAtg3-13和ΔChAtg3-15；C中1为野生型菌株，2为ΔChAtg3-13；D、E、F中1为阴性对照，2~7分别为野生型、敲除质粒p821-Atg3-ko、CΔChAtg3-1、CΔChAtg3-2、CΔChAtg3-3。Figure 3. Validation of ChAtg3 knockout and complementary strains of Colletotrichum higginsianumM: DNA 2000 Marker; In figure A and B, 1: Negative control, 2−7: Wild type, ΔChAtg3-1, ΔChAtg3-5, ΔChAtg3-11, ΔChAtg3-13, ΔChAtg3-15; In figure C, 1: Wild type, 2: ΔChAtg3-13; In figure D, E and F, 1: Negative control, 2−7: Wild type, plasmid p821-Atg3-ko, CΔChAtg3-1, CΔChAtg3-2, CΔChAtg3-3.随后，我们又将ChAtg3基因的回补质粒pNeo3300-Atg3HB同样通过ATMT技术转入ChAtg3基因的敲除突变体ΔChAtg3-13菌株中。通过G418抗性筛选获得候选转化子，再利用PCR进行验证，最终获得ChAtg3基因的回补菌株CΔChAtg3-1、CΔChAtg3-2与CΔChAtg3-3(图3D、3E、3F)。
2.4 ChAtg3基因对希金斯炭疽菌的自噬与菌落形态的影响
为了研究ChAtg3基因的缺失是否会影响希金斯炭疽菌的自噬，我们将希金斯炭疽菌野生型菌株及ChAtg3基因敲除突变体ΔChAtg3-13的菌丝球置于含有2 mmol·L−1 PMSF溶液的MM-N液体培养基内饥饿诱导4 h后，使用透射电镜观察菌丝体内的细胞自噬过程，结果(图4A)发现，在氮饥饿诱导后，野生型菌株液泡腔中累积了大量的自噬小体，而ΔChAtg3-13菌株的液泡腔中未发现自噬小体的积累。这表明ChAtg3敲除突变体中自噬途径被阻断。
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图 4 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除突变体的透射电镜观察、菌落形态和生物量柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。Figure 4. Transmission electron microscopy observation, colony morphology and biomass of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianumDifferent lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).随后，我们分析了ChAtg3基因对希金斯炭疽菌菌落形态的影响。结果(图4B)显示，在培养7 d后，相较于野生型菌株，敲除突变体ΔChAtg3-13菌株的菌落黑化能力明显减弱；进行回补后，相较于ΔChAtg3-13，CΔChAtg3-2菌株黑化能力得到了一定程度的恢复。而在菌落生物量方面，结果(图4C)显示敲除ChAtg3基因后，突变体的生物量相较于野生型和回补菌株并无明显变化。以上结果表明ChAtg3会对希金斯炭疽菌菌落的黑化产生一定的影响，但并不影响菌丝的营养生长。
2.5 ChAtg3基因对希金斯炭疽菌抗逆性的影响
为了测定ChAtg3基因敲除是否会对希金斯炭疽菌丝的抗逆性造成影响，我们将希金斯炭疽菌野生型、ΔChAtg3-13与CΔChAtg3-2菌株分别接入含有5 mmol·L−1 H2O2溶液、
$\varphi $ 为0.01% SDS溶液、200 μg·mL−1 CR溶液和200 μg·mL−1CFW溶液的PDA平板中央，于28 ℃培养箱内黑暗培养7 d后通过测量菌落直径计算相对抑制率。结果(图5A)显示，在相同的培养条件下野生型、ΔChAtg3-13与CΔChAtg3-2菌株在含有5 mmol·L−1 H2O2溶液、$\varphi $ 为0.01%SDS溶液、200 μg·mL−1 CR溶液和200 μg·mL−1 CFW溶液的PDA培养基上的生长受到了不同程度的抑制；但ΔChAtg3-13、CΔChAtg3-2与野生型相比受到的抑制并无显著差异(图5B)，这表明ChAtg3基因的缺失并未影响希金斯炭疽菌的抗逆性。![]()
