Water quality assessment and economic benefit evaluation of integrated rice-red crayfish cultivation system under different stocking densities
-
摘要:目的
比较不同放养密度稻虾综合种养模式与传统水稻单作模式的水体环境质量及经济效益，探索洞庭湖区稻虾种养的科学模式。
方法采用小区试验的方法，共设置3个处理：放养密度为300 kg·hm−2的低密度稻虾处理、放养密度为375 kg·hm−2的高密度稻虾处理和水稻单作处理。分别在水稻不同生长时期进行水样采集和理化性质分析，采用综合水质指数评价法对3种模式进行水体质量评价，同时比较不同模式的经济效益。
结果溶解性总固体含量、pH、NH4+−N含量、化学需氧量和溶解氧含量这5项水体理化指标是田间水质变化的主要影响因素。在成熟期，相较于低密度稻虾处理虾沟水体，高密度稻虾处理虾沟水体总N含量显著提升10.5%（P<0.05），总P含量上升3.6%，化学需氧量显著提升26.2%（P<0.05）。在水稻成熟期，低密度稻虾处理水体质量指数达到0.72，显著高于高密度稻虾处理（P<0.05）。成本和收益计算结果显示，稻虾综合种养模式的经济效益较水稻单作模式提升6~9倍，且低密度稻虾处理的经济效益是高密度稻虾处理的1.47倍。
结论在稻虾综合种养模式中选择合适的虾养殖密度，可有效降低农业面源污染、提高稻田经济效益和环境效益，具有较好的推广潜力。以上研究结果为洞庭湖区农业面源污染防治措施制定提供了数据支撑。
Abstract:ObjectiveTo compare the water environment quality and economic benefits of rice-red crayfish integrated cultivation model under different stocking densities and traditional rice monocropping model, and explore the scientific model of rice-red crayfish cultivation in Dongting Lake area.
MethodUsing the method of plot experiment, three treatments were set up: Low density rice-red crayfish treatment with stocking density of 300 kg·hm−2, high density rice-red crayfish treatment with stocking density of 375 kg·hm−2 and rice monocropping treatment. Water samples were collected and their physico-chemical properties were analyzed at different growth stages of rice. Comprehensive water quality index evaluation method was used to evaluate the water quality of three models, and the economic benefits of different models were compared.
ResultTotal dissolved solid content, pH, NH4+-N content, chemical oxygen demand, and dissolved oxygen content were the primary five factors affecting water quality changes. At ripening stage, compared to the ditch water of low density rice-red cayfish theatment, the ditch water of high density rice-red cayfish treatment showed increases of total N content by 10.5% (P<0.05), total P content by 3.6%, and chemical oxygen demand by 26.2% (P<0.05). At rice ripening stage, the water quality index of the low density rice-red cayfish treatment reached 0.72, significantly higher than that of high density rice-red cayfish treatment (P<0.05). The cost and benefit calculations showed that the integrated rice-crayfish model’s economic benefits were 6−9 times higher than that of rice monocropping model, and low density rice-red cayfish’s economic benefits were 1.47 times of high density rice-red cayfish treatment.
ConclusionThe suitable breeding density of red crayfish can effectively reduce the pollution of agricultural non-point sources, significantly increase the economic and envrionment benefits of rice fields, and have a good popularization potential. These findings provide a data support for formulating measures to prevent agricultural non-point source pollution in the Dongting Lake region.
-
碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)已构成全球公共卫生威胁[1-2] ，其主要耐药机制是携带碳青霉烯酶基因blaKPC，其中，在临床CRKP中，Klebsiella pneumoniae carbapenemase-2 (KPC-2)亚型最为普遍，可以水解所有已知的β−内酰胺类药物，包括碳青霉烯类[3]。blaKPC-2基因通常编码在可转移质粒的转座子结构中，特别是在肠杆菌科细菌中广泛流行的IncFII质粒，这使得blaKPC-2能够从克雷伯菌传播到其他肠杆菌科细菌，包括大肠埃希菌Escherichia coli[4]。
有关研究发现，大多数产KPC-2肺炎克雷伯菌菌株对美罗培南高度耐药(8≤MIC≤256 mg/L)[5-6]。然而，在部分对美罗培南高度耐药的产KPC-2肺炎克雷伯菌中，当携带blaKPC-2的质粒从肺炎克雷伯菌供体菌转移到大肠埃希菌受体中时，获得的携带blaKPC-2质粒的接合子对美罗培南表现出低水平耐药(MIC<1 mg/L)[7-9]。值得注意的是，这些携带blaKPC-2质粒的复制子呈现多样性，包括IncFII、IncFIB和IncHIB等，同时，这些携带blaKPC-2质粒的肺炎克雷伯菌供体菌的多位点序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)类型也呈现多样性，包括ST11、ST76、ST147和ST273等，这暗示了肺炎克雷伯菌中携带blaKPC-2质粒转移至大肠埃希菌后介导美罗培南低水平耐药的现象较为普遍。另外，还发现产KPC大肠埃希菌野生菌对美罗培南具有高度耐药性(MIC≥8 mg/L)，然而，其携带blaKPC-2质粒转移至美罗培南敏感的大肠埃希菌受体菌后，携带blaKPC-2质粒仍然在大肠埃希菌中介导美罗培南低水平耐药(MIC<1 mg/L)[10-12]。此外，还发现产气单胞菌菌株中携带blaKPC-2的IncP-6质粒转移至大肠埃希菌DH10B受体菌后，该质粒介导美罗培南低水平耐药(MIC=0.125 mg/L)[13]。然而，大肠埃希菌质粒携带的blaKPC-2基因介导对美罗培南低水平耐药的潜在机制仍不清楚。
