Study on the functions of the autophagy related gene ChAtg3 in Colletotrichum higginsianum
-
摘要:目的
研究希金斯炭疽病菌Colletotrichum higginsianum中自噬相关基因ChAtg3的作用。
方法对ChAtg3进行序列、系统发育和表达模式分析，并观察C. higginsianum侵染拟南芥Arabidopsis thaliana后ChAtg3的表达变化。通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术，进行ChAtg3基因的敲除和回补。
结果拟南芥接种C. higginsianum 8 ~ 40 h内ChAtg3基因表达量显著上升。敲除ChAtg3基因后的突变体(ΔChAtg3)自噬过程受抑制，其黑色素含量、产孢量、附着胞形成率和致病力均显著下降；但与野生型相比，菌丝生长和孢子萌发率并无显著变化。而通过基因回补，突变体CΔChAtg3在生物学表型和致病性上得以恢复。
结论揭示了ChAtg3基因在希金斯炭疽病菌自噬过程、孢子产生和附着胞形成中的关键作用，是该病原菌致病力的关键调节因子。
Abstract:ObjectiveTo study the role of ChAtg3, an autophagy-related gene in Colletotrichum higginsianum.
MethodThe sequence, phylogeny and expression pattern of ChAtg3 were analyzed, and the expression changes of ChAtg3 were observed in Arabidopsis thaliana after infection with C. higginsianum. An Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system was employed to perform specific gene knockouts and their subsequent complementation.
ResultThe expression changes of ChAtg3 were observed after C. higginsianum infected A. thaliana for 8 to 40 h. The mutant ΔChAtg3, created through targeted ChAtg3 gene knockout, exhibited impaired autophagy, with markedly reduced melanin production, conidiation, appressorium formation, and pathogenic potential, although mycelial growth and conidial germination rate had no significant changes compared with wild type. Gene complementation in the CΔChAtg3 strain effectively reinstated its biological phenotype and pathogenicity.
ConclusionThe results reveal that ChAtg3 plays a key role in autophagy, conidiation, and appressorium formation of C. higginsianum, confirming it as a critical determinant of pathogenic capacity of C. higginsianum.
-
Keywords:
- Colletotrichum higginsianum /
- Autophagy /
- ChAtg3 gene /
- Functional analysis of gene /
- Pathogenicity
-
土壤是陆地生态系统最大的有机碳库，全球陆地表层2 m土壤碳储量高达2 060 Pg[1]，其源汇功能变化对全球气候系统有极大影响[2]。土壤酸化广泛存在于各类陆地生态系统，会导致土壤结构劣化、重金属毒性增加和土壤生物特征及其主导的养分循环过程变化等后果[3-4]。研究表明，广东省主要土壤类型近30年呈现明显的酸化趋势，全省土壤pH均值下降0.26，其中赤红壤、水稻土和红壤pH降幅最大[5]。酸化不仅影响土壤生物活性和理化性质，还可能调节有机质组成和分解过程，进而改变土壤有机碳的积累与储存。土壤对外源酸输入具有一定缓冲能力，其大小取决于有机质含量、阳离子交换量、黏粒含量等理化性质和矿物风化等过程[6-7]。但是，随着土壤酸化程度加深，土壤酸缓冲体系逐渐发生变化，使土壤在广泛酸化的背景下变得脆弱。因此，探索有效的酸性土壤改良措施对华南地区农业可持续发展具有重要意义。
生物炭是生物质(如农林废弃物和畜禽废弃物等)在限氧条件下高温热解炭化的产物，具有多孔结构和富碳特性，将其作为土壤改良剂可以改善土壤理化性质，吸持有机和无机污染物，促进作物营养吸收和微生物活动，并通过碳封存减少农业碳排放，进而实现农业土壤的长期可持续管理[8-9]。然而，不同生物炭对土壤的改良效果存在差异[10]。相较于未改性生物炭，铁改性生物炭具有更大的比表面积和更强的机械性能[11]，能够提供丰富的铁离子及官能团，改善土壤团聚体结构，改变酶活性和微生物群落结构，提高土壤有机碳的稳定性[12]。除此之外，铁改性生物炭还能提高土壤的养分保持能力，为植物生长提供更为优质的环境[13]。
水稻是我国三大主粮作物之一，2022年全国秸秆产量达2.22亿t[14]。本研究以华南地区广泛分布且酸化严重的赤红壤为研究对象，以通过水稻秸秆资源化利用开展土壤改良和固碳增汇为目的，研究制备温度和改性处理如何影响秸秆生物炭添加对土壤酸缓冲性和有机碳组分的处理效应，研究结果可为酸性土壤改良和土壤固碳增汇提供科学依据，为促进农业可持续发展提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试土壤为赤红壤，取自华南农业大学树木园(N23°09'12.64"，E113°21'36.44")表层10 cm深度；研究区为亚热带季风气候，年均温21.7~23.1 ℃，年均降雨量1 923 mm，具有明显的干湿季，80%以上降雨发生在4~9月；土壤酸化程度较高，供试土壤pH为4.96，田间持水量(w)为47.73%，总碳含量(w) 4.70%，总氮含量(w) 0.43%，碳氮比11.02。
生物炭制备。将晾干后粉碎的水稻秸秆装入反应釜后置于马弗炉中，持续充入氮气形成厌氧环境，匀速升温30 min至目标温度(300、450、600 ℃)后恒温反应2 h，冷却后收集反应釜中残留物，即为相应温度下制备的未改性秸秆生物炭(Straw biochar，SB)。
