中国是世界第二大香蕉Musa nana Lour.生产国，也是世界第一大香蕉消费国^[1]，香蕉产业已成为我国热带地区乡村振兴的重要支柱产业。香蕉枯萎病是香蕉生产上的一种毁灭性土传病害，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc)。感染枯萎病的香蕉植株会出现叶片黄化、枯萎，球茎和维管束组织变褐坏死等症状，病情严重的会整株死亡。根据对香蕉品种致病力的差异，Foc可分为3个生理小种，其中以4号生理小种(Foc4)危害最为严重；根据病害发生的地理区域等因素，Foc4可分为热带和亚热带4号生理小种(Foc TR4和Foc STR4)；在我国主要以Foc TR4为主，Foc TR4可导致所有的香蕉栽培品种发病^[2-4]。香蕉枯萎病是一种维管束系统性病害，其病原菌以不同形式存在于土壤中，因此化学农药对其防治效果并不理想。筛选拮抗菌并开展其对香蕉枯萎病菌的抑菌机理研究，是当前香蕉枯萎病防控研究的热点^[5]。近年已报道了一些对Foc具有良好抑制作用的拮抗菌。周登博等^[6]从蕉园土壤中分离得到了1株拮抗菌T3−G−59，被鉴定为多产色链霉菌Streptomyces polychromogenes，其对Foc TR4菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率分别为86.4%和81.0%。黄建凤等^[7]分离获得2株拮抗细菌H−2和H−7，分别被鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefens，对香蕉枯萎病的防效分别为59.1%和53.0%。李锦等^[8]从香蕉植株的球茎和假茎中分离了2株内生菌，分别被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌B. velezensis和暹罗芽孢杆菌B. siamensis，对Foc TR4的抑菌率分别为64.6%和60.9%。伯克霍尔德菌Burkholderia sp.是一类常见的植物根际防病促生菌，已报道的至少有25个种，洋葱伯克霍尔德菌B. contaminans是其中的一类重要生防菌。在已开展的洋葱伯克霍尔德菌研究中，大多是利用该菌进行瓜果采后病害的防治^[9]。例如，Shen等^[10]从健康葡萄土壤中分离获得1株洋葱伯克霍尔德菌B−1，其对葡萄灰霉病Botrytis cinerea的防治效果为51.2%。关于洋葱伯克霍尔德菌对香蕉枯萎病防效的研究鲜见报道。本文以健康香蕉根际土壤为材料，从中分离得到1株对Foc TR4具有良好拮抗作用的生防细菌GD1−1；通过菌落形态、生理生化特征和多基因序列分析等，对生防菌GD1−1进行了鉴定；通过抑菌谱分析、盆栽防效试验等对其生防潜力进行了评价，以期为香蕉枯萎病防控提供优质的生防菌资源，也为进一步研发该类生物菌肥和生物菌剂奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

本研究所用香蕉枯萎病菌热带4号生理小种(F. oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，Foc TR4)菌株DZ1和1号生理小种(Foc1)菌株C2为华南农业大学植物病理生理学研究室保存，所用巴西蕉幼苗购自中国科学院华南植物园。健康香蕉根际土壤采自广东省博罗县柏塘镇的一个健康蕉园，栽培品种为‘巴西蕉’Musa acuminate AAA Cavendish cv. Brazilian。

1.2   方法

1.2.1   拮抗细菌的分离筛选

采用稀释涂布法分离拮抗菌，将土壤悬浮液涂布于NA培养基(每升培养基中含牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，pH 7.2~7.4)，28 ℃培养2 d后利用连续划线培养法获取单菌落。采用对峙培养法，将Foc TR4接种至PDA培养基，在2.5 cm处接种拮抗细菌， 28 ℃培养5~7 d；以仅接种Foc TR4作为对照。抑菌率计算公式为：

1.2.2   拮抗菌GD1−1的鉴定

1)形态学鉴定：将拮抗菌落涂布于NA培养基， 25 ℃培养2 d，观察菌落大小、颜色、表面特征等，并用高分辨率场发射扫描电子显微镜(FEI Verios 460)观察其超显微结构。2)生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》^[11]测定拮抗菌的生理生化特征。3)分子生物学鉴定：以拮抗菌基因组DNA为模板，以27-F/1492-R、GyrB-F/ GyrB-R、AtpD-F/AtpD-R、GltB-F/ GltB-R为引物(表1)，分别扩增16S rDNA、GyrB、AtpD和GltB基因序列；将PCR扩增产物进行测序，测序结果分别在NCBI数据库中进行比对，用MEGA 7.0软件以邻接法构建系统发育树。