华南农业大学兽医药理与毒理学课题组前期报道了一株分离自青海湖野生候鸟且对美罗培南耐药(MIC=64 mg/L)的ST11 CRKP(21QH43K)，其携带blaKPC-2基因，位于可转移的IncFII质粒(p21QH43K-KPC)上[3]。将该质粒通过接合转移的方式转入大肠埃希菌EC600中，发现接合子EC600/p21QH43K-KPC对美罗培南表现出低水平耐药(MIC=0.25 mg/L)。在临床上这类低水平碳青霉烯耐药大肠埃希菌无法被常规耐药筛查(临床折点通常设定阈值≥2 mg/L)有效识别而易被忽略，其可能通过水平基因转移持续释放blaKPC-2等关键耐药基因。因此，为预防这一重要耐药基因向其他菌种传播，肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶基因调控低水平耐碳青霉烯类抗生素的分子机制亟待进一步研究。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
本研究使用的所有菌株列于表1。CRKP菌株21QH43K分离自2020年青海省青海湖候鸟粪便样品，经二、三代混合测序，获得携带blaKPC-2基因的IncFII质粒p21QH43K-KPC完整序列，通过接合转移获得接合子EC600/p21QH43K-KPC。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922，大肠埃希菌标准菌株：EC600和MG1655，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
表 1 本研究使用的菌株和质粒Table 1. Strains and plasmids used in this study类型 Type 名称 Name 用途 Purpose 菌株 Strain 21QH43K 临床菌 21QH43K ATCC700603 肺炎克雷伯菌工程菌 ∆ompR ompR基因敲除菌 ∆ompC ompC基因敲除菌 ∆ompF ompF基因敲除菌 ∆blaKPC-2 blaKPC-2基因敲除菌 ∆ltrA ltrA基因敲除菌 ∆iron iron基因敲除菌 E. coli DH5α 用于构建质粒的菌株 WM3064 用于基因敲除的工程菌 E. coli 600 用于接合转移的工程菌 MG1655 用于接合转移的工程菌 BL21 用于蛋白表达的菌株 质粒 Plasmid pSGKP-tet 用于基因敲除的工程质粒 pCasKP-APR 用于基因敲除的工程质粒 pSZU-Apr 用于基因敲除的工程质粒 pluxCDABE 用于验证blaKPC基因启动子活性的工程质粒 pGEN-APR 用于克隆blaKPC基因的工程质粒 pET28a (+)-kan 用于OmpR蛋白表达的工程质粒 1.1.2 试剂与药品
细菌DNA提取试剂盒和同源重组酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；LB肉汤/琼脂培养基、水解酪蛋白胨(Mueller Hinton, MH)肉汤/琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，购自广州环凯微生物科技有限公司；DNA marker DL2000和Premix Taq为TaKaRa公司产品；受试药物美罗培南(Meropenem, MEM)、亚胺培南(Imipenem, IMP)、厄他培南(Ertapenem, ERT)、磷霉素(Fosfomycin, FOS)、阿米卡星(Amikacin, AMK)、头孢噻肟(Cefotaxime, CTX)、头孢西丁(Cefoxetine, FOX)、氨苄西林(Ampicillin, AMP)、头孢他啶(Ceftazidime, CAZ)、四环素(Tetracycline, TET)、氨曲南(Aztreonam, ATM)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、链霉素(Streptomycin, STR)、安普霉素(Apramycin, APR)、利福平(Rifampicin, RIF)购自赛默飞科技公司；L−阿拉伯糖购自默克Sigma公司；RNA提取试剂盒购自北京百奥创新科技有限公司；iScript cDNA合成试剂盒购自Bio-Rad公司；试验所用引物列于表2。
表 2 本研究使用的PCR引物Table 2. PCR primers used in this study试验 Test 引物 Primer 引物序列 (5'→3') Primer sequence RT-qPCR KPC-qPCR-F ccactgggcgcgcacctatt KPC-qPCR-R tgttaggcgcccgggtgtag 16S-F cctacgggaggcagcag 16S-R attaccgcggctgctgg 敲除blaKPC-2 KPC-N20-F ttgggcgtcaacgggcagtagttttagagctagaaatagcaagtt Knock out blaKPC-2 KPC-N20-R tactgcccgttgacgcccaaactagtattatacctaggactgagc KPC-500-F1 ttttttgatatcgaattcctgcagcccggattgaaaccatgaccgaac KPC-500-R1 gcattgaccttggcatcttc KPC-500-F2 gaagatgccaaggtcaatgcggtatccatcgcgtacacac KPC-500-R2 ggccgctctagaagtagtggatccccccgtcaagatctacaaccacagc pSGKPtestF tctcgtttggattgcaactg pSGKPtestR tgcttccggctcgtatgttg 敲除ompR ompR-N20-F agtggaccgtatcgtaggccgttttagagctagaaatagcaagtt Knock out ompR ompR-N20-R ggcctacgatacggtccactactagtattatacctaggactgagc ompR-500-F1 atatcgaattcctgcagcccgcattaacataccagctcgc ompR-500-R1 gtgcgcattatcaaacagac ompR-500-F2 gtctgtttgataatgcgcacctcatcgtcaccttgctg ompR-500-R2 ctagaagtagtggatcccccgttcgagatcgaccaacg pSGKPtestF tctcgtttggattgcaactg pSGKPtestR tgcttccggctcgtatgttg ompR基因回补 ompR-F gcggatcccggtaccaagcttgacaccctcgttgattccctttgtct ompR gene complementation ompR-R agctaactcacattaattgcgttgcgccgtacgggcaaatgaacttc pGEN-F ggtgtcaagcttggtacc pGEN-R gcgcaacgcaattaatgtga pGENtestF ggaacgaagccgccttaacc pGENtestR cttggagcgaactgcctacc 1.1.3 主要仪器
HHVE-50高压灭菌锅，日本HIRAYMA公司产品；AE150电子分析天平，瑞士METTLER公司产品；超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；涡旋振荡仪，德国艾卡公司产品；恒温培养箱，上海申贤恒温设备厂产品；离心机、微量移液器和Labcycler PCR扩增仪，德国Eppendorf公司产品；酶标定量测定仪，美国贝克曼公司产品；NanoDrop OneC微量紫外可见分光光度计，赛默飞科技公司产品。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种复苏
从冰箱中取出所需菌株，用移液枪吸取10 μL菌液，将其接种于900 μL新鲜的LB肉汤中，37 ℃、180 r/min振荡培养8 h。将复苏的菌株以四区划线法接种于麦康凯琼脂培养基，于37 ℃恒温箱过夜培养。次日，从麦康凯琼脂培养基上挑取荷包蛋样的单个菌落，并连续传代3次，以保证菌体的活力达到正常水平。
1.2.2 微量肉汤稀释法药敏试验
采用微量肉汤稀释法测定大肠埃希菌对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、磷霉素、阿米卡星、头孢噻肟、头孢西丁、氨苄西林、头孢他啶、四环素、氨曲南和环丙沙星的MIC，按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2023年标准[14]执行。以大肠埃希菌ATCC 25922为质量控制菌株。
1.2.3 接合转移试验
以大肠埃希菌MG1655作为受体菌，将孵育至对数生长期的供体菌和受体菌在LB肉汤中按体积比1∶4混合均匀，37 ℃孵育4 h后，接种于含美罗培南(0.25 mg/L)和链霉素(