生物炭改性。准备0.2 mol·L−1的FeSO4溶液与0.1 mol·L−1 的FeCl3溶液，按1∶1体积比混合(混合溶液中Fe2+与Fe3+的浓度比为2∶1)，缓慢加入0.7 mol·L−1的NaOH溶液，持续搅拌至溶液pH升高至11，得到改性溶液[15]。采用联合沉淀法制备改性生物炭[16]。将1 g生物炭加入20 mL改性溶液中搅拌均匀，浸泡72 h后将混合物中的固液分离，所得固体在75 ℃条件下烘干，过2 mm孔径筛，制得铁改性生物炭(Fe-modified biochar，MB)。
1.2 试验设计
本研究关注生物炭制备温度(3个水平：300、450、600 ℃)和改性处理(2个水平：未改性和改性)2个因素对土壤酸缓冲性和土壤有机碳组分的影响，共设置6个处理，每个处理重复3次，分别为添加300SB、300MB、450SB、450MB、600SB和600MB生物炭样品的土壤。生物炭样品以“生物炭制备温度+生物炭种类”命名，如300SB代表在300 ℃制备的未改性生物炭，600MB代表在600 ℃制备的铁改性生物炭；以未添加生物炭的对照组称为CK，添加生物炭的试验组以添加的生物炭样品名称作为代号。CK表示对照组(n=3)，BC代表生物炭添加组(n=18)。
试验开始前，称取300 g风干过筛(2 mm孔径)的土样于每个培养容器中，将上述生物炭样品按3%(w)比例与土壤样品混匀后添加去离子水，调节土壤含水量至60%田间持水量时进行培养。所有样品置于恒温光照培养箱(宁波东南仪器有限公司，RDZ-600D-4，中国)中培养，设定环境参数为光照强度10 000 lx，温度25 ℃，湿度60 %。试验从2022年8月1日开始至2022年12月31日结束，培养时间为5个月。培养期间，每周以称质量法确定土壤水分损失情况，并补充适量去离子水以维持土壤湿度稳定。培养结束后收集土壤样品并风干、研磨，过2 mm孔径筛后分装备用。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 生物炭基本性质
采用称质量法测定生物炭产率、改性增质量率、灰分含量、pH等指标。其中生物炭灰分的测定参照《木炭和木炭试验方法》(GB/T 17664—1999)[17]，将已知质量的生物炭放入马弗炉中，在(800±25) ℃高温下烧结1 h，直至质量恒定，冷却称量残留物质量，生物炭原始质量中残留质量的百分比即为生物炭灰分含量。使用pH计(OHAUS，SC310，中国)测定生物炭pH(固液质量比1∶20)。
1.3.2 土壤pH及酸缓冲容量
每种土壤样品称取7份，每份5 g，分别加入45.0、25.0、12.5 mL浓度为0.1 mol·L−1的HCl溶液，45 mL去离子水和12.5、25.0、45.0 mL浓度为0.1 mol·L−1的NaOH溶液，然后添加适量去离子水至溶液总体积为50 mL，振荡摇匀后静置12 h，用pH计测定溶液pH，每份样品重复测量3次，取平均值。土壤pH和酸碱添加量采用式(1)拟合得到酸碱缓冲曲线(图1)，并根据式(2)计算土壤酸缓冲容量[18]。
![]()
图 1 酸碱缓冲曲线X轴上的负值代表酸添加量，正值代表碱添加量。Figure 1. Acid-base buffering curveNegative values on the X-axis represent acid addition amount, and positive values represent alkali addition amount.$$ {\text{pH}} = {\text{pH}}_{{\mathrm{min}}} + \frac{a}{{1 + {{\mathrm{e}}^{\frac{{A - A{\mathrm{mid}}}}{b}}}}} \text{，} $$ (1) $$ {\text{pHBC}} = \frac{{{\text{a}} {\text{b}}}}{{(a + {\text{p}}{{\text{H}}_{{\text{min}}}} - {\text{pH}}) ({\text{pH}} - {\text{p}}{{\text{H}}_{{\text{min}}}})}} \text{，} $$ (2) 式中：pHmin为最小pH；a为最大pH和最小pH之差；A为实际酸碱添加量；Amid为酸碱缓冲曲线拐点处的酸碱添加量；e为自然常数；b为定义曲线形状的参数；pHBC为土壤酸缓冲容量，cmol/(kg·pH)。
1.3.3 土壤有机碳组分
土壤总有机碳和团聚体有机碳含量。将土壤样品置于装有2个土壤筛(孔径分别为0.250 mm和0.054 mm)的筛分仪上，以1 000 r/min振荡30 min进行土壤团聚体分级，获得不同粒径土壤团聚体(<0.054、0.054~0.250和 >0.250 mm)，将所有土壤样品过0.15 mm孔径筛后使用元素分析仪(Elementar，Vario TOC，德国)测定土壤总有机碳、总氮含量和各粒级团聚体有机碳含量。
土壤溶解性有机碳含量。使用去离子水对土壤溶解性有机碳(土、水质量比1∶5)进行浸提，将浸提液在3 500 r/min离心4 min后过滤，滤液采用总有机碳分析仪(耶拿，N/C
3100 ，德国)测定土壤溶解性有机碳含量。另外，使用紫外可见分光光度计(岛津Shimadzu，UV-2600 ，日本)测定溶解性有机碳组成，测量样品在210、250、254、260、272、365 nm处的光密度，分别记为A210、A250、A254、A260、A272和A365。代入式(3)计算得到对应波长下的紫外线吸光度(Specific ultraviolet absorbance，SUVA)。$$ {{\mathrm{SUVA}}_x} = \frac{{100{A_x}}}{{{\mathrm{DOC}}}} \text{，} $$ (3) 式中：SUVAx为波长x nm处的紫外吸光度；Ax代表在波长x nm处的光密度；DOC代表溶解性有机碳含量。其中，SUVA210表征溶解性有机碳中胺类物质含量；SUVA254表征溶解性有机碳的芳香化程度；SUVA260表征溶解性有机碳的疏水性碳含量；SUVA272表征溶解性有机碳的芳构化程度[19-20]；A250/A365表征腐殖化程度[21]。
1.4 数据处理和分析
使用MS Excel 2021进行数据处理，结果以平均值±标准误(n=3)表示；使用SigmaPlot进行曲线拟合；使用R(v4.4.2)和Origin进行图形绘制；使用IBM SPSS Statistics 25.0进行正态性检验、相关性分析、独立样本t检验、单因素和两因素方差分析，显著性水平设为P= 0.05。
2. 结果与分析
2.1 不同制备温度和改性处理下生物炭性质差异
结果如表1所示。制备温度升高显著降低生物炭产率(P<0.05)，且对生物炭改性增质量率有影响。制备温度显著影响生物炭pH，高温制备生物炭的pH显著高于低温制备生物炭(P<0.05)。改性处理显著降低生物炭pH，在同一制备温度下，改性生物炭pH显著低于未改性生物炭(P<0.05)。制备温度对生物炭总碳、总氮含量和碳氮比多无显著影响(P>0.05)，但改性处理显著改变生物炭总碳、总氮含量和碳氮比(P<0.05)。随着制备温度升高，生物炭灰分含量呈升高趋势，改性处理生物炭灰分含量高于未改性生物炭。制备温度和改性处理的交互作用对生物炭pH、总碳含量、总氮含量、碳氮比和灰分含量均无显著影响(P>0.05)。
