Interaction mechanism between OsCdc48 and Pik1-H4, and its regulation on rice blast disease resistance
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摘要:目的
探究Pik1-H4与细胞周期蛋白OsCdc48的互作机制，明确其在稻瘟病抗性中的作用。
方法首先，分别利用酵母双杂交试验和荧光素酶互补试验验证Pik1-H4与OsCdc48的相互作用；然后，通过RT-qPCR分析OsCdc48在稻瘟病菌侵染后的表达情况及组织表达特异性；其次，分析OsCdc48的序列保守性、蛋白结构域、系统进化关系、蛋白质三维结构预测及其亚细胞定位；最后，利用CRISPR/Cas9创制OsCdc48突变体，并对其进行稻瘟病抗性鉴定和病程相关基因表达分析。
结果证实了Pik1-H4与OsCdc48的互作，且OsCdc48受稻瘟病菌侵染诱导表达。OsCdc48在各组织中均有表达，其编码蛋白定位于细胞核与细胞质。OsCdc48在不同物种中序列保守，与玉米和高粱的亲缘关系最近，预测会形成同源六聚体。OsCdc48功能缺失突变体ko-oscdc48病程相关基因上调表达，对稻瘟病抗性增强。
结论本研究为深入揭示OsCdc48与NLR蛋白Pik1-H4调控稻瘟病抗性的机制及水稻抗病育种提供了理论基础。
Abstract:ObjectiveTo investigate the interaction mechanism between Pik1-H4 and cell division cycle protein OsCdc48, clarify its role in rice blast disease resistance.
MethodFirstly, the interactions between Pik1-H4 and OsCdc48 were verified using yeast two-hybrid and luciferase complementation assays. Then, the expression patterns of OsCdc48 after infection of Magnaporthe oryzae and its tissue-specific expression were analyzed by RT-qPCR. Next, the determination of OsCdc48’s sequence conservation, protein domains, phylogenetic relationships, protein 3D structure prediction and subcellular localization were performed. Finally, OsCdc48 mutant was created using CRISPR/Cas9 technology, the resistance identification of transgenic mutant to rice blast disease and expression analysis of pathogenesis-related genes were also conducted.
ResultThe interactions between Pik1-H4 and OsCdc48 were confirmed, and OsCdc48 was induced by rice blast fungus infection. OsCdc48 was expressed in all tissues and was localized to the nucleus and cytoplasm. The sequence of OsCdc48 was conserved across different species, with the closest phylogenetic relationship to maize and sorghum, and it might form homologous hexamers. The OsCdc48 loss-of-function mutant ko-oscdc48 up-regulated the expression of disease-related genes and enhanced the resistance to rice blast disease.
ConclusionThis study lays a theoretical basis for further elucidating the mechanism of OsCdc48 and NLR protein Pik1-H4 regulating blast disease resistance and rice disease-resistant breeding.
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Keywords:
- Oryza sativa L. /
- Rice blast disease /
- Magnaporthe oryzae /
- Pik1-H4 /
- OsCdc48