1000 mg/L)的LB琼脂中，37 ℃培养过夜。挑取疑似接合子，通过PCR扩增测序证实接合子是否受到污染和blaKPC-2基因是否存在[15]。1.2.4 EZ-Tn5转座子突变文库的构建
使用EZ-Tn5转座酶系统[16]创建EC600/p21QH43K-KPC染色体突变文库。将携带EZ-Tn5的质粒pCat-APR通过接合转移的方式接合到EC600/p21QH43K-KPC中，获得突变文库，并将所有突变文库涂布于添加50 mg/L安普霉素的LB琼脂板上，37 ℃培养过夜，然后把琼脂板上的单菌接种到2 mg/L美罗培南药板上，37 ℃培养过夜，把琼脂板上的单菌保存于−20 ℃冰箱中备用。
1.2.5 大肠埃希菌缺失株和回补株的构建
所有大肠埃希菌的基因敲除试验都是通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑方法[17]产生的。简单地说，将设计好的sgRNA克隆到pSGKP质粒上，利用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)进行融合PCR扩增目的基因的同源臂；将质粒pSGKP-sgRNA及其匹配的同源臂电转化到含有pCas-kp的大肠埃希菌感受态细胞中，并在添加l −阿拉伯糖质量分数为0.2%的LB中培养；用安普霉素和利福平在30 ℃下选择转化子，并进行DNA测序验证；最后，用质量分数为5%的蔗糖溶液在42 ℃下固化质粒。
以EC600/p21QH43K-KPC为模板，扩增ompR连同其启动子基因片段。以pGEN质粒为载体，在Sal I酶切位点处进行反向扩增，通过同源重组酶将反向扩增的载体和ompR连同其启动子基因片段进行同源重组，提取质粒，进行Sanger测序确认，最终质粒命名为pGEN-ompR，把质粒pGEN-ompR以电转的方式转入大肠埃希菌EC600ΔompR/p21QH43K-KPC，最终获得ompR基因回补株EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC。
1.2.6 生长曲线测定
将培养至对数期(D600 nm=0.50)的目标菌株在LB肉汤中稀释至D600 nm=0.05~0.10，在96孔板中每孔加入200 µL稀释后的菌液，每个目标菌株设置3个重复，在37 ℃下孵育。每1 h测量1次菌液D600 nm，持续12 h。
1.2.7 全基因组测序(WGS)
基因组DNA文库的构建与序列测定使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明，提取各处理组的大肠埃希菌分离株的基因组DNA；通过浓度测定和琼脂糖凝胶电泳，初步质检合格后，构建Illumina(2×250 bp)文库，利用Illumina Hisseq平台进行测序，下机数据经质控和去除接头后运用SPAdesv3.6.2对原始数据进行拼接，拼接后的数据使用Quast软件进行质控。将拼接成功的序列用Mauve、Eazyfig软件进行基因组对比分析。
1.2.8 转录组测序分析
大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC和EC600ΔompR/p21QH43K-KPC通过0.064 mg/L的美罗培南LB肉汤富培养至对数生长期后，使用OMEGA试剂盒提取EC600/p21QH43K-KPC和EC600ΔompR/p21QH43K-KPC菌株中的总RNA。用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的纯度和完整性，并用Qubit 2.0定量RNA浓度。构建转录组测序文库，使用IlluminaHiSeq平台进行测序。将原始测序Reads映射到大肠埃希菌EC600的参考基因组(Accession登录号：PRJNA1051772)上。使用NGS QC Toolkit软件针对fastq格式的高通量测序原始数据(Raw reads)进行质控。使用DESeq R package的estimate Size Factors函数进行数据标准化，并使用nbinomTest函数计算差异比较的P值和差异倍数(Fold change，FC)。针对P<0.05且log2 FC>1.5的差异基因，使用微生信分析平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)比较试验组和对照组的差异表达基因，对每个比较组合的差异基因进行数目统计，制作成火山图，并进行GO、KEGG分析。
1.2.9 RT-qPCR试验
采用紫外可见分光光度计对大肠埃希菌菌株EC600/p21QH43K-KPC、EC600ΔompR/p21QH43K-KPCEC600/p21QH43K-KPC和EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC的总RNA进行定量，并使用iScript cDNA合成试剂盒将1 μg的总RNA进行反转录合成cDNA。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测系统进行cDNA的PCR扩增，并采用特异性引物，以16S rRNA表达为内参进行归一化，计算各基因的相对表达量。
1.2.10 数据分析
利用 GraphPad Prism 8.0 软件中的Student’s t-test统计学方法分析数据并作图。
2. 结果与分析
2.1 基于转座子突变文库筛选获得目标基因ompR
为了验证p21QH43K-KPC在其他大肠埃希菌中是否有相同的耐药表型趋势，我们通过接合转移把质粒p21QH43K-KPC转移到大肠埃希菌MG1655，发现接合子MG1655/p21QH43K-KPC对美罗培南同样表现出低水平耐药(MIC=0.250 mg/L) (表3)。然而，前期研究[3]发现，通过接合转移把质粒p21QH43K-KPC转移到肺炎克雷伯菌ATCC 700603中，ATCC 700603/p21QH43K-KPC对美罗培南表现出中等水平耐药(MIC=4.000 mg/L)，与大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC相比，质粒p21QH43K-KPC对美罗培南的耐药性增加了31倍。
表 3 携带blaKPC-2的质粒p21QH43K-KPC在不同遗传背景菌株中介导对碳青霉烯类药物的耐药表型Table 3. Carbapenems resistance conferred by blaKPC-2-carrrying plasmid p21QH43K-KPC in strains with different genetic backgrounds菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration 美罗培南 Meropenem 亚胺培南 Imipenem 厄他培南 Ertapenem 21QH43K 64.000 16.000 >64.000 ATCC 700603 0.064 0.032 0.064 ATCC 700603/p21QH43K-KPC 4.000 4.000 8.000 EC600 0.016 0.125 0.008 EC600/p21QH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 MG1655 0.016 0.125 0.002 MG1655/p21QH43K 0.125 0.500 0.250 EC600/p21QH43K-KPC-130 8.000 4.000 4.000 为了探究质粒p21QH43K-KPC携带的blaKPC-2在大肠埃希菌中介导美罗培南低水平耐药的调控机制，我们利用EZ-Tn5转座子系统构建了EC600/p21QH43K-KPC突变文库(图1)。随机选取
5000 个突变体，在添加2 mg/L美罗培南的LB琼脂板上筛选对美罗培南耐药表型增加的突变子。最终仅获得1株对美罗培南耐药性增强的突变体EC600/p21QH43K-KPC-130(MIC=8.000 mg/L) (表3)，突变子对碳青霉烯类药物美罗培南、亚胺培南和厄他培南均呈现中等强度的耐药水平，且与EC600/p21QH43K-KPC相比，对美罗培南、亚胺培南和厄他培南的MIC分别增加了63、7和15倍。通过对EC600/p21QH43K-KPC-130和EC600/p21QH43K-KPC进行WGS和序列比对分析发现，突变子的染色体基因ompR(全局转录调控因子)中存在EZ-Tn5转座子插入，同时还发现染色体基因iron[编码Fe(III)指示转运系统渗透酶蛋白]和质粒基因ltrA(编码逆转录型RNA定向DNA聚合酶，即细菌逆转录酶)存在非同义的单核苷酸突变。![图 1 基于转座子突变文库筛选目标基因]()
图 1 基于转座子突变文库筛选目标基因Figure 1. Screening of the target gene based on transposon mutation library2.2 ompR基因缺失增加blaKPC-2介导的碳青霉烯类药物耐药水平