表 1 不同制备温度和改性处理生物炭的理化性质1)Table 1. Physicochemical properties of biochar with different preparation temperatures and modification treatments处理
Treatment产率/%
Productivity改性增质量率/%
Massgain rate of modificationpH 总有机碳含量/%
Total organic carbon content总氮含量/%
Total nitrogen content碳氮比
C/N灰分含量/%
Ash content300SB 48.00±0.01a 8.01±0.01e 53.00±0.34a 1.11±0.03ab 48.00±1.20c 30.38±0.01b 450SB 33.75±0.01b 10.15±0.01b 53.98±0.62a 1.20±0.07a 45.74±1.85c 35.16±0.07b 600SB 23.50±0.01c 10.65±0.01a 54.72±0.29a 1.01±0.01b 54.38±0.77bc 48.93±0.02a 300MB 19.67 7.36±0.01f 39.91±1.71b 0.53±0.36c 75.70±3.96a 52.35±0.01a 450MB 30.61 9.56±0.01d 39.64±0.42b 0.67±0.02c 59.70±2.24b 53.01±0.01a 600MB 21.56 10.07±0.01c 41.37±0.98b 0.58±0.01c 71.63±1.01a 56.09±0.03a 双因素方差分析 Two-factor ANOVA 温度 Temperature (T) P<0.001 P=0.563 P=0.087 P=0.025 P=0.005 改性 Modification (M) P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001 温度×改性T × M P=0.338 P=0.911 P=0.497 P=0.172 P=0.053 1) 同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。
1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments (P<0.05, one-way ANOVA analysis).2.2 不同制备温度和改性处理生物炭添加对土壤pH和酸缓冲容量的影响
与对照相比，生物炭添加显著提升土壤pH(P<0.05，图2)，生物炭制备温度、改性处理及其交互作用对土壤pH影响显著(P<0.05)。在不同生物炭添加处理下，600SB处理土壤pH显著高于300SB、450SB和600MB处理土壤(P<0.05，图1)。600MB土壤pH相较于对照升高14.7%。施入生物炭显著提高土壤酸缓冲容量(P<0.05，表2)。不同温度处理的生物炭对土壤酸缓冲容量的提升效果无显著差异(P> 0.05)；生物炭改性处理对土壤酸缓冲容量有显著效应(P<0.05)，生物炭制备温度和改性处理的交互作用极显著(P<0.01) (表2)。除450SB处理外，其他生物炭添加处理土壤的酸缓冲容量显著高于对照土壤(P<0.05，表2)，450MB处理土壤酸缓冲容量显著高于300MB、450SB和600MB土壤(P<0.05，表2)，提升幅度达11.6%。
![]()
图 2 不同制备温度和改性处理生物炭添加对土壤pH的影响各小图中，“*”表示差异显著(P<0.05，t检验)；图B中，不同小写字母表示未改性生物炭不同制备温度间差异显著，不同大写字母表示改性生物炭不同制备温度间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。Figure 2. Effects of addition of biochar with different preparation temperatures and modification treatments on soil pHIn each figure “*” represents significant differences (P<0.05, t-test); In figure B, different lowercase letters indicate significant differences among different preparation temperatures of unmodified biochar, and different capital letters indicate significant differences among different preparation temperatures of modified biochar (P<0.05, one-way ANOVA).表 2 不同制备温度和改性处理生物炭添加对土壤酸缓冲容量的影响1)Table 2. Effects of addition of biochar with different preparation temperatures and modification treatments on soil acid buffering capacity处理
Treatmenta b Amid pHmin R2 pHmid 酸缓冲容量/[cmol·(kg·pH)−1]
pHBCCK 11.63±0.01 8.80±0.16 5.27±0.07 1.35±0.01 0.999 7.17±0.01 3.03±0.05 BC 11.23±0.26 9.12±0.20 1.50±0.68 1.46±0.01 0.999 7.07±0.01 3.25±0.01* 300SB 11.53±0.01 9.38±0.03 2.25±0.02 1.39±0.01 0.999 7.15±0.01 3.26±0.01ab* 300MB 11.51±0.01 9.18±0.03 2.38±0.06 1.39±0.01 0.999 7.14±0.01 3.19±0.01bc* 450SB 11.31±0.05 8.84±0.05 1.45±0.04 1.45±0.01 0.999 7.11±0.02 3.13±0.03c 450MB 10.98±0.01 9.28±0.01 1.13±0.01 1.51±0.01 0.999 7.00±0.01 3.38±0.01a* 600SB 10.97±0.01 9.00±0.03 0.69±0.03 1.52±0.01 0.999 7.00±0.01 3.28±0.01ab* 600MB 11.09±0.01 9.04±0.03 1.09±0.02 1.49±0.01 0.999 7.03±0.01 3.26±0.01b* 处理效应 Treatment effect P=0.011 双因素方差分析 Two-factor ANOVA 温度 Temperature (T) P=0.321 改性 Modification (M) P=0.040 温度×改性T × M P<0.001 1) a为酸碱缓冲曲线中最大pH和最小pH之差；b为定义曲线形状的参数；Amid为酸碱缓冲曲线拐点处的酸碱添加量；pHmin为酸碱缓冲曲线最小pH；R2为酸碱缓冲曲线的拟合程度；pHmid为酸碱缓冲曲线拐点处的pH。酸缓冲容量数据后的不同小写字母表示生物炭添加试验组间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)；“*”代表生物炭添加试验组与对照组之间差异显著(P<0.05，t-test)。