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大花紫薇Lagerstroemia speciosa为千屈菜科Lythraceae紫薇属Lagerstroemia大乔木，又名为大叶紫薇、大叶百日红、巴拿马等，主要分布于东南亚地区、印度及斯里兰卡，现广泛栽培于我国广东、广西、福建和云南等地[1-2]。大花紫薇树体高大、树形优美、枝叶繁茂、花冠硕大、花色艳丽、花量繁多、花期长久，是重要的夏秋观花景观生态树种[3-5]。
目前，紫薇属中株型矮小的灌木紫薇品种选育获得了巨大成功，但针对高大乔木品种的选育则相对滞后，以大花紫薇为材料的品种选育与改良工作开展较少，且育种手段单一[6]。同时，该树种的应用面临品种花色单调、适生区域窄、结果量大且挂果期长(达8个月)等问题，严重影响开花及花后的景观效果[7-9]。鉴于此，利用多种育种技术进行种质创新成为培育和改良大花紫薇研究的重中之重。
甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate，EMS)是常见的植物育种诱变剂之一，能够诱使材料产生高密度的系列等位基因点突变，已被广泛用于农作物和花卉等草本植物的育种研究上，且取得了不俗的成果[10-13]。相比之下，木本植物因其生长周期较长，运用EMS诱变取得的实质性成果也相对欠缺[14]。本研究以大花紫薇种子为材料，对其采用不同浓度EMS进行不同时间处理，以探究大花紫薇EMS诱变半致死剂量，构建EMS诱变群体，为丰富大花紫薇种质资源提供技术理论支持，同时以期为后续育种提供材料。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
大花紫薇果实于2021年12月采自华南农业大学校园内筛选出的单株。果实脱粒后选取饱满种子于−4 ℃冰箱保存。诱变前将大花紫薇种子浸泡在200 mg·L−1赤霉素溶液并置于摇床(30 ℃，150 r·min−1)催芽24 h。
1.2 EMS诱变处理
1.2.1 EMS溶液的配制
称取Na2HPO4·12H2O 35.82 g，用蒸馏水定容至1 L，作为溶液A；称取NaH2PO4·2H2O 15.61 g，用蒸馏水定容至1 L，作为溶液B；磷酸缓冲液按VA∶VB = 63∶39现配现用，使用前用NaOH溶液将pH微调至7.0[15]。
化学诱变剂为EMS(上海麦克林生化科技有限公司)，使用磷酸缓冲液进行配制，先配制成0.1 g·mL−1质量浓度溶液，再稀释至所需质量浓度。
1.2.2 处理方法与试验设计
催芽处理后的种子置于100 mL离心管中，加入配制好的不同浓度EMS溶液后于摇床(30 ℃，150 r·min−1)避光进行诱导，在前期预试验0~20 g·L−1质量浓度筛选的基础上，采用随机完全区组设计，EMS溶液设置5个质量浓度梯度(12、14、16、18和20 g·L−1)，磷酸缓冲液为空白对照，处理时间设置3个水平(8、10、12 h)，共18个处理组合，每个处理50粒种子，重复3次。处理结束后用等体积50 g·L−1 Na2S2O3溶液置于摇床(30 ℃，150 r·min−1)清洗3次，每次10 min，再用流水冲洗2 h，以彻底清除残留药液[16]。最后将清洗的种子置床于铺有3层滤纸和1层纱布的培养皿中，培养条件为16 h·d−1光照、30 ℃的培养箱。
1.3 指标测定
1.3.1 发芽指标测定
每天按时观察种子萌发情况，按需补水，保持滤纸湿润，并及时去除霉变感菌种子。种子萌发以露白作为标准，以连续3 d不再发芽视为发芽终止，每天定时记录各处理发芽数。发芽结束后统计发芽率，计算发芽势和发芽指数。计算公式[17]如下：
$$ \mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{率}=\dfrac{\mathrm{种}\mathrm{子}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{总}\mathrm{数}}{\mathrm{供}\mathrm{试}\mathrm{种}\mathrm{子}\mathrm{数}}\times \text{100{\text{%}}}， $$ (1) $$ \text{相对发芽率}\text=\dfrac{\text{处理组发芽率}}{\text{对照组发芽率}}\times \text{100{\text{%}}}， $$ (2) $$ \mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{势}=\dfrac{\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{高}\mathrm{峰}\mathrm{期}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{种}\mathrm{子}\mathrm{数}}{\mathrm{供}\mathrm{试}\mathrm{种}\mathrm{子}\mathrm{数}}\times \text{100{\text{%}}}， $$ (3) $$ \mathrm{相}\mathrm{对}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{势}=\dfrac{\mathrm{处}\mathrm{理}\mathrm{组}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{势}}{\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{势}}\times \text{100{\text{%}}}， $$ (4) $$ \mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{指}\mathrm{数}=\displaystyle\sum \dfrac{G_t}{t}， $$ (5) 式中：Gt为第t天发芽数；t为发芽天数。