为了确定ompR、ltrA和iron基因是否影响大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的耐药水平，我们在EC600/p21QH43K-KPC和EC600中构建了ltrA、ompR和iron基因缺失菌株。如表4所示，发现ompR缺失菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物美罗培南、亚胺培南和厄他培南均呈现中/高等强度的耐药水平，与菌株EC600/p21QH43K-KPC相比，即使ompR基因缺失轻微抑制了EC600ΔompR/p21QH43K-KPC的生长(数据未展示)，对美罗培南、亚胺培南和厄他培南的MIC分别增加63、31和127倍。通过回补试验发现，ompR基因缺失的回补菌株EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC可以部分恢复对碳青霉烯类药物的耐药水平。值得注意的是，在大肠埃希菌菌株EC600中，ompR缺失对美罗培南和厄他培南的MIC呈现轻微增加，分别增加3和7倍。我们进一步检测了EC600ΔompR/p21QH43K-KPC对其他种类抗菌药的耐药表型，与EC600/p21QH43K-KPC相比，ompR缺失导致对环丙沙星、头孢西丁和头孢他啶的MIC增加3倍(表5)。其次，相比之下，ltrA和iron基因敲除菌均未改变菌株EC600/p21QH43K和EC600对美罗培南、亚胺培南和厄他培南的MIC。这些数据表明，ompR基因缺失导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物耐药水平大幅度增加，达到中高等水平耐药。
表 4 ompR、iron和ltrA基因缺失后大肠埃希菌对受试抗菌药的耐药性Table 4. Resistance of Escherichia coli to the tested drugs after the deletion of the ompR, iron and ltrA genes菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration 美罗培南 Meropenem 亚胺培南 Imipenem 厄他培南 Ertapenem EC600/p21QH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 EC600ΔompR/p21QH43K-KPC 8.000 16.000 32.000 EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC 1.000 0.250 0.500 EC600 0.016 0.125 0.008 EC600ΔompR 0.064 0.125 0.064 EC600Δiron/p21QH43K-KPC 0.250 0.500 0.250 EC600ΔltrA/p21QH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 表 5 ompR基因缺失后大肠埃希菌对受试抗菌药的耐药性1)Table 5. Resistance of Escherichia coli to the tested drugs after the deletion of the ompR gene菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration FOS AMK CTX FOX AMP CAZ TET ATM CIP EC600/p21QH43K-KPC 256 >256 16 16 >256 64 1 16 0.032 EC600ΔompR/p21QH43K-KPC 8 >256 16 64 >256 256 1 32 0.125 EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC >256 >256 32 64 >256 128 1 64 0.125 1) FOS：磷霉素，AMK：阿米卡星，CTX：头孢噻肟，FOX：头孢西丁，AMP：氨苄西林，CAZ：头孢他啶，TET：四环素，ATM：氨曲南，CIP：环丙沙星。
1) FOS: Fosfomycin, AMK: Amikacin, CTX: Cefotaxime, FOX: Cefoxetine, AMP: Ampicillin, CAZ: Ceftazidime, TET: Tetracycline, ATM: Aztreonam, CIP: Ciprofloxacin.2.3 ompR缺失影响大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱
考虑ompR基因是全局转录调控因子，我们进而探究了ompR缺失对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱的影响。转录组测序结果分析显示，与大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC相比，EC600ΔompR/p21QH43K-KPC在转录水平上存在明显差异，有526个基因存在显著差异表达，其中231个基因显著上调，295个基因显著下调，说明敲除ompR基因对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱产生了影响(图2a)。通过对差异表达基因进行GO分类分析，各类均分析排名前十的生物学过程，在生物学过程(Biological process, BP)部分，主要参与跨膜运输、呼吸电子传递链、电子传递链、氢离子跨膜运输、有/无氧呼吸等。在细胞组成(Cellular component, CC)部分，主要分布在细胞膜及胞内细胞器。在分子功能(Molecular function, MF)部分，基因主要富集在蛋白结合、氧化还原酶、跨膜转运蛋白、铁离子结合蛋白、血红素结合蛋白、NADH脱氢酶活性等通路。将差异显著基因进一步进行KEGG分析，差异基因主要富集在不同环境中的氧化磷酸化、TCA循环、ABC转运、群体感应及铁载体群非核糖体肽的生物合成相关通路。此外，氨基酸代谢相关基因(nspD、nirC、dppC、dppB、livJ和bhsA)和呼吸链相关基因(bioF、lldD、bioB和sucC)的mRNA水平上调较为明显，为6.50~12.40倍，而调控因子(csgD、gadA、gadB和gadC)、膜蛋白相关基因(yhiM、ompC、ompF、asr)、糖酵解基因(hyi)和生物胺合成基因(cadA) mRNA水平下降较为明显，为26.20~62.52倍(图2b)，其中ompC和ompF基因的转录表达水平分别下调62.52和54.38倍。然而值得注意的是，转录组测序结果显示ompR基因缺失对blaKPC-2基因的mRNA水平无明显影响，这一结果也进一步通过RT-qPCR得到验证(图2c)。
![图 2 ompR缺失对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱的影响]()
图 2 ompR缺失对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱的影响a：差异表达基因火山图，由t检验确定相对于EC600/p21QH43K菌株的差异显著性； b：上调和下调的Top 10显著差异表达基因；c：采用RT-qPCR检测blaKPC-2的转录本水平，该基因在EC600/p21QH43K菌株中的转录水平设为1, 误差条表示3个独立试验的标准差。Figure 2. Effect of ompR deletion on the transcriptome profile in stain EC600/p21QH43K-KPCa: Volcano map of differentially expressed genes, the significance of the difference relative to the EC600/p21QH43K strain was determined by t-test; b: Top 10 up- and down-regulated significantly differentially expressed genes; c: The transcript levels of blaKPC-2 determined by RT-qPCR, the transcriptional level of this gene in the EC600/p21QH43K strain was set as 1, and the error bars represent the standard deviation of three independent experiments.