A fast method for detecting Salmonella enteritidis based on PCR-CRISPR/Cas12a
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摘要:目的
针对食源性病原菌肠炎沙门菌Salmonella enteritidis，开发一种CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)技术结合聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)的检测方法，以实现肠炎沙门菌的早期快速诊断和防控。
方法根据保守基因sdfI序列，进行PCR引物筛选。使用不同质量浓度的肠炎沙门菌基因组进行灵敏度测试；利用大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida、粪肠球菌Salmonella choleraesuis、猪霍乱沙门氏菌Enterococcus faecalis基因组进行特异性检验。最后，使用建立的方法检测小肠样品中肠炎沙门菌的污染情况。
结果该方法可检出小肠样品中的肠炎沙门菌，检测限为1.72 × 100 μL−1，特异性良好，且与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、粪肠球菌、猪霍乱沙门氏菌均无交叉反应。
结论本研究建立了一种较为轻便、可用于早期诊断肠炎沙门菌的方法，具有良好的灵敏度和特异性，为肠炎沙门菌快速诊断提供了新方法。
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关键词:
- 肠炎沙门菌 /
- sdfI基因 /
- 聚合酶链式反应 /
- CRISPR/Cas12a系统
Abstract:ObjectiveTo realize early detection, prevention and control of Salmonella enteritidis, a detection method was established by combining CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat) technology with polymerase chain reaction (PCR).
MethodPCR primers were screened based on the conserved sdfI gene sequence. The sensitivity test was conducted using S. enteritidis genomes at different concentrations, while the specificity tests were conducted using the genomes of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis and Enterococcus faecalis. Subsequently, the developed method was applied for the detection of S. enteritidis in small intestinal samples.
ResultThis method was capable of identifying S. enteritidis in small intestinal samples, with a detection limit of 1.72 × 100 μL−1, showing excellent specificity and no cross-reactivity with E. coli, S. aureus, P. multocida, S. choleraesuis and E. faecalis.
ConclusionThis study develops a compact diagnostic method for the early detection of S. enteritidis, showing excellent sensitivity and specificity. This innovation presents a fresh perspective for the swift identification of S. enteritidis.
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Keywords:
- Salmonella enteritidis /