表  1  本文所用引物

Table  1.  Primers used in this study

引物名称 Primer name	引物序列(5′→3′) Primer sequence (5′→3′)	参考 文献 Reference
27-F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	[12]
1492-R	GGTTACCTTGTTACGACTT
GyrB-F	ACCGGTCTGCAYCACCTCGT	[12]
GyrB-R	YTCGTTGWARCTGTCGTTCCACTGC
AtpD-F	ATGAGTACTRCTGCTTTGGTAGAAGG	[12]
AtpD-R	CGTGAAACGGTAGATGTTGTCG
GltB-F	CTGCATCATGATGCGCAAGTG	[13]
GltB-R	CTTGCCGCGGAARTCGTTGG

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1.2.3   拮抗菌GD1−1生长曲线的建立

将拮抗菌GD1−1菌悬液(终浓度为1×10⁶ CFU/mL)接种于NA液体培养基，28 ℃、180 r/min振荡培养，在接种不同时间后取样，利用稀释平板法测定其活菌数^[14]。

1.2.4   拮抗菌GD1−1对Foc TR4的抑制作用

1)对菌丝生长的影响：将拮抗菌GD1−1与Foc TR4于PDA培养基中进行对峙培养，6 d后取对峙培养边缘的Foc TR4菌丝进行显微观察。2)对孢子萌发的影响：将拮抗菌GD1−1接种于NA液体培养基，28 ℃、180 r/min振荡培养24 h；取1 mL接种于100 mL的NA液体培养基，振荡培养24 h，6 000 r/min离心10 min，将上清液用0.22 µm细菌过滤器过滤，得到拮抗菌的发酵上清液；将2×10⁶ mL⁻¹ Foc TR4分生孢子悬浮液与等体积的GD1−1发酵上清液混匀，置于96孔板，28 ℃放置7 h后观察分生孢子萌发情况，每次观察至少900个孢子；试验重复3次。

1.2.5   拮抗菌GD1−1的抑菌谱分析

采用对峙平板法，对菌株GD1−1的抑菌谱进行分析，所用病原菌为：尖孢镰刀菌番茄专化型F. oxysporum f. sp. lycopersici(Fol)、尖孢镰刀菌冬瓜专化型F. oxysporum f. sp. benincasae(Fob)、尖孢镰刀菌苦瓜专化型F. oxysporum f. sp. momordicae(Fom)、腐皮镰刀菌F. solani、变红镰刀菌F. incarnatum、禾谷镰刀菌F. graminearum、链格孢菌Alternaria alternata、多主棒孢菌Corynespora cassiicola和香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae，上述病菌由华南农业大学舒灿伟博士和仲恺农业工程学院董章勇博士惠赠。每次试验每个处理至少设置3个培养皿，试验重复3次。

1.2.6   拮抗菌GD1−1对香蕉枯萎病的防效分析

将3叶期的巴西蕉幼苗移栽至含灭菌营养土的花盆中，待长至4叶期后进行处理。1)GD1−1处理：将50 mL拮抗菌GD1−1菌悬液倒入香蕉幼苗的土壤中，使其终浓度为1×10⁸ CFU/g，2 d后用伤根处理法接种Foc TR4分生孢子悬浮液，使其终浓度为1×10⁵ g⁻¹；5 d后再次接种拮抗菌GD1−1菌悬液。2)阴性对照：用灭菌ddH₂O代替上述所有接种处理。3)阳性对照：只接种Foc TR4，用灭菌ddH₂O代替拮抗菌GD1−1接种。每处理接种30株香蕉幼苗，重复3次，在Foc TR4接种25 d后进行调查，病害分级标准参照黄素梅等^[15]的方法。

1.2.7   拮抗菌GD1−1的促生作用分析

将菌株GD1−1接种于NKA培养基^[16]， 28 ℃培养3 d后评估其解钾活性；将菌株GD1−1接种于NPA培养基^[17]或牛奶培养基^[18]， 28 ℃培养7 d后评估其溶磷活性或产蛋白酶能力；将菌株GD1−1接种于苯胺蓝−PDA培养基^[19]或CAS培养基^[20]， 28 ℃培养5 d后评估其分解木质素的能力或产铁载体能力。每个处理接种5个培养皿，重复3次。

菌株GD1−1对香蕉促生作用的测定方法：将50 mL菌株GD1−1菌悬液倒入香蕉幼苗的花盆土壤(终浓度为1×10⁸ CFU/g)，5 d后再次接种GD1−1菌悬液，第2次接种后25 d调查香蕉植株的鲜质量和球茎直径，以灭菌ddH₂O接种作为对照。每处理接种30株香蕉幼苗，重复3次。