图 5 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除突变体的抗逆性测定柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05，LSD法)。Figure 5. Resistance determination of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianumDifferent lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).2.6 ChAtg3基因对希金斯炭疽菌产孢以及孢子萌发的影响
为了探究ChAtg3基因的敲除是否会影响希金斯炭疽菌的孢子萌发及产孢情况，我们分析了希金斯炭疽菌野生型、ΔChAtg3-13与CΔChAtg3-2菌株的产孢量。结果(图6A)显示，在相同的培养条件下ΔChAtg3-13的产孢量显著低于野生型菌株的，进行回补后CΔChAtg3-2菌株的产孢量得到了恢复，说明ChAtg3基因对希金斯炭疽菌的产孢量具有一定程度的影响。而在孢子萌发方面，ΔChAtg3-13菌株的附着胞相较于野生型菌株丧失了黑化的能力(图6B)，并且其附着胞形成率也显著降低(图6C)。而在回补后，这些表型得到了恢复。上述结果表明ChAtg3基因能够影响希金斯炭疽菌附着胞的形成。
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图 6 希金斯炭疽菌ChAtg3基因敲除突变体的产孢量、附着胞形成率与附着胞形态分析柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。Figure 6. Analysis of conidia production, appressorium formation rate and appressorium morphology of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianumDifferent lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).2.7 ChAtg3基因对希金斯炭疽菌致病力的影响
为了探究ChAtg3基因的敲除是否会影响希金斯炭疽菌的致病力，我们首先将希金斯炭疽菌野生型、ΔChAtg3-13与CΔChAtg3-2菌株在拟南芥上进行了接种。结果(图7A)显示，接种野生型菌株孢子悬浮液的拟南芥可以正常发病，发病初期拟南芥叶片上出现水渍状病斑，后期病斑扩大，中央灰白，而敲除突变体ΔChAtg3-13菌株的孢子悬浮液几乎不能使拟南芥发病，仅有个别叶片上出现水渍状病斑；进行回补后CΔChAtg3-2菌株的孢子悬浮液能使拟南芥正常发病，发病情况与野生型相似。随后我们对接种后的拟南芥进行了病情分级，结果(图7B)同样显示接种ΔChAtg3-13菌株的拟南芥病情指数显著低于野生型和CΔChAtg3-2菌株的。同时我们也对拟南芥叶片进行了离体接种，结果(图7C)显示，接种野生型和CΔChAtg3-2菌株孢子悬浮液的拟南芥叶片均产生了圆形的水渍状病斑，而接种ΔChAtg3-13菌株孢子悬浮液的拟南芥叶片上几乎没有病斑产生。使用台盼蓝染液对病斑染色再对叶片进行脱色后，我们发现接种ΔChAtg3-13菌株的叶片上没有出现蓝色病斑，而接种回补突变体CΔChAtg3-2菌株的叶片上呈现出与野生型菌株相似的圆形蓝色病斑(图7D)。以上结果说明ChAtg3基因参与调控希金斯炭疽菌的致病力。
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图 7 希金斯炭疽菌ChAtg3基因敲除突变体的致病力分析柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。Figure 7. Analysis of pathogenicity of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianumDifferent lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).3. 讨论与结论
自噬是真核生物细胞器和蛋白质降解的主要途径之一，从酵母到人类细胞内的自噬都具有高度的保守性[19]。细胞外应激条件(如营养物质缺乏、高温和病原体感染)和细胞内应激条件(如细胞器过剩或受损、激素和生长因素)都会强烈诱导自噬发生[20]。同时在植物病原真菌中，诸多的研究结果表明自噬是真菌维持自身生长发育及致病能力的关键[19]。因此，在许多生物体中Atg3与Atg8存在直接的互作关系，例如在苹果Malus domestica中，相关的酵母双杂试验结果表明MdAtg3s蛋白和MdAtg8i蛋白存在相互作用[21]。在本研究中，我们在希金斯炭疽菌中鉴定了1个酿酒酵母Atg3蛋白的同源蛋白ChAtg3，同时通过酵母双杂试验发现ChAtg3蛋白与ChAtg8蛋白同样存在互作，并且该蛋白的缺失会显著抑制希金斯炭疽菌的自噬发生，这表明ChAtg3蛋白在希金斯炭疽菌中参与了自噬过程。而基于ChAtg3在希金斯炭疽菌自噬过程中的重要作用，探究ChAtg3在希金斯炭疽菌中的生物学功能，对希金斯炭疽菌中自噬功能的解析具有重要的意义。