考虑到外膜孔蛋白(OMPs)是革兰阴性菌的独特结构，它形成亲水性开放通道，允许小分子量的亲水性抗生素扩散到细胞中[18-19]。ompR缺失导致下调的OMP相关的基因ompC和ompF可能是导致细菌耐药性异常的原因之一。因此，我们进一步研究了ompC和ompF基因的缺失是否影响大肠埃希菌EC600/ p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的耐药水平。结果发现与EC600/p21QH43K-KPC相比，ompC/ompF基因缺失菌株EC600ΔompC/p21QH43K-KPC和EC600ΔompF/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的MIC升高1~3倍(表6)，但仍低于ompR基因缺失菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的MIC。ompC和ompF基因缺失导致大肠埃希菌EC600菌株对碳青霉烯类药物的MIC几乎无明显影响。这些结果表明尽管ompR基因缺失导致ompC和ompF转录表达水平大幅度上调，但其对ompR基因缺失引起菌株EC600/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物呈现的中高水平耐药贡献较低。这暗示了ompR基因缺失导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物耐药水平大幅度增加的调控机制仍有待进一步研究。
表 6 ompC/ompF基因缺失后大肠埃希菌对碳青霉烯类药物的耐药性Table 6. Carbapenems resistance of Escherichia coli after the deletion of the ompC/ompF gene菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration 美罗培南 Meropenem 亚胺培南 Imipenem 厄他培南 Ertapenem EC600/pQH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 EC600ΔompC/p21QH43K-KPC 0.500 1.000 0.500 EC600ΔompF/p21QH43K-KPC 0.500 1.000 0.500 EC600 0.016 0.125 0.008 EC600ΔompC 0.016 0.064 0.008 EC600ΔompF 0.016 0.250 0.008 3. 讨论与结论
耐碳青霉烯类肠杆菌科的出现和传播对公众健康构成严重威胁[20]。尽管产碳青霉烯酶是导致菌株对碳青霉烯类药物耐药的重要机制，但携带同一种碳青霉烯酶基因在不同菌种、甚至同一菌种不同菌株中介导的碳青霉烯类药物耐药水平往往存在差异。因而，肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶基因调控的分子机制有待进一步研究。本研究中，我们发现大肠埃希菌染色体中全局调控因子OmpR参与调控IncFII质粒p21QH43K-KPC编码的blaKPC-2基因介导碳青霉烯类药物低水平耐药。这一结果一定程度上解释了携带blaKPC-2质粒转移至大肠埃希菌后介导碳青霉烯类药物低水平耐药的原因。
我们通过构建大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC突变文库并结合基因敲除技术，将染色体基因ompR与质粒编码基因blaKPC-2介导的碳青霉烯类药物低水平耐药相联系。OmpR是一种DNA结合蛋白，可被激酶EnvZ磷酸化，EnvZ-OmpR双组分系统参与协调细菌对环境因素刺激的转录反应，包括渗透压应激、对生长条件的反应[21]、运动性[22]、细胞内存活能力[23]、毒力[24]以及抗生素耐药性[25]。先前的研究表明，OmpR通过调节ompC和ompF的外膜孔蛋白基因影响对抗生素耐药性，其作用于胞膜通透性以限制细胞内抗生素的进入[26]。事实上，我们也发现ompC/ompF基因缺失导致菌株EC600/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物耐药水平略有增加，尽管在转录水平上ompR基因的缺失显著降低了ompC和ompF的表达量。这暗示ompR基因缺失导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物的中高等耐药水平，似乎与ompR对ompC和ompF的调节关系较小。鉴于OmpR为转录调控因子，我们进一步探究了ompR是否会调控blaKPC-2基因的转录表达。然而，转录组测序以及RT-qPCR检测均表明ompR基因缺失对blaKPC-2基因的mRNA水平无明显影响。考虑到ompR缺失影响了大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱，ompR参与blaKPC-2基因的调控机制较为复杂。ompR缺失是如何导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物的耐药水平大幅度增加仍有待进一步探究。
前期细菌耐药性调查研究表明，blaKPC-2基因具有较强的细菌宿主偏好性，其主要的宿主菌为ST11 CRKP，而在大肠埃希菌中该基因的流行率较低[27]。最近的一项全国性碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌监测研究也发现，76.5%的CRKP携带blaKPC-2，而大肠埃希菌中携带blaKPC-2的比例仅为3.2%[28]。相关报道还显示产KPC-2的肺炎克雷伯菌菌株常常对美罗培南呈现高水平耐药，然而，携带blaKPC-2的质粒从肺炎克雷伯菌转移至大肠埃希菌后，常常介导美罗培南低水平耐药[7-9]。考虑到在碳青霉烯耐药性调查中，研究者常用添加1 或2 mg/L美罗培南的麦康凯琼脂板筛选碳青霉烯耐药菌[29] ，进而筛选碳青霉烯耐药基因，包括blaKPC-2。这暗示blaKPC-2在大肠埃希菌中的真实流行率可能被低估了。另一方面，这也表明转录调控因子OmpR可能在碳青霉烯药物选择压力下，抵御blaKPC-2在大肠埃希菌中的传播，而ompR的基因缺失或突变可能是逃避这种作用的关键因素。
综上所述，我们发现耐美罗培南肺炎克雷伯菌IncFII质粒p21QH43K-KPC编码的blaKPC-2基因在大肠埃希菌中介导碳青霉烯类药物的低水平耐药，这与转录调控因子OmpR对blaKPC-2基因的调控有关。我们的结果为解析大肠埃希菌染色体转录调控因子OmpR参与调控质粒编码的碳青霉烯酶基因提供了重要的见解。
-
![]()
图 1 水体理化指标在不同处理和水稻各生长时期的变化
RCL：低密度稻虾模式田面水体，RCL-G：低密度稻虾模式虾沟水体，RCH：高密度稻虾模式田面水体，RCH-G：高密度稻虾模式虾沟水体，RM：水稻单作模式田面水体；P1：分蘖期，P2：拔节期，P3：孕穗期，P4：扬花期，P5：灌浆期，P6：成熟期；各小图中柱子上方的不同小写字母表示相同生长时期不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。
Figure 1. Physico-chemical indicator changes of water under different treatments and in different growth periods of rice
RCL: Surface water of low density rice-red crayfish model, RCL-G: Ditch water of low density rice-red crayfish model, RCH: Surface water of high density rice-red crayfish model, RCH-G: Ditch water of high density rice-red crayfish model, RM: Surface water of rice monocropping model; P1: Tillering stage, P2: Jointing stage, P3: Booting stage, P4: Flowering stage, P5: Filling stage, P6: Ripening stage; Different lowercase letters above the columns in each figure indicate significant differences among different treatments in the same growth period (P<0.05, Duncan’s method).