1) a is the difference between the maximum pH and the minimum pH in the acid-base buffering curve; b is the parameter defining the curve shape; Amid is the amount of acid-base added at the inflection point of the acid-base buffering curve; pHmin is the minimum pH of the acid-base buffering curve; R2 is the fitting degree of the acid-base buffering curve; pHmid is pH at the inflection point of the acid-base buffering curve. Different lowercase letters after the acid buffering capacity data indicate significant differences among biochar addition groups (P<0.05, one-way ANOVA); “*” represents significant differences between the biochar addition and the control groups (P< 0.05, t-test).2.3 不同制备温度和改性处理生物炭添加对土壤有机碳组分的影响
2.3.1 对土壤总有机碳含量的影响
相比对照处理，生物炭添加显著提升土壤总有机碳含量126.91%(P<0.05，图3)。生物炭制备温度对土壤总有机碳含量具有极显著正效应(P<0.01)，生物炭改性处理对土壤总有机碳含量的影响不显著(P>0.05)，生物炭制备温度和改性处理对土壤总有机碳含量存在显著交互作用(P<0.05)。在添加生物炭处理下，450SB、600SB和600MB处理的土壤总有机碳含量显著高于相同改性处理下的其他制备温度处理(P<0.05)，其中，600MB处理对土壤总有机碳含量的提升达160.5%。
![]()
图 3 不同制备温度和改性处理生物炭添加对土壤总有机碳含量的影响“*”表示差异显著(P<0.05，t-检验)；图B中，不同小写字母表示未改性生物炭不同制备温度间差异显著，不同大写字母表示改性生物炭不同制备温度间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。Figure 3. Effects of addition of biochar with different preparation temperatures and modification treatments on soil total organic carbon content“*” represents significant differences (P<0.05, t-test); In figure B, different lowercase letters indicate significant differences among different preparation temperatures of unmodified biochar, and different capital letters indicate significant differences among different preparation temperatures of modified biochar (P<0.05, one-way ANOVA).2.3.2 对土壤团聚体有机碳含量的影响
生物炭添加显著提升<0.054 mm土壤团聚体有机碳含量(P<0.05，图3A)。生物炭制备温度对<0.054 mm土壤团聚体有机碳含量影响极显著(P<0.01)，但生物炭改性处理及其与温度的交互作用无显著影响(P>0.05)，450SB处理土壤<0.054 mm团聚体有机碳含量显著高于450MB和300SB处理土壤(P<0.05) (图3B)。生物炭添加显著提升0.054~0.250 mm土壤团聚体有机碳含量(P<0.05，图3A)。相同制备温度下，添加未改性生物炭土壤中0.054~0.250 mm团聚体有机碳含量显著高于添加改性生物炭的土壤(P<0.05)。生物炭添加显著提升土壤>0.250 mm团聚体有机碳含量(P<0.05，图3C)。生物炭制备温度对>0.250 mm土壤团聚体有机碳含量影响显著(P<0.05)，但生物炭改性处理及其与温度的交互作用无显著影响(P>0.05)。300SB处理土壤>0.250 mm团聚体有机碳含量显著高于300MB处理土壤，600MB处理土壤显著高于600SB处理土壤(P<0.05)。
![]()
图 4 不同制备温度和改性处理生物炭添加对土壤团聚体有机碳含量的影响“*”表示差异显著(P<0.05，t-检验)；图B、C、D中，不同小写字母表示未改性生物炭不同制备温度间差异显著，不同大写字母表示改性生物炭不同制备温度间差异显著(P< 0.05，单因素方差分析)。Figure 4. Effects of addition of biochar with different preparation temperatures and modification treatments on soil aggregate organic carbon content“*” represents significant difference (P<0.05, t-test); In figure B, C, D different lowercase letters indicate significant differences among different preparation temperatures of unmodified biochar, and different capital letters indicate significant differences among different preparation temperatures of modified biochar (P<0.05, one-way ANOVA).450SB处理提高土壤<0.054 mm团聚体有机碳含量的作用最明显，有机碳提升比例(195.41%)显著高于600MB处理除外其他处理(P<0.05，表3)；450SB处理和600MB处理提高土壤0.054~0.250 mm团聚体有机碳含量的作用最明显，有机碳提升比例(178.88%和138.56%)显著高于除600SB处理外其他处理(P<0.05，表3)；300SB处理对提高土壤>0.250 mm团聚体有机碳含量的作用最明显，有机碳提升比例(60.33%)显著高于除450MB和600MB处理外其他处理(P<0.05，表3)。