- sdfI gene /
- PCR /
- CRISPR/Cas12a system
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聚乳酸(Polylactic acid, PLA)是一种生物可降解聚合物材料，是以含糖、淀粉、纤维素等生物质材料为原料，经发酵制成乳酸，再由乳酸聚合而成的高分子材料。PLA在熔融状态下具有良好的流变性和优异的可加工性，这奠定了PLA在熔融沉积型3D打印材料中的主导地位。但PLA脆性大、亲水性差以及降解物呈酸性等不足，依然限制着其在生物医学领域的应用。将聚合物如聚己内酯(Polycaprolactone, PCL)[1-2]、聚丙烯(Polypropylene, PP)[3]、无机粒子如羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)[4]等引入PLA的熔融共混过程，有利于改善上述情况。在组织工程支架的构建中，100~1000 µm的大孔有助于细胞向支架内生长，有利于血管形成及骨骼向内生长；而1~10 µm的微孔则有利于细胞黏附与发育[5]。可见，制备含有微孔结构的支架对组织修复是极其有益的。通过在钛管中积累羟基磷灰石球体制备多孔生物陶瓷支架，虽然能构建出直径小于10 µm的丰富微孔，但该方法很难满足支架的个性化制造[6-7]。将高度个性化的3D打印技术与发泡技术相结合制备含微孔支架存在操作过程繁杂、稳定性差、机械性能差异大及重复性低等不足[8-9]。而冷冻干燥与溶出结合的制备方法虽操作简单，但易导致孔洞分散不均，缺乏孔隙内连接，同时受成型方式及造孔机理的制约，此方法成型单一，难以制造厚支架，不利于组织工程的实际应用[10-11]。为此，针对以上不足，在相关研究基础上[12-13]，本研究将PCL用于增韧PLA/HA复合材料，通过在PLA/HA/PCL复合材料中添加发泡剂偶氮二甲酰胺(Azodicarbonamide, ADC)或制孔剂氯化钠(Sodium chloride, NaCl)，采用熔融共混并挤出拉丝制备生物基3D打印用标准线材[ 直径为(1.75±0.05) mm]，系统探究生物基PLA复合材料通过熔融沉积型3D打印构建含微孔支架的可行性。
1. 材料与方法
1.1 试剂及仪器
聚乳酸(PLA)，4032D，美国NatureWorks公司；聚己内酯(PCL)，capa6500，瑞典Perstorp公司；w为99%的纳米级羟基磷灰石(HA)，西安通泽生物科技有限公司；氯化钠(NaCl)，过200目筛，国药集团化学试剂有限公司；偶氮二甲酰胺(ADC)，西亚化学科技(山东)有限公司；小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stemcells, BMSCs)，CRL12424，美国ATCC；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、DMEM培养基、磷酸盐缓冲液，美国Gibco公司；钙黄绿AM(Calcein-AM)、碘化丙啶(PropidiumIodide, PI)，日本同仁化学研究所。
双螺杆挤出机，SHJ-20B，南京杰恩特机电有限公司；3D打印耗材生产线，MESI-25，广州市普同实验分析仪器有限公司；桌面式3D打印机，FS-200，广州飞胜智能科技股份有限公司；万能电子测试仪，UTM4204，深圳新三思纵横科技股份有限公司；热重分析仪，TG209F1LibraTM，德国耐驰仪器制造有限公司；差示扫描量热仪，DSC8000，英国Polymer Laboratories公司；扫描式电子显微镜，EVO MA 15，美国珀金埃尔默公司；共聚焦显微镜，TCS SP-8，德国徕卡公司。
1.2 含NaCl或ADC的PLA复合材料线材制备
参照前期试验及研究结果[14-15]，以PLA和HA质量比为9∶1，增韧相PCL的质量分数固定为15%，熔融共混后得PLA/HA/PCL复合材料，作为空白样，标记为PHAP。再分别将制孔剂NaCl、发泡剂ADC与PLA/HA/PCL进行熔融共混，其中NaCl按照10%、20%、30%和40%的质量分数添加，分别标记为10%NaCl-PHAP、20%NaCl-PHAP、30%NaCl-PHAP和40%NaCl-PHAP；ADC按照0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的质量分数添加，分别标记为0.2%ADC-PHAP、0.4%ADC-PHAP、0.6%ADC-PHAP和0.8%ADC-PHAP。上述复合材料样品均先通过双螺杆挤出机进行熔融挤出、造粒，最后再经过3D打印耗材生产线制备出直径为(1.75 ± 0.05) mm的3D打印线材，螺杆转速为25 r/min，螺杆各温区温度分别为185、190、190和185 ℃。