$$ \mathrm{相}\mathrm{对}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{指}\mathrm{数}=\dfrac{\mathrm{处}\mathrm{理}\mathrm{组}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{指}\mathrm{数}}{\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{组}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{指}\mathrm{数}}\times \text{100{\text{%}}}。 $$ (6) 半致死剂量(Lethal concentration 50，LC50)以处理大花紫薇种子的相对致死率确定，相对致死率为50%时获得半致死剂量[18]。
$$\mathrm{相}\mathrm{对}\mathrm{致}\mathrm{死}\mathrm{率}=1 - \mathrm{相}\mathrm{对}\mathrm{发}\mathrm{芽}\mathrm{率}。 $$ (7) 1.3.2 胚轴及胚根测定
发芽终止5 d后，每个处理随机抽取10株芽苗，重复3次(数量不足的全组测量)，使用游标卡尺(精度为0.1 mm)测量胚轴及胚根长，取平均值。
1.3.3 大花紫薇幼苗形态学指标的观测
经诱变处理的大花紫薇芽苗长出真叶时，移栽至穴盘(基质为V泥炭土∶V珍珠岩=3∶1)培养至5~6 cm时，移栽至花盆中(基质为V泥炭土∶V黄心土=1∶1)，于田间进行常规培育120 d后，测定其形态学指标。株高、冠幅和地径分别使用尺子和游标卡尺(精度0.1 mm)测量；叶长、叶宽、叶面积及叶形指数(每株选取第3~5位成熟叶片)使用叶面积仪测量(CL-203，CID，美国)。每个处理组随机选取10株进行测量，3次重复，取平均值。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2019对原始数据进行记录，利用SPSS 26.0软件进行方差分析，多重比较采用Duncan’s法，数据采用平均数 ± 标准误表示。绘图采用Origin 2019软件。
2. 结果与分析
2.1 不同处理对大花紫薇种子萌发的影响
表1结果显示，诱变时间相同时，发芽率、发芽势及发芽指数随着EMS浓度的升高呈下降趋势，部分处理种子发芽情况见图1。EMS质量浓度在16 g·L−1及以上时，发芽率迅速降低，12 h 20 g·L−1 EMS处理时降至为0，反映了高浓度EMS对发芽率的作用更加明显。发芽势反映种子生命力的强弱，决定种子出苗的整齐程度，在相同时间处理条件下，随着EMS浓度升高，发芽势递减，反映出EMS处理影响大花紫薇种子出苗的整齐程度。与发芽率相似，EMS质量浓度在16 g·L−1及以上时，发芽势迅速降低，表明高浓度的EMS更易使大花紫薇种子出苗不整齐。发芽指数也是反映种子活力的指标之一，本研究中发现EMS处理对大花紫薇种子毒害作用较强，与对照组相比，不同处理的发芽指数受到显著抑制，当EMS质量浓度高于14 g·L−1，各处理发芽指数均低于10。
表 1 不同EMS处理对大花紫薇种子发芽的影响1)Table 1. Effects of different EMS treatments on germination of Lagerstroemia speciosa seedst/h ρ/(g·L−1) 发芽率/%
Germination rate发芽势/%
Germination vigor发芽指数
Germination index8 0 72.22 ± 2.22a 55.33 ± 0.67a 18.67 ± 0.05a 12 68.89 ± 1.11ab 40.00 ± 0.00b 11.70 ± 0.27b 14 65.56 ± 2.94b 34.67 ± 1.76c 11.69 ± 0.65b 16 54.44 ± 1.11c 30.67 ± 0.67d 8.64 ± 0.37c 18 50.00 ± 1.92c 28.67 ± 1.33d 8.55 ± 0.63c 20 17.78 ± 2.22d 16.67 ± 1.76e 1.88 ± 0.25d 10 0 73.11 ± 1.74a 46.00 ± 1.39a 19.18 ± 0.43a 12 68.22 ± 0.97a 39.33 ± 3.33b 11.99 ± 0.41b 14 58.89 ± 1.60b 37.33 ± 1.76b 10.83 ± 0.47b 16 52.22 ± 1.11c 32.67 ± 1.76b 7.24 ± 0.40c 18 