为了研究ChAtg3基因对希金斯炭疽菌生长发育以及致病力的影响，我们利用ATMT技术构建了ChAtg3基因的敲除与回补菌株。通过分析发现，ChAtg3基因的缺失导致希金斯炭疽菌菌落的黑化能力显著减弱，但并没有影响希金斯炭疽菌的营养生长。但是在尖孢镰刀菌F. oxysporum与假禾谷镰刀菌中，Atg3基因的缺失严重抑制了突变体菌落的营养生长，且未影响菌落的色素沉积[17, 22]。这表明Atg3基因在不同的真菌中介导营养生长方面所起的作用存在差异，而这可能是因为不同真菌在生长过程中营养获取方式不同。同时，在镰刀菌与稻瘟菌中关于Atg3基因的研究还显示，Atg3基因的缺失或受损会影响突变体的产孢与附着胞的形成，进而抑制突变体的致病能力[16-17, 22-23]。而在希金斯炭疽菌中，我们的结果同样显示ΔChAtg3菌株的产孢量与附着胞形成率显著下降，且ΔChAtg3菌株对拟南芥的致病能力也明显下降。而结合我们通过qRT-PCR技术所获得的ChAtg3基因在接种后8 ~ 40 h内表达量显著增加的结果，进一步地说明了ChAtg3基因在希金斯炭疽菌孢子萌发、附着胞形成和寄主植物侵染过程中起十分重要的作用。
此外，我们还发现ΔChAtg3菌株的菌落黑化能力显著减弱。黑化对于许多植物病原真菌，尤其是在以附着胞为侵染结构的真菌十分重要，黑化可以帮助附着胞承受胞内不断升高的膨压，从而帮助病原真菌入侵寄主植物[24-25]。而本研究的自噬相关基因ChAtg3缺失导致菌落黑化受损，表明希金斯炭疽菌中自噬与黑色素合成之间可能存在关联，这可能在一定程度上导致了突变体致病力的下降。但是目前在真菌中并没有关于自噬调控黑色素合成的相关研究报道，只有在哺乳动物的黑色素细胞中，有相关的报道表明自噬蛋白Atg4可以通过调节Atg8的酯化，从而参与黑色素的转运过程[26]。而Atg3同样作为Atg8修饰过程中的重要组分，是否在希金斯炭疽菌中具有类似的机制来介导黑色素的合成，仍需后续更加深入的研究。
综上所述，在希金斯炭疽菌中ChAtg3与自噬核心蛋白ChAtg8存在相互作用，且对自噬过程的发生具有十分重要的影响。ChAtg3基因的缺失会干扰希金斯炭疽菌中黑色素的合成与产孢，并且会在孢子萌发与侵染过程中高表达，介导附着胞的形成，从而影响希金斯炭疽菌的致病能力。
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图 1 希金斯炭疽菌ChAtg3蛋白的系统进化分析
Figure 1. Phylogenetic analysis of the ChAtg3 protein of Colletotrichum higginsianum
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图 2 希金斯炭疽菌ChAtg3基因的表达模式与互作分析
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 2. Expression pattern and interaction analysis of the ChAtg3 gene of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
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图 3 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除与回补菌株的验证
M：DNA 2000 Marker ；A、B中1为阴性对照，2~7分别为野生型菌株、ΔChAtg3-1、ΔChAtg3-5、ΔChAtg3-11、ΔChAtg3-13和ΔChAtg3-15；C中1为野生型菌株，2为ΔChAtg3-13；D、E、F中1为阴性对照，2~7分别为野生型、敲除质粒p821-Atg3-ko、CΔChAtg3-1、CΔChAtg3-2、CΔChAtg3-3。
Figure 3. Validation of ChAtg3 knockout and complementary strains of Colletotrichum higginsianum
M: DNA 2000 Marker; In figure A and B, 1: Negative control, 2−7: Wild type, ΔChAtg3-1, ΔChAtg3-5, ΔChAtg3-11, ΔChAtg3-13, ΔChAtg3-15; In figure C, 1: Wild type, 2: ΔChAtg3-13; In figure D, E and F, 1: Negative control, 2−7: Wild type, plasmid p821-Atg3-ko, CΔChAtg3-1, CΔChAtg3-2, CΔChAtg3-3.