1.3 PLA复合材料3D打印支架制备
将所制备的线材用于桌面式3D打印机，实现各支架的个性化打印。其中，支架模型设计为带正六边形(蜂窝状)孔径的圆柱形支架，支架的直径为20 mm、高度10 mm，正六边形(蜂窝)的边长为1.5 mm。
1.4 PLA复合材料线材热性能表征
热重测试(Thermogravimetric analysis, TG)在氮气氛围下，程序以20 ℃/min的升温速率从35 ℃升温到600 ℃进行，先将样品进行为期3 d的浸泡溶出试验，每8 h换1次水，烘干后分别取2~5 mg复合材料线材进行测试。θ0为起始分解温度，θmax为最大降解速率温度，θend为终止分解温度。试验同时记录微商热重分析(Derivative thermogravimetry, DTG)结果。
采用差示扫描量热仪(Differential scanning calorimet, DSC)开展热性能测试时，取5~10 mg样品装于铝坩埚中，再用标准压片机对坩埚进行密封。程序第1次加热扫描从50 ℃到200 ℃，为了消除热历史，程序在200 ℃下保温5 min，冷却后再进行第2次升温扫描，记录材料的玻璃化温度(θg)、熔融温度(θm)、最大转变峰、熔融焓(ΔΗm)、结晶度(Xc)。其中，结晶度由如下公式计算：
$$ {{X}}_{\text{c}}\text=\frac{\text{Δ}{{H}}_{\text{m}}}{{w\Delta }{{H}}_{\text{m}}^{\text{°}} {{}}{\text{}}} \text{，} $$ (1) 式中，
$\Delta H_{\rm{m}}^{\text{°}} $ 指的是PLA 100%结晶的熔融焓，$ {w} $ 是复合材料中PLA的质量分数。$ \Delta {H}_{{\rm{m}}}^{°} $ 的值为93.7 J·g−1[16]。1.5 PLA复合材料3D打印支架表面形貌测试
利用扫描电子显微镜在电场加速电压为5.00 kV，电流为25 pA的环境下，观察蜂窝状支架表面形貌。试验截取固定高度的蜂窝支架，侧贴在导电胶上，通过导电胶包围支架进一步固定后观察支架形貌，并截取图片。
1.6 PLA复合材料3D打印支架孔隙率测试
根据液体置换法测量支架的孔隙率(P)，用无水乙醇作为进入支架孔的运动流体。计算如下所示：
$$ P=(V_{1}–V_{3})/(V_{2}–V_{3}) \times 100{\text{{{\% }}}}, $$ (2) 式中，V1为初始乙醇的体积，V2为多孔支架与乙醇充分接触后的体积，V3为取出支架后剩余乙醇的体积。每组样品进行5个平行样的测定，取平均值进行绘图统计。
1.7 PLA复合材料3D打印支架力学性能测试
压缩试验从应力−应变图获得支架的机械性能，包括应力、应变对应关系等，测试样品是直径与厚度为2∶1的圆形脚手架，20 kN称重传感器以2 mm/min的压缩速度施加载荷。重复5次平行试验获取平均值。
1.8 PLA复合材料3D打印支架细胞毒性测试
将BMSCs培养在添加10%(φ)FBS溶液的DMEM培养基中。将材料置于12孔板中，加入75% (φ)乙醇溶液浸泡2 h后, 用无菌PBS清洗3次，然后加入细胞培养液浸泡12 h后，将20 μL细胞悬液(每孔3×104)接种到材料上，2 h后加入500 μL完全培养基，置于37 ℃、5% (φ)CO2细胞培养箱中培养48 h后取样，PBS漂洗，再加入Calcein-AM和PI，避光孵育25 min后，PBS漂洗1次，最后利用共聚焦显微镜观察材料表面细胞活性并采集图片。采用Image J软件统计不同样品图片中的细胞存活和死亡的数量。
1.9 数据分析
采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析。假定方差齐性，组间两两比较采用LSD法检验；未假定方差齐性，组间两两比较采用Tamhane’s T2检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 含NaCl或ADC的PLA复合材料线材及其3D打印支架形态特征
将水溶性NaCl、发泡剂ADC分别与PLA复合材料熔融共混加工，得到如图1所示的系列3D打印线材，由图1可知，0.6%ADC-PHAP、0.8%ADC-PHAP的线材略显淡黄色，其他线材均呈白色，此外，0.8%ADC-PHAP出现明显的膨胀、弯曲现象，不适用于3D打印，其他复合材料粗细均匀、表面光滑，具备3D打印条件。