表 3 不同种类生物炭添加对不同粒径土壤团聚体碳含量的提升比例1)Table 3. Proportion of carbon content of soil aggregate with different particle sizes increased by addition of different kinds of biochar% 处理 Treatment <0.054 mm 0.054~0.250 mm >0.250 mm BC 145.21 129.29 40.26 300SB 103.31b 97.55b 60.33a 450SB 195.41a 178.88a 28.59b 600SB 172.30b 138.56ab 30.60b 300MB 95.56b 60.53b 35.80b 450MB 127.73b 107.49b 39.08ab 600MB 176.96a 143.51a 41.55ab 双因素方差分析 Two-factor ANOVA 温度 Temperature (T) P<0.001 P=0.003 P=0.054 改性 Modification (M) P=0.086 P=0.012 P=0.946 温度×改性T × M P=0.077 P=0.724 P=0.017 1)同列数据后的不同小写字母表示生物炭添加试验组间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)。
1)Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among biochar addition groups (P<0.05, one-way ANOVA analysis).同时，在土壤<0.054 mm团聚体中，450SB处理对团聚体有机碳含量的提升比例显著高于300SB处理(P<0.05，表3)；600MB处理对团聚体有机碳含量的提升比例(176.96%)显著高于300MB和450MB处理(95.56%和127.73%) (P<0.05，表3)。在土壤0.054~0.250 mm团聚体中，450SB处理对团聚体有机碳含量的提升比例(178.88%)显著高于300SB处理(97.55%) (P<0.05，表3)；600MB处理对团聚体有机碳含量的提升比例(143.51%)显著高于300MB处理(60.53%) (P<0.05，表3)。在土壤>0.250 mm团聚体中，300SB处理对团聚体有机碳含量的提升比例显著高于450SB和600SB处理(28.59%和30.60%) (P<0.05，表3)。
2.3.3 对土壤溶解性有机碳含量的影响
不同制备温度和改性处理生物炭添加对土壤溶解性有机碳含量无显著影响，且两者交互作用的影响同样不显著(P>0.05，表4)。生物炭制备温度及其与改性处理的交互作用对土壤溶解性有机碳组分的影响不显著(P>0.05，表4)，但改性处理显著影响生物炭样品添加对土壤溶解性有机碳中的胺类物质、疏水性碳和芳香族有机物等组分和芳构化程度(P<0.05，表4)。相对于对照组，改性生物炭的添加趋于降低溶解性有机碳中胺类物质、疏水性碳和芳香族有机物的含量以及芳构化程度。制备温度、改性处理及两者交互作用对土壤溶解性有机碳腐殖化程度无显著影响(P>0.05)。
表 4 不同制备温度和改性生物炭添加对土壤溶解性有机碳含量与组分的影响1)Table 4. Effects of addition of biochar with different preparation temperatures and modification treatments on soil dissolved organic carbon contents and components处理 Treatment w/(mg·kg−1) SUVA210 SUVA254 SUVA260 SUVA272 A250/A365 CK 356.06±185.80 0.16±0.02 0.13±0.03 0.12±0.03 0.11±0.03 4.15±0.86 BC 399.38±65.70 0.30±0.10 0.31±0.17 0.29±0.16 0.26±0.14 3.91±0.54 300SB 235.90±31.40a 0.36±0.01a 0.31±0.15ab 0.29±0.14ab 0.26±0.13ab 3.64±0.52b 300MB 283.00±17.90a 0.28±0.06ab 0.13±0.04b 0.13±0.04b 0.11±0.04b 4.01±0.92ab 450SB 348.59±15.60a 0.34±0.19ab 0.49±0.23a 0.47±0.22a 0.42±0.19ab 3.66±0.29b 450MB 270.52±10.20a 0.28±0.01ab 0.25±0.05ab 0.24±0.05ab 0.22±0.04ab 3.65±0.50b 600SB 317.83±140.50a 0.38±0.12a 0.48±0.09a 0.46±0.08a 0.41±0.08a 3.86±0.44ab 600MB 340.44±110.80a 0.16±0.12b 0.18±0.06b 0.17±0.06b 0.15±0.05ab 4.64±0.38a 处理效应
Treatment effectP=0.402 P<0.001 P=0.002 P=0.001 P=0.001 P=0.539 双因素方差分析 Two-factor ANOVA 温度 Temperature (T) P=0.310 P=0.706 P=0.118 P=0.118 P=0.115 P=0.197 改性 Modification (M) P=0.667 P=0.042 P=0.001 P=0.001 P=0.001 P=0.164 温度×改性T × M P=0.910 P=0.441 P=0.670 P=0.670 P=0.645 P=0.483 1)同列数据后的不同小写字母表示生物炭添加试验组间差异显著(P<0.05，单因素方差分析)；SUVA210表征胺类物质含量，SUVA254表征芳香化程度，SUVA260表征疏水性碳含量，SUVA272表征芳构化程度，A250/A365表征腐殖化程度。
1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among biochar addition groups (P<0.05, one-way ANOVA); SUVA210 characterizes the content of amines, SUVA254 characterizes the aromatization degree, SUVA260 characterizes the hydrophobic carbon content, SUVA272 characterizes the degree of aromatization, A250/A365 characterizes the degree of humization.3. 讨论与结论
3.1 生物炭添加对土壤pH和酸缓冲性的影响