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图 4 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除突变体的透射电镜观察、菌落形态和生物量
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 4. Transmission electron microscopy observation, colony morphology and biomass of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
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图 5 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除突变体的抗逆性测定
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05，LSD法)。
Figure 5. Resistance determination of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
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图 6 希金斯炭疽菌ChAtg3基因敲除突变体的产孢量、附着胞形成率与附着胞形态分析
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 6. Analysis of conidia production, appressorium formation rate and appressorium morphology of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
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图 7 希金斯炭疽菌ChAtg3基因敲除突变体的致病力分析
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 7. Analysis of pathogenicity of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
表 1 本研究中使用的PCR引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 Primer name 引物序列(5′→3′) Primer sequence Actin-F CCCCAAGTCCAACAGAGAGA Actin-R CATCAGGTAGTCGGTCAAGTCA qAtg3-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA qAtg3-R TTATACCCCCATCGTGAAATCGT ADAtg3-F ggaggccagtgaattcATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGAAC ADAtg3-R cgagctcgatggatccTTATACCCCCATCGTGAAATCGTG ADAtg8-F ggaggccagtgaattcCCGTCGCCGCATTCG ADAtg8-R cgagctcgatggatccCCGTCCTCGTCCTTGTGC BDAtg3-F catggaggccgaattcATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGAAC BDAtg3-R gccgctgcaggtcgacgTTATACCCCCATCGTGAAATCGTG BDAtg8-F catggaggccgaattcCCGTCGCCGCATTCG BDAtg8-R gccgctgcaggtcgacgCCGTCCTCGTCCTTGTGC Atg3up-F acgacggccagtgccaagcttGACTCTGCTGAAAGTTCCCTAAAGG Atg3up-R tgccgaccggaaccagtcgacTCGCGAAGACGTCCAAGATT Atg3ds-F gactctagaactagtggatccCGACGATTGTTTTTTCCCCTG Atg3ds-R tatggagaaactcgagaattcCTTTAGATTGGAAGGGTCTCGC Hyg-F CTATTTCTTTGCCCTCGGACG Hyg-R ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG Atg3ko-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA Atg3ko -R TTATACCCCCATCGTGAAATCGT pAtg3-F CTCGCAGAAGATACACTCAACGAG pAtg3-R GCGGGGTTGTCTCACGATT Atg3F1-F acgacggccagtgccaagcttGCGAGCCATTTCCTGATATATATAGC Atg3R1-R gaagattcatGGTTGGTCGCGAAGACGTC Atg3F2-F gcgaccaaccATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA Atg3R2-R ttgctcaccatTACCCCCATCGTGAAATCGT Atg3F3-F atgggggtaATGGTGAGCAAGGGCGAGG Atg3R3-R tcgtcgtTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC Atg3F4-F gctgtacaagtaaACGACGATTGTTTTTTCCCCT Atg3R4-R gccgccaccgcggtggagctcTTAGATTGGAAGGGTCTCGCAC Atg3HB-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTG Atg3HB-R TACCCCCATCGTGAAATCGTG GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCG GFP-R CTTGTACAGCTCGTCCATGC NeoR-F TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC NeoR-R ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG 
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