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图 1 用于制备3D打印支架的线材Figure 1. Wires used for scaffolds preparation by 3D printinga: PHAP; b: 10%NaCl-PHAP; c: 20%NaCl-PHAP; d: 30%NaCl-PHAP; e: 40%NaCl-PHAP; f: 0.2%ADC-PHAP; g: 0.4%ADC-PHAP; h: 0.6%ADC-PHAP; i: 0.8%ADC-PHAP图2分别是由40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP线材打印的蜂窝状支架实物，这2种复合材料的3D打印成型效果优异，其中，40%NaCl-PHAP支架的孔径均匀，支架呈白色；而0.6%ADC-PHAP支架略微膨胀，显淡黄色。为了更有效地探究含微孔支架的构建情况，在后续研究中，重点讨论制孔剂、发泡剂添加量较高的40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-HAPP样品，同时，试验以10%NaCl-PHAP和0.2%ADC-PHAP作为对比样，PHAP为空白参照样。
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图 2 3D打印蜂窝结构支架实物图Figure 2. Physical images of 3D printed scaffolds with honeycomb structure2.2 PLA复合材料的热性能
图3为聚乳酸复合材料的TG和DTG曲线图，由TG图(图3a)可知，在试验加工温度下，复合材料均具有良好的热稳定性。但NaCl或ADC的加入，均使复合材料的初始热分解温度降低，且存在ADC的复合材料初始热分解温度进一步降低的情况。表1列出了复合材料的热降解具体数值，相较PHAP空白样，含ADC质量分数为0.6%的复合材料的初始分解温度降低了约35 ℃，这可能是由于发泡材料孔内存在的氧气促进了PLA基质的热分解，而0.6%ADC-PHAP产生的孔洞更丰富，比表面积更大，与氧气的接触面增大，反应活性更高，因此其初始热分解温度比0.2%ADC-PHAP复合材料更低[17]，这一结果与Abu Hassan等[18]的发现一致。残余量数值显示，浸出3 d后，NaCl被部分去除，10%NaCl-PHAP、40%NaCl-PHAP复合材料的残余量分别达到17.26%(理论残余率17.65%，其中，NaCl 10%、HA 7.65%)和37.96%(理论残余率45.10%，其中，NaCl 40%、HA 5.10%)，对比不同NaCl添加量的复合材料残余率可知，当添加的NaCl质量分数达到40%时，整体材料的质量损失率最大。这是因为NaCl的添加量越多，聚合物内可形成连续的晶粒状，易于被水溶出，而当NaCl的添加量较少时，晶粒周围被高聚物紧密包裹，无法被水洗出，所以当NaCl的添加量越低时，其热重残余率越逼近理论残余率。
表 1 PLA复合材料热降解数值统计Table 1. Numerical statistics of thermal degradation of PLA composites样品 Sample θ0/℃ θmax1(θmax2)/℃ θend/℃ 残余量/% Residue PHAP 344.4 363.4 377.5 6.03 10%NaCl-PHAP 336.1 355.4(399.9) 374.9 17.26 40%NaCl-PHAP 328.5 348.1(397.8) 368.5 37.96 0.2%ADC-PHAP 310.5 332.9(390.0) 367.4 10.72 0.6%ADC-PHAP 309.0 336.7(390.3) 373.4 5.82 PLA复合材料的DSC升温曲线如图4所示，与之对应的DSC测试数值结果如表2所示。在相同的加工条件下，含制孔剂NaCl的复合材料的θg和θm变化不大，添加发泡剂ADC的质量分数达到0.2%时，0.2%ADC-PHAP复合材料的玻璃化转变温度比空白样PHAP提高了4 ℃。NaCl、ADC的加入，均使复合材料的熔融焓下降。从图4观察到0.6%ADC-PHAP出现2个熔融峰，这意味着聚合物中存在不同形式的晶体。可见，发泡剂对0.2%ADC-PHAP、0.6%ADC-PHAP复合材料中晶体结构的形成有影响。具有较低熔融温度的晶体可能与在冷结晶期间形成的较小晶粒有关，而具有较高熔融温度的晶体是在一次结晶过程中所形成的微晶[19]。
表 2 PLA复合材料的DSC测试结果Table 2. DSC test results of PLA composites样品
Sample玻璃化温度(θg)/℃
Glass transition temperature熔融温度(θm)/℃
Melting temperature熔融焓(ΔΗm)/(J·g−1)
Melting enthalpy结晶度(Xc)/%