2.   结果与分析

2.1   拮抗菌的分离筛选结果

采用稀释分离法对健康巴西蕉根际土壤细菌进行分离，共获得186株细菌。平板对峙培养试验结果表明，菌株GD1−1对Foc TR4具有良好的抑制效果，抑制率为72.5%(图1)。

图  1  菌株GD1−1对Foc TR4的抑制作用

Figure  1.  The antifungal activity of strain GD1-1 against Foc TR4

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2.2   拮抗菌GD1−1的形态鉴定结果

将菌株GD1−1涂布于NA培养基，培养2 d后观察发现，培养皿中出现绿色圆形菌落，菌落隆起、有光泽度、表面光滑、边缘整齐(图2 A)，有淡淡的橡胶味。电子显微镜观察(图2 B和2C)表明，其菌体呈卵圆形，表面有皱缩，菌体大小为(0.5~2.0) µm×(0.4~0.6) µm。

图  2  拮抗菌D1−1的菌落形态

A: NA培养基；B和C: 扫描电镜。

Figure  2.  Colony morphology of antagonistic strain GD1−1

A: NA medium; B and C: Scanning electron micrograph.

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2.3   拮抗菌GD1−1的生理生化和分子生物学鉴定结果

生理生化试验结果表明，菌株GD1−1为革兰阴性菌，不能分解纤维素、不能水解淀粉、不能产生脲酶、不能还原硝酸盐，能将明胶液化、能产生H₂S气体，具有脂酶活性。参照《常见细菌系统鉴定手册》^[11]发现，菌株GD1−1与伯克霍尔德菌属Burkholderia细菌的生理生化特性一致，将该菌初步鉴定为伯克霍尔德菌Burkholderia sp.。

经基因组DNA提取、PCR扩增和测序，并将其序列进行BLAST比对，结果表明：1)菌株GD1−1的16S rDNA基因序列长度为1424 bp，与洋葱伯克霍尔德菌B. contaminans (CP046609.1)和B. contaminans(CP028809.1)序列相似性均为100%；2)菌株GD1−1的GyrB基因序列长度为688 bp，与B. contaminans(CP009744.1)序列相似性为100%；3)菌株GD1−1的AtpD基因序列长度为707 bp，与B. contaminans(CP013390.1)和B. contaminans(CP009744.1)序列相似性为100%；4)菌株GD1−1的GltB基因序列长度为617 bp，与B. contaminans(CP009744.1)序列相似性为100%。基于多基因序列构建的系统发育树结果(图3)表明，菌株GD1−1与B. contaminans聚为一支。

图  3  基于16S rDNA、GyrB、AtpD和GltB基因序列构建的菌株GD1−1系统发育树

Figure  3.  Phylogentic tree of strain GD1-1 based on concatenated sequences of 16S rDNA, GyrB, AtpD and GltB genes

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综合形态特征、生理生化特性和分子生物学分析结果，菌株GD1−1被鉴定为洋葱伯克霍尔德菌B. contaminans。

2.4   拮抗菌GD1−1的生长曲线

采用稀释平板法对菌株GD1−1生长曲线进行测定，结果(图4)表明，菌株GD1−1的生长曲线分布：0~8 h为延迟期，8~16 h为对数生长期，16~24 h为稳定生长期，24 h后进入衰亡期；在20~24 h时，菌株GD1−1的活菌数可达到1×10¹³ CFU/mL。

图  4  菌株GD1−1在NA培养基中的生长曲线

Figure  4.  Growth curve of the strain GD1-1 in NA culture medium

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2.5   拮抗菌GD1−1的抑制作用

2.5.1   对Foc TR4菌丝生长的影响

采用平板对峙法，并对Foc TR4菌丝进行显微观察，结果表明，Foc TR4正常菌丝形态饱满，粗细均匀，细长而光滑，有很好的完整性和连续性，无明显断裂现象(图5A)；受菌株GD1−1影响的Foc TR4菌丝出现畸形，部分菌丝膨大变粗(图5B)。

图  5  菌株GD1−1抑制Foc TR4菌丝生长

A：Foc TR4正常菌丝形态；B：菌株GD1−1导致Foc TR4菌丝畸形。

Figure  5.  Inhibition of hyphal growth of Foc TR4 by the strain GD1-1

A: Normal mycelia of Foc TR4; B: Deformed mycelia of Foc TR4 treated with strain GD1-1.