![]()
图 2 水体各指标间的相关性分析
1：pH，2：溶解氧含量，3：电导率，4：溶解性总固体含量，5：总N含量，6：总P含量，7：NH4+−N含量，8：NO3-−N含量，9：化学需氧量；“*”表示在P<0.05水平显著相关(Pearson法)。
Figure 2. Correlation analysis among all water indexes
1: pH, 2: Dissolved oxygen content, 3: Electrical conductivity, 4: Total dissolved solid content, 5: Total N content, 6: Total P content, 7: NH4+-N content，8: NO3−-N content, 9: Chemical oxygen demand; “*” indicates significant correlation at P<0.05 (Pearson method).
![]()
图 3 不同处理以及水稻不同生长时期的水体质量分析
RCL：低密度稻虾模式田面水体，RCL-G：低密度稻虾模式虾沟水体，RCH：高密度稻虾模式田面水体，RCH-G：高密度稻虾模式虾沟水体，RM：水稻单作模式田面水体；P1：分蘖期，P2：拔节期，P3：孕穗期，P4：扬花期，P5：灌浆期，P6：成熟期；柱子上方的不同小写字母表示相同生长时期不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。
Figure 3. Analysis of water quality under different treatments and in different growth periods of rice
RCL: Surface water of low density rice-red crayfish model, RCL-G: Ditch water of low density rice-red crayfish model, RCH: Surface water of high density rice-red crayfish model, RCH-G: Ditch water of high density rice-red crayfish model, RM: Surface water of rice monocropping model; P1: Tillering stage, P2: Jointing stage, P3: Booting stage, P4: Flowering stage, P5: Filling stage, P6: Ripening stage; Different lowercase letters above the columns indicate significant differences among different treatments in the same growth period (P<0.05, Duncan’s method).
表 1 试验地土壤基本理化性质
Table 1 Basic physical-chemical properties of the tested soil
处理
TreatmentpH w/(g·kg−1) w/(mg·kg−1) 总N
Total N总P
Total P总K
Total K有机质
Organic matter速效P
Available P速效K
Available K稻虾
Rice-red crayfish6.02±0.03 0.97±0.07 0.58±0.02 5.69±0.27 27.50±2.24 2.71±0.76 43.94±2.89 水稻单作
Rice monocropping6.01±0.02 0.98±0.06 0.59±0.01 5.49±0.24 29.80±4.31 2.23±0.50 36.65±2.66 
下载: 导出CSV
表 2 水体指标的主成分分析结果
Table 2 Principal component analysis results of water indexes
指标1)
Index主成分 Principal component 范数值
Norm value公因子方差
CommunalityⅠ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 1 −0.361 0.553 −0.175 0.527 6.331 0.744 2 −0.061 −0.257 0.330 0.775 7.328 0.780 3 0.939 0.158 0.014 0.148 5.233 0.930 4 0.945 0.138 0.080 0.143 5.262 0.939 5 −0.649 0.487 0.278 0.019 5.254 0.736 6 0.271 0.602 0.191 −0.287 5.219 0.554 7 0.204 −0.042 0.787 0.009 6.265 0.663 8 −0.036 −0.811 −0.059 0.002 5.568 0.663 9 0.252 0.147 −0.657 0.205 5.686 0.559 特征值 Eigenvalue 2.511 1.696 1.314 1.046 占比/% Percent 27.903 18.847 14.599 11.619 累积占比/% Cumulative percent 27.903 46.749 61.348 72.967 1) 1：pH，2：溶解氧含量，3：电导率，4：溶解性总固体含量，5：总N含量，6：总P含量，7：NH4+−N含量，8：NO3-−N含量，9：化学需氧量。
1) 1: pH, 2: Dissolved oxygen content, 3: Electrical conductivity, 4: Total dissolved solid content, 5: Total N content, 6: Total P content, 7: NH4+-N content，8: NO3--N content, 9: Chemical oxygen demand.
下载: 导出CSV
表 3 最小数据集指标的公因子方差和权重
Table 3 Communality and weight of indicators in minimal data set
指标
Index公因子方差
Communality权重
Weight溶解性总固体含量
Total dissolved solid content0.939 0.255 pH 0.744 0.202 NH4+−N含量
NH4+-N content0.663 0.180 化学需氧量
Chemical oxygen demand0.559 0.152 溶解氧含量
Dissolved oxygen content0.780 0.212
下载: 导出CSV
表 4 3种处理的水稻产量与产值1)
Table 4 Rice yield and output value in three treatments
处理
Treatment有效穗数/(104·hm−2)
Number of
productive ears每穗总粒数
Total number of
grains per panicle结实率/%
Setting
percentage千粒质量/g
Thousand-seed
weight产量/
(t·hm−2)
Yield产值/(元·hm−2)
Output
valueLRC 212.2±2.7b 119.6±3.4a 80.1±0.9b 25.6±0.5b 5.21±0.03b 18 235±96b HRC 206.2±2.9c 108.3±5.2b 80.3±0.4b 24.3±0.4c 4.35±0.01c 15 225±82c R 230.6±4.4a 121.9±2.9a 85.1±0.3a 28.7±0.4a 6.57±0.20a 22 987±94a 1)LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾，R：水稻单作；水稻收购价格为3.5元·kg−1，水稻收购价格不考虑稻虾米溢价；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。
1)LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish, R: Rice monocropping; The rice procurement price is 3.5 yuan·kg−1, and its purchase price does not take into account the premium of rice-red crayfish; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method).