CrystallinityPHAP 56.23 167.53 27.06 37.75 10%NaCl-PHAP 56.04 167.66 26.44 40.98 40%NaCl-PHAP 56.79 167.50 22.28 51.80 0.2%ADC-PHAP 60.89 167.77 22.43 31.35 0.6%ADC-PHAP 56.16 167.89 21.69 30.44 2.3 3D打印支架的微观形貌分析
图5分别为PHAP、40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP复合材料构造的3D打印蜂窝结构支架扫描电镜图。由图5可知，PHAP复合材料打印的蜂窝状支架表面光滑，表面均匀分散的白点为复合材料中分散的羟基磷灰石。分别由40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP复合材料构建的蜂窝状支架表面更粗糙，其中，40%NaCl-PHA支架表面存在立方状孔洞，这是由于聚合物中正八面体的NaCl晶体溶出后留下的，但类似孔洞并不丰富。由此可知，40%NaCl-PHAP支架中仍残留大量被高聚物包裹的NaCl，这些NaCl留在支架内部无法被水溶出。0.6%ADC-PHAP复合材料构建的蜂窝状支架表面存在大小均匀的球状孔洞结构，该支架的大部分孔径直径范围为10~50 μm，张学盈等[20]在探究偶氮二甲酰胺对聚氯乙烯发泡材料性能的影响中也有类似的观察。从SEM图(图5)还可以观察到直径小于5 μm的孔洞，因此，由Zhou等[5]的统计可知，这些孔洞对细胞黏附和发育更有利。可见，ADC质量分数为0.6%的0.6%ADC-PHAP复合材料可通过3D打印技术，制备出富含微孔的支架。
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图 5 PLA复合材料3D打印支架SEM图a1、 a2: PHAP; b1、 b2: 40%NaCl-PHAP;c1、c2: 0.6%ADC-PHAP, a2、b2、 c2为a1、b1、 c1的局部放大图Figure 5. SEM image of PLA composites 3D printed scaffolda1, a2: PHAP; b1, b2: 40%NaCl-PHAP;c1, c2: 0.6%ADC-PHAP, a2, b2 and c2 are partial enlarged views of a1, b1, c1, respectively2.4 3D打印支架的孔隙率分析
图6 为3D打印PHAP、10%NaCl-PHAP、40%NaCl-PHAP、0.2%ADC-PHAP和0.6%ADC-HAPP支架的孔隙率统计结果。由图6可知，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-HAPP 2种支架具有更高的孔隙率，分别达到62.78%和63.33%，结合图5的SEM图可知，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-HAPP 2种支架上存在的微孔一定程度上提高了支架对乙醇的吸附性能，使得二者的孔隙率测试结果均高于PHAP、10%NaCl-PHAP和0.2%ADC-PHAP这3种支架。对各支架的孔隙率进行差异显著性分析，发现40%NaCl-PHAP的孔隙率显著高于PHAP、10%NaCl-PHAP支架(P<0.05)，0.6%ADC-HAP支架的孔隙率极显著高于PHAP和0.2%ADC-PHAP支架的(P<0.01)。
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图 6 PLA复合材料3D打印支架孔隙率“*”“**”分别表示0.05、0.01水平的差异显著（ LSD法)Figure 6. Porosity of PLA composites 3D printed scaffold“*”and“**”represent significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively( LSD method)2.5 3D打印支架的压缩性能分析
图7是3D打印蜂窝结构支架的力学试验结果。由压缩应力、应变曲线可以看出，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP 2种支架在应变达到35%之后，曲线出现较为明显的波动，这是内部结构出现坍塌的结果，当应变达到65%之后，应力开始急剧上升，这是由支架结构致密化导致的结果。在压缩应变为80%时，PHAP、10%NaCl-PHAP和40%NaCl-PHAP 3种支架的压缩应力分别为67.15、60.75和52.11 MPa，当添加的ADC的质量分数为0.2%时，支架相应的压缩应力与PHAP支架相差不大，达到了67.34 MPa，但随着ADC质量分数的进一步提高，0.6%ADC-PHAP支架的压缩应力仅为45.27 MPa。结合图5支架的SEM可知，相比空白样品PHAP支架，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP 2种支架的力学性能减弱是支架微孔化引起的不良结果。