32.89 ± 1.98d 18.67 ± 2.67c 3.24 ± 0.13d 20 5.55 ± 2.22e 4.00 ± 0.00d 0.61 ± 0.16e 12 0 71.78 ± 0.97a 47.78 ± 1.11a 19.92 ± 0.65a 12 65.56 ± 1.82b 46.67 ± 1.76a 10.27 ± 0.28b 14 51.33 ± 1.76c 28.67 ± 1.33b 10.40 ± 0.42b 16 37.33 ± 0.67d 26.67 ± 0.67b 6.73 ± 0.36c 18 14.00 ± 2.31e 11.33 ± 1.33c 1.46 ± 0.29d 20 0.00 ± 0.00f 0.00 ± 0.00d 0.00 ± 0.00e 1) 相同时间同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)。
1) Different lowercase letters of the same column of the same time indicate significant differences (P < 0.05, Duncan’s method).![]()
图 1 部分处理大花紫薇种子同期萌发情况Figure 1. Simultaneous germination of Lagerstroemia speciosa seeds of partial treatment combinations图2为不同EMS浓度和处理时间下大花紫薇种子相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指数情况。与对照组相比，低浓度EMS处理相对发芽率无显著差异，12 g·L−1 EMS处理的相对发芽率均达90%，只有当EMS质量浓度在14 g·L−1以上时，相对发芽率才显著降低。在相同诱变时间条件下，EMS浓度的升高会导致相对发芽势降低。当诱变时间为8 h，相对发芽势变化区间为31.25%~75.00%，当诱变时间为10 h，相对发芽势变化区间为8.70%~85.51%，当诱变时间为12 h，相对发芽势变化区间为0~49.74%。相对发芽指数随着EMS浓度的升高而逐步降低，且当诱变时间为12 h时，降至为0。与对照组相比，当EMS质量浓度高于14 g·L−1时，各处理的相对发芽指数均低于50%。由此可见EMS处理对大花紫薇种子发芽率、相对发芽率、发芽势、相对发芽势、发芽指数和相对发芽指数均有较强的抑制作用，这种抑制作用在高浓度EMS处理下更为明显，并且随着抑制作用的加强，出现不发芽现象。
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图 2 不同EMS处理对大花紫薇种子发芽的影响各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)。Figure 2. Effects of different EMS treatments on germination of Lagerstroemia speciosa seedsIn each figure，different lowercase letters on bars of the same time indicate significant differences among treatments with different concentrations (P < 0.05, Duncan’s method).2.2 EMS处理对种子发芽进程的影响
由图3可知，EMS处理显著推迟了大花子薇种子的发芽起始时间，在诱变时间相同的情况下，随着EMS浓度的升高，发芽起始时间逐渐推迟。当诱变时间为8 h，发芽起始时间与对照组相比推迟了3.67~7.67 d；当诱变时间为10 h，各处理发芽起始时间与对照相比最少推迟了2.67 d，最长推迟了8.67 d；当诱变时间为12 h，发芽起始时间最早的是12 g·L−1 EMS处理，平均6.33 d开始发芽，比对照组推迟了3.33 d，发芽起始时间最晚的是18 g·L−1 EMS处理，平均10.00 d开始发芽，较对照组推迟了7.00 d。发芽持续时间在诱变时间为8 h时，随着EMS浓度的升高而变长，18 g·L−1 EMS处理发芽持续时间最长，为12.00 d，而20 g·L−1 EMS处理发芽持续时间又降至7.00 d；当诱变时间分别为10和12 h，发芽持续时间随着EMS浓度的升高先延长后缩短，均于14 g·L−1时达到最长，分别为8.67和9.67 d，较对照组延长了2.00和2.67 d。由此可得，在不同浓度和诱变时间作用下，随着EMS浓度的增加会使大花紫薇种子发芽起始时间推迟；高浓度的EMS会导致种子发芽率降低从而缩短发芽持续时间，总体上EMS处理还是会延长发芽的持续时间。
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图 3 不同EMS处理对大花紫薇种子发芽进程的影响各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)。Figure 3. Effects of different EMS treatments on germination process of Lagerstroemia speciosa seedsIn each figure，different lowercase letters on bars of the same time indicate significant differences among treatments with different concentrations (P < 0.05, Duncan’s method).2.3 EMS处理对胚轴和胚根长度的影响