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2.5.2   对Foc TR4分生孢子萌发的影响

将菌株GD1−1发酵上清液与Foc TR4分生孢子共培养，结果(图6)表明，正常Foc TR4分生孢子的萌发率为90.6%；受菌株GD1−1发酵上清液影响的Foc TR4分生孢子萌发率仅为1.5%，抑制率达到了99.8%。

图  6  菌株GD1−1抑制Foc TR4分生孢子萌发

柱子上不同小写字母表示处理间的差异显著(P<0.05，Duncan’s 法)。

Figure  6.  Inhibition of conidial germination of Foc TR4 by the strain GD1-1

Different lowercase letters on the pillar indicated significant difference between treatments (P<0.05, Duncan’s method).

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2.5.3   拮抗菌GD1−1的抑菌谱

以10种植物病原真菌为靶标菌，对菌株GD1−1的抑菌谱进行测定。结果(图7和表2)表明，菌株GD1−1对这10种植物病原真菌均有不同程度的抑制效果，抑制率均在66.0%以上；菌株GD1−1对尖孢镰刀菌番茄专化型、香蕉炭疽病菌、链格孢菌、腐皮镰刀菌的抑菌效果好，抑制率均在75.0%以上；对尖孢镰刀菌不同专化型的抑制效果存在差异，如对番茄专化型的抑制率为78.0%，但对苦瓜专化型仅为71.3%。表明菌株GD1−1具有较广的抑菌谱。

图  7  菌株GD1−1对不同植物病原真菌的平板对峙

Figure  7.  Antagonistic effects of strain GD1-1 on different phytopathogenic fungi

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表  2  菌株GD1−1对不同植物病原真菌的抑制作用

Table  2.  Inhibition of different phytopathogenic fungi by the strain GD1-1

病原菌 Pathogen	抑制率1)/% Inhibition rate		病原菌 Pathogen	抑制率1)/% Inhibition rate
尖孢镰刀菌番茄专化型 Fol	78.0±0.3a		香蕉枯萎病菌1号小种 Foc1	72.0±0.5bc
香蕉炭疽病菌 C. musae	77.9±0.3a		尖孢镰刀菌苦瓜专化型 Fom	71.3±0.3bc
链格孢菌 A. alternata	76.8±1.1a		变红镰刀菌 F. incarnatum	69.9±0.5cd
腐皮镰刀菌 F. solani	76.4±0.9a		多主棒孢菌 C. cassiicola	67.9±0.2de
尖孢镰刀菌冬瓜专化型 Fob	73.5±0.4b		禾谷镰刀菌 F. graminearum	66.1±2.6e
1)表中数据为平均值±标准误，不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s 法)。 　1) Values were the means ± SE and different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05, Duncan’s method).

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2.6   拮抗菌GD1−1对香蕉枯萎病的防效分析

采用室内盆栽试验法分析了拮抗菌GD1−1对香蕉枯萎病的防效。结果(图8)表明，仅用ddH₂O处理的巴西蕉植株生长正常，未表现任何异常症状；仅接种Foc TR4的巴西蕉植株叶片黄化，球茎变褐，表现出了典型的香蕉枯萎病症状；而用菌株GD1−1处理的巴西蕉植株黄化程度和球茎变褐面积明显减少。病情指数统计结果(图9)表明，Foc TR4处理的巴西蕉病情指数为80.75，而菌株GD1−1处理后的巴西蕉病情指数降至35.86，防治效果为55.6%。说明菌株GD1−1对香蕉枯萎病具有较好的防效。

图  8  香蕉枯萎病症状

Figure  8.  Disease symptoms of banana Fusarium wilt

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图  9  香蕉枯萎病病情指数

柱子上不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s 法)。

Figure  9.  Disease index of banana Fusarium wilt

Different lowercase letters on the pillar indicated significant difference (P<0.05, Duncan’s method).

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2.7   拮抗菌GD1−1对香蕉植株的促生作用

室内盆栽试验结果表明，与ddH₂O处理相比，菌株GD1−1可促进香蕉植株的生长(图10)，其鲜质量(图11A)和球茎直径(图11B)分别增加了48.8%和17.0%，说明菌株GD1−1对香蕉植株具有显著的促生作用。

图  10  香蕉苗生长情况

Figure  10.  The growth of banana seedlings

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图  11  香蕉苗鲜质量(A)和球茎直径(B)

柱子上不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s 法)。

Figure  11.  Seedling fresh weight (A) and corm diameter (B) of banana

Different lowercase letters on the pillar indicated significant difference (P<0.05, Duncan’s method).