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图 7 PLA复合材料3D打印支架压缩性能Figure 7. Compression performance of 3D printed scaffold using PLA composites2.6 3D打印支架对细胞黏附的影响
图8为PHAP、40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP 3种3D打印支架在共聚焦显微镜下观察到的BMSCs细胞染色图。在进行细胞染色试验之前，将含NaCl的样品进行了为期3 d的浸泡溶出试验。由图8可知，在同样的操作条件下，40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP 2种支架表面观察到的细胞数量明显比PHAP支架多，这是因为含微孔的支架表面的粗糙度提高了。同时，由SEM图(图5)观察到小于10 μm的微孔，也对细胞的黏附起到积极作用。在40%NaCl-PHAP支架上观察到较多的红色细胞，PHAP和0.6%ADC-PHAP 2种支架表面基本没有观察到红色，可见含NaCl的支架不利于细胞的成长。对比发现，0.6%ADC-PHAP支架表现出较高的细胞活性，是更具应用潜力的含微孔支架。计数结果(图9)显示，PHAP、40%NaCl-PHAP和0.6%ADC-PHAP支架的细胞存活率分别为(98.60±0.43)%、(88.49±1.02)%和(99.06±0.16)%, 40%NaCl-PHAP支架的细胞存活率极显著低于PHAP、0.6%ADC-PHAP支架的(P<0.01)。
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图 8 3D打印支架接种BMSC细胞染色的共聚焦显微镜照片图中，绿色为活细胞，红色为死细胞Figure 8. Confocal microscope photo of 3D printed scaffold inoculated with BMSC cellsIn the figure, green cells are live cells, red cells are dead cells![]()
图 9 3D打印支架接种BMSC细胞的存活率“**”表示0.01水平的差异显著(n=3,Tamhane法)Figure 9. Cell survival statistics of live/dead staining of 3D printed scaffold inoculated with BMSC cells“**” means significant difference at 0.01 level (n=3, Tamhane method)3. 结论
本研究发现，含NaCl或ADC的PLA复合材料线材适用于熔融沉积型3D打印，可用于制备含微孔支架。NaCl或ADC的加入，均使得PLA复合材料的初始分解温度降低，0.6%ADC-PHAP复合材料的初始分解温度比40%NaCl-PHAP复合材料低19.5 ℃，比空白样PHAP低35 ℃。所构建的0.6%ADC-PHAP支架力学性能虽有所减弱，但其孔隙率比空白样高，达到63.33%，差异具有统计学意义。同时，该支架除了含有直径为10~50 μm的微孔之外，还存在有利于细胞黏附的、直径小于5 μm的孔洞。所构建的0.6%ADC-PHAP支架比40%NaCl-PHAP支架表现出更好的细胞存活率，在组织工程中具有较好的应用潜力。
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图 1 PCR-CRISPR/Cas12a检测方法的定量评价
“*” “**” “***”分别表示处理与阴性对照(CK)在0.05、0.01、0.001水平差异显著(t检验)。
Figure 1. Quantitative evaluation of PCR-CRISPR/Cas12a detection method
“*” “**” “***” indicate significant differences between treatment and the negative control at the 0.05, 0.01, and 0.001 levels, respectively(t test).