生物炭呈碱性，能提高土壤pH。制备温度越高的生物炭，碱性越强，对土壤pH的提升作用也越明显。此外，生物炭的疏松结构有助于增大土壤孔隙，激活土壤微生物，从而导致pH上升[15, 22]。本研究中，生物炭添加处理土壤pH升高可能与土壤中胺类物质、疏水性碳和芳香族化合物等组分含量增加有关。但是，铁改性处理降低生物炭pH和土壤溶解性有机碳中胺类物质、疏水性碳和芳香族化合物含量，因此相对于未改性的生物炭，改性处理的生物炭对土壤pH的提升效果较弱。
生物炭添加显著增加土壤酸缓冲性，可能与生物炭添加后土壤pH、有机碳含量和阳离子交换量等土壤性质变化有关。土壤酸缓冲性可分为不同的缓冲阶段，在不同阶段由不同过程和因素控制土壤酸缓冲能力[23-24]。研究表明，土壤酸缓冲性与土壤pH、有机碳含量、黏粒含量、阳离子交换量等性质显著相关[7, 25]。本研究中，生物炭添加处理显著提升土壤pH和有机碳含量，进而提升土壤酸缓冲性。此外，生物炭添加会显著增加土壤阳离子交换量[26]，进而可能大幅提升土壤酸缓冲性。本研究发现铁改性处理会显著提升生物炭对土壤酸缓冲性的作用效应，这可能是由于改性处理增加生物炭中铁离子负载量进而提升土壤阳离子交换量。
3.2 生物炭添加对土壤有机碳组分的影响
由于生物炭含碳量较高，生物炭添加显著提升土壤总有机碳含量，且制备温度显著提升生物炭对土壤总有机碳含量的处理效应，但改性处理无显著影响。研究表明，高温可以去除原材料中所含的挥发性有机物，使形成的生物炭具有较高芳香化程度和碳稳定性[27]，并导致生物炭比表面积和孔隙率增加，微孔结构增多。稳定性有机碳输入一方面会直接提升土壤有机碳含量[28]，另一方面能通过产生负激发效应减少土壤有机碳分解，从而增加土壤有机碳储存量[29]。此外，铁改性处理增加土壤铁含量，铁碳耦合作用可能会减少土壤有机碳分解，增加土壤碳固持量[30]。
团聚体是土壤基本结构单元，对土壤有机碳固持和物质循环具有重要作用[31]。生物炭添加会改变不同粒径土壤团聚体组成与比例，增强土壤颗粒的结构稳定性，从而提高土壤固碳潜力[32]。另一方面，生物炭的特殊结构和组分会促进土壤团聚体形成和碳包裹，提升对土壤有机碳的物理化学保护能力[33]，从而增加团聚体有机碳积累。本研究发现，生物炭添加对土壤团聚体有机碳含量的提升比例因团聚体粒径而异，其作用效应随团聚体粒径增加而降低，表明生物炭添加对小粒径土壤团聚体有机碳的影响更大。小粒径土壤团聚体通常具有更大的比表面积，能与生物炭所携带的有机物和养分互相胶结，形成更稳定的复合结构。因土壤团聚体较高的密度和疏松结构，生物炭与土壤大团聚体胶结程度较低，限制了大团聚体对有机碳的有效固定，因此导致生物炭添加对不同粒径团聚体的影响不同[34]。此外，无论土壤团聚体粒径大小，制备温度显著影响生物炭对土壤团聚体有机碳的作用效应。铁改性生物炭对所有粒径土壤团聚体有机碳含量的提升比例随生物炭制备温度的升高而升高。但未改性生物炭对0.054~0.250 mm及<0.054 mm土壤团聚体有机碳含量的提升比例则随生物炭制备温度的升高呈现先升高后降低趋势。这可能是因为随着生物炭制备温度的升高，其比表面积和活性官能团的数量增加，从而增强了生物炭与小粒径团聚体的相互作用，促进土壤有机碳的积累。
此外，铁改性处理对土壤团聚体有机碳的影响因团聚体粒径而异。与未改性生物炭相比，铁改性生物炭添加显著降低0.054~0.250 mm粒径土壤团聚体有机碳含量。而在粒径>0.250 mm的土壤团聚体中，不同制备温度生物炭的铁改性处理对土壤团聚体有机碳含量影响不一。这可能是因为铁改性处理导致生物炭的特性(如孔隙结构与分布)和组成(如胺类物质、疏水性碳和芳香族有机物含量)发生变化，从而影响了生物炭与土壤微粒之间的相互作用[13, 22]，导致300和450 ℃下制备的铁改性生物炭对0.054~0.250 mm粒径土壤团聚体有机碳的提升比例低于相同制备温度下的未改性生物炭。这与Chen等[12]的研究结果相反，铁改性生物炭对土壤团聚体有机碳的作用效应还需进一步研究。已有研究表明，铁氧化物与土壤有机碳相互作用形成的稳定有机−矿物复合物是土壤可溶性有机碳长期固定的关键地球化学机制[35]。因此，尽管铁改性生物炭在提升土壤团聚体有机碳含量方面未能达到预期，但在促进土壤有机碳稳定性方面仍然具有潜力。未来的研究可以进一步探讨不同改性程度、改性方法以及与土壤微生物的相互作用如何影响铁改性生物炭的性能。
3.3 结论
本研究探讨了生物炭添加对赤红壤酸缓冲性和有机碳组分的影响。结果显示，生物炭显著提高土壤pH和酸缓冲容量，且改性处理对土壤酸缓冲性有显著影响。生物炭的添加显著增加了土壤总有机碳和团聚体有机碳含量，但对溶解性有机碳含量无显著影响。制备温度显著影响生物炭对土壤有机碳含量的提升效果，且这种影响在不同粒径团聚体中表现不同。此外，铁改性处理趋于降低土壤溶解性有机碳中的胺类物质、疏水性碳和芳香族有机物等组分含量和芳构化程度。综上所述，生物炭添加对提高土壤酸缓冲能力和固碳能力具有积极作用，但其作用效应受制备温度和改性处理等试验条件影响。
致谢：感谢华南农业大学土壤生态学实验室杨佳悦和李雅正在试验操作方面给予的指导和帮助！感谢斯坦福大学王方舟博士对英文摘要进行修改润色！
-
![]()
图 1 希金斯炭疽菌ChAtg3蛋白的系统进化分析
Figure 1. Phylogenetic analysis of the ChAtg3 protein of Colletotrichum higginsianum
![]()
图 2 希金斯炭疽菌ChAtg3基因的表达模式与互作分析
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 2. Expression pattern and interaction analysis of the ChAtg3 gene of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
![]()
图 3 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除与回补菌株的验证
M：DNA 2000 Marker ；A、B中1为阴性对照，2~7分别为野生型菌株、ΔChAtg3-1、ΔChAtg3-5、ΔChAtg3-11、ΔChAtg3-13和ΔChAtg3-15；C中1为野生型菌株，2为ΔChAtg3-13；D、E、F中1为阴性对照，2~7分别为野生型、敲除质粒p821-Atg3-ko、CΔChAtg3-1、CΔChAtg3-2、CΔChAtg3-3。
Figure 3. Validation of ChAtg3 knockout and complementary strains of Colletotrichum higginsianum
M: DNA 2000 Marker; In figure A and B, 1: Negative control, 2−7: Wild type, ΔChAtg3-1, ΔChAtg3-5, ΔChAtg3-11, ΔChAtg3-13, ΔChAtg3-15; In figure C, 1: Wild type, 2: ΔChAtg3-13; In figure D, E and F, 1: Negative control, 2−7: Wild type, plasmid p821-Atg3-ko, CΔChAtg3-1, CΔChAtg3-2, CΔChAtg3-3.