下载: 导出CSV
表 5 2种放养密度稻虾复合模式中红螯螯虾产量指标1)
Table 5 Production index of red crayfish in rice-red crayfish integrated systems of two stocking densities
处理
Treatment产量/(kg·hm−2)
Production产出投入比
Output-input ratio存活率/%
Survival rateLRC 923±8a 1.93±0.10a 79.3±0.2a HRC 752±8b 1.36±0.10b 51.8±0.3b 1)LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，t检验)。
1)LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between two treatments (P<0.05, t-test).
下载: 导出CSV
表 6 2种放养密度稻虾复合模式中红螯螯虾养殖产量及产值1)
Table 6 Red crayfish production and output value in rice-red crayfish integrated systems of two stocking densities
处理
Treatment产量/(kg·hm−2) Production 产量占比/% Production proportion 产值/
(元·hm−2)
Output
value小青
Small
green中青
Medium
green大青
Large
green炮头
Cannon
head小青
Small
green中青
Medium
green大青
Large
green炮头
Cannon
headLRC 34.5±2.6a 412.5±2.5a 270.0±3.5b 205.5±4.3a 3.7 44.7 29.3 22.3 90 575±102a HRC 31.5±3.5a 282.0±1.7b 310.5±4.1a 127.5±2.8b 4.2 37.5 41.3 17.0 73 356±139b 1) LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾；小青、中青、大青和炮头售价分别为64、85、100和128元·kg−1；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，t检验)。
1) LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish; Small green is priced at 64 yuan·kg−1, medium green 85 yuan·kg−1, large green 100 yuan·kg−1, cannon head 128 yuan kg−1; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between two treatments (P<0.05, t-test).
下载: 导出CSV
表 7 3种处理的经济效益对比1)
Table 7 Comparison of economic benefits of three treatments
处理
Treatment秧苗成本/
(元·hm−2)
Seedling
cost化肥成本/
(元·hm−2)
Fertilizer
cost饲料成本/
(元·hm−2)
Feed
cost虾苗成本/
(元·hm−2)
Shrimp seed
cost人工成本/
(元·hm−2)
Labor
cost田地租金/
(元·hm−2)
Land
rent水稻产值/
(元·hm−2)
Rice
output虾产值/
(元·hm−2)
Red crayfish
output收益/
(元·hm−2)
ProfitLRC 500 2 920 3 578 9 000 10 140 9 000 18 235 90 575 73 672±198a HRC 500 2 920 4 155 12 000 10 140 9 000 15 225 73 356 49 866±221b R 500 3 504 3 000 9 000 22 987 6 983±94c 1) LRC：低密度稻虾，HRC：高密度稻虾，R：水稻单作；收益数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)。
1) LRC: Low density rice-red crayfish, HRC: High density rice-red crayfish, R: Rice monocropping; Different lowercase letters after the profit data indicate significant differences among treatments (P<0.05, Duncan’s method).
下载: 导出CSV
-
[1] 康绍忠. 藏粮于水 藏水于技: 发展高水效农业 保障国家食物安全[J]. 中国水利, 2022(13): 1-5. [2] DENG N, GRASSINI P, YANG H, et al. Closing yield gaps for rice self-sufficiency in China[J]. Nature Communications, 2019, 10: 1725. doi: 10.1038/s41467-019-09447-9
[3] 程敏. 农业面源污染对农村地表水的影响与对策[J]. 化工设计通讯, 2023, 49(12): 185-187. [4] 张佳卓. 中国农业面源污染区域差异及其影响因素分析[D]. 昆明: 云南财经大学, 2020. [5] 唐建军, 李巍, 吕修涛, 等. 中国稻渔综合种养产业的发展现状与若干思考[J]. 中国稻米, 2020, 26(5): 1-10. [6] 万玉霞. 探究稻虾共生高效生态种养模式与效益[J]. 种子科技, 2019, 37(5): 24. [7] HOU J, STYLES D, CAO Y, et al. The sustainability of rice-crayfish coculture systems: A mini review of evidence from Jianghan Plain in China[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2021, 101(9): 3843-3853. doi: 10.1002/jsfa.11019
[8] WU Y, LI Y, NIU L, et al. Nutrient status of integrated rice-crayfish system impacts the microbial nitrogen-transformation processes in paddy fields and rice yields[J]. Science of the Total Environment, 2022, 836: 155706. doi: 10.1016/j.scitotenv.2022.155706
[9] 黄国林, 曾斌, 李卫东, 等. 湖南环洞庭湖区稻渔综合种养发展模式与优化建议[J]. 湖南农业科学, 2019(12): 59-63. [10] NIHALANI S, MEERUTY A. Water quality index evaluation for major rivers in Gujarat[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2021, 28(45): 63523-63531. doi: 10.1007/s11356-020-10509-5
[11] SUTADIAN A D, MUTTIL N, YILMAZ A G, et al. Development of river water quality indices: A review[J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2015, 188(1): 58.
[12] 魏征. 盐胁迫对不同水稻品种生理特性和产量的影响[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2023. [13] 瞿梦洁, 韩玉成, 万智鹏, 等. 稻虾共作水域沉积物有机磷农药残留特征及其对磷循环驱动机制[J]. 农业环境科学学报, 2023, 42(2): 434-442. [14] 韩光明, 吴雷明, 张家宏, 等. 稻虾共作模式下不同投饲率对稻、虾生长及氮磷利用的影响[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2022, 43(5): 10-17. [15] LIU K W, ZHU J Q, LIU K Q, et al. Assessment of precipitation suitable degree from integrated rice-crayfish farming systems in Jianghan Plain of China[J]. Journal of Agrometeorology, 2022, 24(2): 123-132.