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图 2 PCR灵敏度检测
M：DL500 DNA Marker，1~11表示肠炎沙门菌基因组含量分别为1.72×108、1.72×107、1.72×106、1.72×105、1.72×104、1.72×103、1.72×102、1.72×101、1.72×100、1.72×10−1和1.72×10−2 μL−1。
Figure 2. Sensitivity detection of PCR
M：DL500 DNA Marker, 1-11 indicate that the genome content of Salmonella enteritidis is 1.72×108, 1.72×107, 1.72×106, 1.72×105, 1.72×104, 1.72×103, 1.72×102, 1.72×101, 1.72×100, 1.72×10−1 and 1.72×10−2 μL−1.
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图 3 PCR特异性检测
M：DL500 DNA Marker，1~6分别为肠炎沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌和粪肠球菌，CK为阴性对照。
Figure 3. Specificity detection of PCR
M：DL500 DNA Marker, 1: Salmonella enteritidis, 2: Escherichia coli, 3: Staphylococcus aureus, 4: Pasteurella multocida, 5: Enterococcus faecalis, 6: Salmonella choleraesuis, CK: Negative control.
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图 4 CRISPR/Cas12a特异性检测
1~6分别为肠炎沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌和粪肠球菌，CK为阴性对照；“***”表示菌株与阴性对照(CK)在0.001水平差异显著(t检验)。
Figure 4. Specificity detection of CRISPR/Cas12a
1: Salmonella enteritidis, 2: Escherichia coli, 3: Staphylococcus aureus, 4: Pasteurella multocida, 5: Enterococcus faecalis, 6: Salmonella choleraesuis, CK: Negative control; “***” indicate significant difference between treatment and the negative control at 0.001 level (t test).
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图 5 PCR-CRISPR/Cas12a联合检测方法的应用
“*”表示编号4、13、20、21、37、38的样品与阴性对照(CK)差异显著(P<0.05，t检验)，表明有肠炎沙门菌污染现象。
Figure 5. Application of the PCR-CRISPR/Cas12a combined assay method
“*” indicates that the samples with code 4, 13, 20, 21, 37 and 38 were significantly different from the negative control, indicating that these samples were infected with Salmonella enteritidis.
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图 6 PCR检测禽小肠样本肠炎沙门菌的污染情况
M：DL500 DNA Marker; “+”“−”分别表示阳性和阴性对照；样品4、13、20、21、37、38检出肠炎沙门菌污染。
Figure 6. Detection of Salmonella enteritidis in small intestine samples by PCR
M：DL500 DNA Marker; “+” “−” indicate positive control and negative control; The samples with code 4, 13, 20, 21, 37 and 38 were infected with Salmonella enteritidis.
表 1 PCR和crRNA引物设计
Table 1 Design of PCR primers and crRNA primers
引物名称
Primer name引物序列(5′→3′)
Primer sequenceSe F1 GCGGTTTGATGTGGTTGG Se F2 GGGGAGGGAGGAGCTTTA Se F3 CCTTGACGCTGATACAGATA Se F4 CGAGCATGTTCTGGAAAG Se R1 TGGCTGGCGAATGGTGAG Se R2 TGGCGCGTTATATTTGTCAT Se R3 AGGTGGTGGCTGGCGAAT Se R4 CAGACAACAGGCTGATTTA Se R5 AACATGCTCGCTGCACAA Se R6 AAGAGTTACGACCGGATTTG crRNA1-262fw UAAUUUCUACUAAGUGUAG
AUGUAAAUCAGCCUGUUGUCUGcrRNA2-207fw UAAUUUCUACUAAGUGUAG
AUCAGAACAUGCUCGCUGCACAAcrRNA3-177rev UAAUUUCUACUAAGUGUAG
AUAGCCGGUCAAUGAGUUUUUCU
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