![]()
图 4 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除突变体的透射电镜观察、菌落形态和生物量
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 4. Transmission electron microscopy observation, colony morphology and biomass of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
![]()
图 5 希金斯炭疽菌ChAtg3敲除突变体的抗逆性测定
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05，LSD法)。
Figure 5. Resistance determination of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
![]()
图 6 希金斯炭疽菌ChAtg3基因敲除突变体的产孢量、附着胞形成率与附着胞形态分析
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 6. Analysis of conidia production, appressorium formation rate and appressorium morphology of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
![]()
图 7 希金斯炭疽菌ChAtg3基因敲除突变体的致病力分析
柱子上不同小写字母表示差异显著( P < 0.05 ，LSD法)。
Figure 7. Analysis of pathogenicity of ChAtg3 knockout strain of Colletotrichum higginsianum
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences(P<0.05, LSD method).
表 1 本研究中使用的PCR引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称 Primer name 引物序列(5′→3′) Primer sequence Actin-F CCCCAAGTCCAACAGAGAGA Actin-R CATCAGGTAGTCGGTCAAGTCA qAtg3-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA qAtg3-R TTATACCCCCATCGTGAAATCGT ADAtg3-F ggaggccagtgaattcATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGAAC ADAtg3-R cgagctcgatggatccTTATACCCCCATCGTGAAATCGTG ADAtg8-F ggaggccagtgaattcCCGTCGCCGCATTCG ADAtg8-R cgagctcgatggatccCCGTCCTCGTCCTTGTGC BDAtg3-F catggaggccgaattcATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGAAC BDAtg3-R gccgctgcaggtcgacgTTATACCCCCATCGTGAAATCGTG BDAtg8-F catggaggccgaattcCCGTCGCCGCATTCG BDAtg8-R gccgctgcaggtcgacgCCGTCCTCGTCCTTGTGC Atg3up-F acgacggccagtgccaagcttGACTCTGCTGAAAGTTCCCTAAAGG Atg3up-R tgccgaccggaaccagtcgacTCGCGAAGACGTCCAAGATT Atg3ds-F gactctagaactagtggatccCGACGATTGTTTTTTCCCCTG Atg3ds-R tatggagaaactcgagaattcCTTTAGATTGGAAGGGTCTCGC Hyg-F CTATTTCTTTGCCCTCGGACG Hyg-R ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG Atg3ko-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA Atg3ko -R TTATACCCCCATCGTGAAATCGT pAtg3-F CTCGCAGAAGATACACTCAACGAG pAtg3-R GCGGGGTTGTCTCACGATT Atg3F1-F acgacggccagtgccaagcttGCGAGCCATTTCCTGATATATATAGC Atg3R1-R gaagattcatGGTTGGTCGCGAAGACGTC Atg3F2-F gcgaccaaccATGAATCTTCTCTACTCCACCGTGA Atg3R2-R ttgctcaccatTACCCCCATCGTGAAATCGT Atg3F3-F atgggggtaATGGTGAGCAAGGGCGAGG Atg3R3-R tcgtcgtTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC Atg3F4-F gctgtacaagtaaACGACGATTGTTTTTTCCCCT Atg3R4-R gccgccaccgcggtggagctcTTAGATTGGAAGGGTCTCGCAC Atg3HB-F ATGAATCTTCTCTACTCCACCGTG Atg3HB-R TACCCCCATCGTGAAATCGTG GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCG GFP-R CTTGTACAGCTCGTCCATGC NeoR-F TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC NeoR-R ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG 
下载: 导出CSV
-
[1] 祝一鸣. 希金斯炭疽菌自噬蛋白ChAtg8及互作蛋白Ch174 的功能分析[D]. 广州: 华南农业大学, 2023. [2] DAMM U, O’CONNELL R J, GROENEWALD J Z, et al. The Colletotrichum destructivum species complex-hemibiotrophic pathogens of forage and field crops[J]. Studies in Mycology, 2014, 79(1): 49-84. doi: 10.1016/j.simyco.2014.09.003
[3] 张华, 刘自珠, 郑岩松, 等. 菜心品种资源炭疽病抗性鉴定[J]. 广东农业科学, 2000, 27(3): 47-49. doi: 10.3969/j.issn.1004-874X.2000.03.021 [4] 卢博彬, 杨暹. 菜心炭疽病研究进展[J]. 长江蔬菜, 2009(24): 1-5. doi: 10.3865/j.issn.1001-3547.2009.24.001 [5] 王强, 陈沁滨, 熊元忠. 十字花科蔬菜繁种产量的制约因素及对策[J]. 长江蔬菜, 2009(22): 75-77. [6] 周而勋, 杨媚, 张华, 等. 菜心炭疽病菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响因素[J]. 南京农业大学学报, 2002, 25(2): 47-51. [7] JUAREZ-MONTIEL M, CLARK-FLORES D, TESILLO-MORENO P, et al. Vacuolar proteases and autophagy in phytopathogenic fungi: A review[J]. Frontiers in Fungal Biology, 2022, 3: 948477. doi: 10.3389/ffunb.2022.948477.