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菌株GD1−1促生潜力分析结果(图12)表明，菌株GD1−1可在NKA培养基上生长，菌落周围有透明的油滴状出现，说明菌株GD1−1具有解钾能力；菌株GD1−1可在NPA培养基和牛奶培养基生长，且菌落周围都有透明圈，说明其具有分解无机磷和产蛋白酶的能力；菌株GD1−1在苯胺蓝−PDA培养基中没有褪色圈的出现，说明其不具有降解木质素的能力；菌株GD1−1能在CAS培养基生长，且菌落周围有明显的橘黄色分泌圈，说明具有产铁载体的能力。可见，菌株GD1−1具有明显的解钾、分解无机磷、产蛋白酶以及产铁载体的能力，说明其具有良好的生防潜力。

图  12  菌株GD1−1的促生潜力

A：NKA培养基；B：NPA培养基；C：牛奶培养基；D：苯胺蓝-PDA培养基；E：CAS培养基。

Figure  12.  The growth promoting potential of strain GD1-1

A: NKA medium; B: NPA medium; C: Milk medium; D: Aniline blue-PDA medium; E: CAS medium.

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3.   讨论与结论

植物根际土壤拥有大量的微生物，被称为植物的第2基因库，土壤中微生物资源丰富，是拮抗菌筛选的重要来源^[21]。本研究从健康香蕉植株根际土壤中分离筛选出了1株对Foc TR4具有良好抑制效果的菌株GD1−1；通过对其菌落形态、生理生化特征和多基因序列分析，将菌株GD1−1鉴定为洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia contaminans，该菌在后续的生防菌剂研发和应用中具有良好的定殖能力。

洋葱伯克霍尔德菌是一组表型相近但基因型不同的复合物，被称为洋葱伯克霍尔德菌群(B. cepacia complex, Bcc)^[22]，广泛分布于水、土壤和植物中。截至目前，已报道了该菌群对多种植物病害具有防治作用，如草莓灰霉病^[9]、桃褐腐病^[23]、甜樱桃褐腐病^[24]、红茎腐病^[25]、番茄枯萎病^[26]、黄瓜枯萎病^[27]等。本文证实菌株GD1−1对香蕉枯萎病的防效为55.6%，具有广谱的抑菌作用；但该菌株是否对其他植物真菌病害也具有防效，仍有待进一步研究。

本文研究发现菌株GD1−1可显著抑制Foc TR4菌丝生长，导致菌丝畸形，并显著抑制其分生孢子的萌发。分析菌株GD1−1的抑菌活性组分可以进一步揭示其抑菌机理。已有学者尝试分离纯化该菌发酵液研究洋葱伯克霍尔德菌的抑菌机理，如权春善等^[28]通过Sephadex-75pg、Sephacryl S-100柱层析分析纯化洋葱伯克霍尔德菌B. cepacia CF-66发酵液粗提液，获得抗菌物质CF66Ι，明确该物质非核酸和蛋白质是一种带酰胺键的新型抑菌化合物。也有学者利用代谢组学开展了洋葱伯克霍尔德菌的抑菌机理研究，发现该菌可产生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯、Cepaciamide A和Cepacidine A ^{[27, 29]}、吡咯硝啉、儿茶酚和麦角他胺^{[25, 28]}等多种抑菌活性的次生代谢产物。宫安东等^[30]采用气相色谱串接质谱法对吡咯伯克霍尔德菌 B. pyrrocinia WY6-5的挥发性抑菌物质进行了分析，鉴定其活性物质为二甲基二硫，可抑制禾谷镰刀菌F. graminearum、链格孢菌A. alternata等8种植物病原真菌的生长。Wang等^[31]通过HPLC技术，分离鉴定了伯克霍尔德菌B. pyrrocinia菌株Lyc2的抑菌活性物质为Occidiofungin。

细菌的产铁载体能力是一个很重要的防病促生指标，通过螯合土壤中的铁来改善自身营养状况，也可以供给植物利用，还能与病原微生物竞争铁，以达到防病促生的目的^[32-33]。章嘉会等^[34]研究发现，洋葱伯克霍尔德菌菌株JK−1和越南伯克霍尔德菌B. vietnamiensis菌株JK−4具有产铁载体的能力和广谱抑菌活性，对小麦和黄瓜种子萌发具有显著促生作用。王贻莲等^[35]研究发现越南伯克霍尔德菌菌株B418具有固氮、解磷、解钾等能力和促生作用，对根结线虫病害具有良好防效。本文研究发现菌株GD1−1不仅对香蕉枯萎病具有良好的防效和较广的抑菌谱，而且具有解磷、解钾、产蛋白酶、产铁载体能力，对香蕉具有促生作用；菌株GD1−1对香蕉枯萎病具有良好的生防潜力和开发前景。