[16] 李进. 水环境理化因子对红螯螯虾繁殖性能和幼体发育的影响研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2009. [17] LI T, ZHANG B, ZHU C, et al. Effects of an ex situ shrimp-rice aquaponic system on the water quality of aquaculture ponds in the Pearl River estuary, China[J]. Aquaculture, 2021, 545: 737179. doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737179
[18] NAYAK P K, NAYAK A K, PANDA B B, et al. Ecological mechanism and diversity in rice based integrated farming system[J]. Ecological Indicators, 2018, 91: 359-375. doi: 10.1016/j.ecolind.2018.04.025
[19] 王世会, 赵志刚, 罗亮, 等. 放养密度对寒区稻−扣蟹共作模式中河蟹生长及水质的影响[J]. 水产学杂志, 2023, 36(2): 100-108. [20] 舒斌, 李军涛, 张秀霞, 等. 环境因子对克氏原螯虾Procambarus clarkii免疫指标影响的研究进展[J]. 水产学杂志, 2020, 33(4): 75-80. [21] LI Y F, WU T Y, WANG S D, et al. Developing integrated rice-animal farming based on climate and farmers choices[J]. Agricultural Systems, 2023, 204: 103554. doi: 10.1016/j.agsy.2022.103554
[22] BASHIR M A, WANG H, SUN W, et al. The implementation of rice-crab co-culture system to ensure cleaner rice and farm production[J]. Journal of Cleaner Production, 2021, 316: 128284. doi: 10.1016/j.jclepro.2021.128284
[23] 李志福, 吴永红, 刘雪梅, 等. 基于稻虾共作系统水稻收割后水体水质及沉积物重金属风险评估[J]. 华东师范大学学报(自然科学版), 2024(1): 122-33. [24] FARZADFAR S, KNIGHT J D, CONGREVES K A. Soil organic nitrogen: An overlooked but potentially significant contribution to crop nutrition[J]. Plant and Soil, 2021, 462(1): 7-23.
[25] AKHTAR N, ISHAK M I S, BHAWANI S A, et al. Various natural and anthropogenic factors responsible for water quality degradation: A review[J]. Water, 2021, 13(19): 2660. doi: 10.3390/w13192660
[26] 倪明理. 投食对稻虾共作生态系统氮素利用的影响[D]. 武汉: 华中农业大学, 2022. [27] 侯应霞, 苏应兵. 稻田小龙虾生态养殖模式的效益比较[J]. 养殖与饲料, 2024, 23(1): 13-19. [28] LI F, FENG J, ZHOU X, et al. Effect of rice-fish/shrimp co-culture on sediment resuspension and associated nutrients release in intensive aquaculture ponds[J]. Archives of Agronomy and Soil Science, 2020, 66(7): 971-982. doi: 10.1080/03650340.2019.1649395
[29] 徐若诗, 逄勇, 罗缙, 等. 基于WQI的南水北调东线江苏段水质评价及时空分布特征[J]. 环境科学, 2024, 45(9): 5227-5234. [30] 富天乙, 邹志红, 王晓静. 基于多元统计和水质标识指数的辽阳太子河水质评价研究[J]. 环境科学学报, 2014, 34(2): 473-480. [31] 曹阳阳. 改进层次分析法在地表水质评价中的应用[J]. 水利科技与经济, 2023, 29(9): 41-46. [32] 陈华, 张倩, 王照丽, 等. 基于主成分分析与聚类分析的水质综合评价研究[J]. 科技创新与应用, 2023, 13(26): 88-92. [33] MA Z, LI H, YE Z, et al. Application of modified water quality index (WQI) in the assessment of coastal water quality in main aquaculture areas of Dalian, China[J]. Marine Pollution Bulletin, 2020, 157: 111285. doi: 10.1016/j.marpolbul.2020.111285
[34] 梁宇辉. “双水双绿”稻虾种养模式水质变化和养分收支研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2022. [35] 管卫兵, 刘凯, 石伟, 等. 稻渔综合种养的科学范式[J]. 生态学报, 2020, 40(16): 5451-5464. [36] 寇祥明, 韩光明, 吴雷明, 等. 虾苗密度对稻虾共作模式下稻虾生长及氮磷利用的影响[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2020, 41(2): 22-27. [37] 王晨, 胡亮亮, 唐建军, 等. 稻鱼种养型农场的特征与效应分析[J]. 农业现代化研究, 2018, 39(5): 875-882. -
期刊类型引用(11)
1. 曹志强，张佳，辛斌. 间歇式信息传输条件下无人机搜索覆盖规划. 系统工程与电子技术. 2024(01): 152-161 . 
百度学术
2. 李务太，宫金良，张彦斐. 基于改进人工势场-PSO算法的农业机器人全区域覆盖研究. 山东理工大学学报(自然科学版). 2024(05): 47-53 . 百度学术
3. 李文峰，徐蕾，杨琳琳，刘文荣，潘坤，李超. 基于改进蚁群算法的农业机器人多田块路径规划方法与试验. 南京农业大学学报. 2024(04): 823-834 . 百度学术
4. 张建刚，刘海宁，于庆江，张留，杨奉钦. 物业用室内清扫机器人自主作业的改进螺旋回溯法. 济南大学学报(自然科学版). 2024(05): 564-572 . 百度学术
5. 王朝阳. 基于模拟退火算法的柔性连接件优化设计. 电子元器件与信息技术. 2024(07): 75-78+82 . 百度学术
6. 芮宏斌，李耒，解晓琳，彭家璇，郭旋. 基于改进跳点搜索和蚁群算法的机器人多目标点巡检规划. 动力学与控制学报. 2024(07): 70-79 . 百度学术
7. 邓红，孙栩. 基于鱼群算法的智能机器人全覆盖路径规划. 计算机测量与控制. 2023(07): 222-227+297 . 百度学术
8. 董雅文，杨静雯，刘文慧，张宝锋. 基于改进A~*算法的机器人全覆盖衔接路径规划. 传感器与微系统. 2023(09): 125-128 . 百度学术
9. 缪晓宾，陈昊. 模拟退火算法优化转运小车转向的梯形机构设计. 机械设计与研究. 2023(05): 67-71 . 百度学术
10. 蔡安江，刘小波，王东红，刘亚东，于海滨. 预制混凝土构件布料路径规划. 哈尔滨工业大学学报. 2022(07): 12-19 . 百度学术
11. 王宁，韩雨晓，王雅萱，王天海，张漫，李寒. 农业机器人全覆盖作业规划研究进展. 农业机械学报. 2022(S1): 1-19 . 百度学术
其他类型引用(14)