[8] GANLEY I. The importance of being autophagic[J]. New England Journal of Medicine, 2021, 384(25): 2449-2450. doi: 10.1056/NEJMe2107506
[9] FUKUDA T, KANKI T. Atg43, a novel autophagy-related protein, serves as a mitophagy receptor to bridge mitochondria with phagophores in fission yeast[J]. Autophagy, 2021, 17(3): 826-827. doi: 10.1080/15548627.2021.1874662
[10] KUZNETSOV S A, GELFAND V I. 18 kDa microtubule-associated protein: Identification as a new light chain (LC-3) of microtubule-associated protein 1 (MAP-1)[J]. FEBS Letters, 1987, 212(1): 145-148. doi: 10.1016/0014-5793(87)81574-0
[11] SHIRAISHI K, SAKAI Y. Autophagy as a survival strategy for eukaryotic microbes living in the phyllosphere[J]. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 867486. doi: 10.3389/fpls.2022.867486
[12] LIU X H, ZHAO Y H, ZHU X M, et al. Autophagy-related protein MoAtg14 is involved in differentiation, development and pathogenicity in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 40018. doi: 10.1038/srep40018.
[13] LIU T B, LIU X H, LU J P, et al. The cysteine protease MoAtg4 interacts with MoAtg8 and is required for differentiation and pathogenesis in Magnaporthe oryzae[J]. Autophagy, 2010, 6(1): 74-85. doi: 10.4161/auto.6.1.10438
[14] LI F Q, VIERSTRA R D. Autophagy: A multifaceted intracellular system for bulk and selective recycling[J]. Trends in Plant Science, 2012, 17(9): 526-537. doi: 10.1016/j.tplants.2012.05.006
[15] LIU S Z, YAO S J, YANG H, et al. Autophagy: Regulator of cell death[J]. Cell Death & Disease, 2023, 14: 648. doi: 10.1038/s41419-023-06154-8.
[16] LV W Y, WANG C Y, YANG N, et al. Genome-wide functional analysis reveals that autophagy is necessary for growth, sporulation, deoxynivalenol production and virulence in Fusarium graminearum[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 11062. doi: 10.1038/s41598-017-11640-z.
[17] 董在芳, 丁腾腾, 单艺轩, 等. 自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的生长和致病[J]. 中国农业科学, 2024, 57(6): 1080-1090. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2024.06.005 [18] 杨滢滢. MaMYB4参与低温影响采后香蕉果实成熟的表观遗传机制分析[D]. 广州: 华南农业大学, 2020. [19] ZHU X M, LI L, WU M, et al. Current opinions on autophagy in pathogenicity of fungi[J]. Virulence, 2019, 10(1): 481-489. doi: 10.1080/21505594.2018.1551011
[20] DERETIC V. Autophagy in inflammation, infection, and immunometabolism[J]. Immunity, 2021, 54(3): 437-453. doi: 10.1016/j.immuni.2021.01.018
[21] WANG P, SUN X, JIA X, et al. Apple autophagy-related protein MdATG3s afford tolerance to multiple abiotic stresses[J]. Plant Science, 2017, 256: 53-64. doi: 10.1016/j.plantsci.2016.12.003
[22] KHALID A R, LV X, NAEEM M, et al. Autophagy related gene (ATG3) is a key regulator for cell growth, development, and virulence of Fusarium oxysporum[J]. Genes (Basel), 2019, 10(9): 658. doi: 10.3390/genes10090658
[23] YIN Z Y, CHEN C, YANG J, et al. Histone acetyltransferase MoHat1 acetylates autophagy-related proteins MoAtg3 and MoAtg9 to orchestrate functional appressorium formation and pathogenicity in Magnaporthe oryzae[J]. Autophagy, 2019, 15(7): 1234-1257. doi: 10.1080/15548627.2019.1580104
[24] WANG T, REN D, GUO H, et al. CgSCD1 is essential for melanin biosynthesis and pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides[J]. Pathogens, 2020, 9(2): 141. doi: 10.3390/pathogens9020141
[25] ZHU S Y, YAN Y X, QU Y M, et al. Role refinement of melanin synthesis genes by gene knockout reveals their functional diversity in Pyricularia oryzae strains[J]. Microbiological Research, 2021, 242: 126620. doi: 10.1016/j.micres.2020.126620.
[26] RAMKUMAR A, MURTHY D, RAJA D A, et al. Classical autophagy proteins LC3B and ATG4B facilitate melanosome movement on cytoskeletal tracks[J]. Autophagy, 2017, 13(8): 1331-1347. doi: 10.1080/15548627.2017.1327509
计量
- 文章访问数: 0
- HTML全文浏览量: 0
- PDF下载量: 0