由图4可知，诱变时间相同时，EMS浓度越高，胚轴长度较对照组变短，整体呈下降趋势，EMS诱变时间与胚轴长度的关系总体也呈现相同的规律。诱变时间为8 h时，12 g·L−1 EMS处理与对照组相比，无显著差异，当EMS浓度逐渐升高，对照组胚轴长度显著长于不同处理，20 g·L−1 EMS处理胚轴长度为8.12 mm，是对照组的49.12%；当诱变时间为10 h，不同处理胚轴长度较对照组缩短5.03~9.55 mm，其中18 g·L−1 EMS处理胚轴长度最短，为6.58 mm，是对照组的41.38%；当诱变时间为12 h，对照组胚轴长度为15.78 mm，而16和18 g·L−1 EMS处理胚轴长度为分别5.64和4.33 mm，仅分别为对照组的35.74%和27.44%。同一诱变时间，EMS浓度越高，胚根长度逐渐变短。在诱变时间为8 h，20 g·L−1 EMS处理胚根长度最短，为8.49 mm，是对照组的23.18%；诱变时间为10 h，18 g·L−1 EMS处理胚根最短，为6.80 mm，是对照组的19.69%，当EMS浓度升至20 g·L−1时，无胚根长出；诱变12 h，16 g·L−1 EMS处理胚根最短，长度仅有4.35 mm，仅为对照组的12.79%，而随着EMS浓度的升高，12 h 18 g·L−1 EMS处理出现无胚根现象。以上结果表明EMS处理能够抑制大花紫薇种子萌发初期胚轴和胚根的生长，且EMS浓度越高、时间越长，种子萌发初期生长受抑制效应越强，胚轴及胚根越短，甚至完全抑制胚根的生长。
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图 4 不同EMS处理对大花紫薇种子胚轴和胚根长度的影响各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)。Figure 4. Effects of different EMS treatments on hypocotyls length and radicle length of Lagerstroemia speciosaIn each figure，different lowercase letters on bars of the same time indicate significant differences among treatments with different concentrations (P < 0.05, Duncan’s method).2.4 EMS诱变半致死剂量
表2结果显示，不同EMS处理抑制了大花紫薇的萌发，EMS浓度越高，处理时间越长，其相对致死率越高。半致死剂量常为EMS诱变最适剂量，本研究中10 h 18 g·L−1 EMS处理相对致死率为55.02%，12 h 16 g·L−1EMS处理相对致死率为47.99%，以上2种处理与半致死剂量最为接近，可作为大花紫薇EMS诱变实际参考剂量。
表 2 不同EMS处理对大花紫薇种子相对致死率的影响Table 2. Effects of different EMS treatments on relative lethality of Lagerstroemia speciosa seedst/h ρ/(g·L−1) 相对致死率1)/%
Relative lethality8 0 0.00 ± 0.00d 12 4.61 ± 1.54cd 14 9.23 ± 4.07c 16 24.61 ± 1.54b 18 30.77 ± 2.66b 20 75.39 ± 3.08a 10 0 0.00 ± 0.00f 12 6.68 ± 1.33e 14 19.45 ± 2.19d 16 28.57 ± 1.52c 18 55.02 ± 2.70b 20 92.40 ± 3.04a 12 0 0.00 ± 0.00f 12 8.67 ± 2.53e 14 28.49 ± 2.46d 16 47.99 ± 0.93c 18 80.50 ± 3.22b 20 100.00 ± 0.00a 1) 相同时间同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)。
1) Different lowercase letters of the same column of the same time indicate significant differences (P < 0.05， Duncan’s method).2.5 EMS处理对幼苗生长的影响
不同EMS处理的大花紫薇种子萌发后移栽至穴盘，于植物生长室养护管理120 d后对其形态指标进行测定，结果见表3和表4。由表3可知经过EMS处理的大花紫薇幼苗生长受到明显影响，随着EMS浓度升高和处理时间延长，其株高呈逐渐下降趋势，12 h 16 g·L−1 EMS处理株高最小，高度仅为8.28 cm。EMS处理组冠幅与地径也呈现出同样的变化规律，均随着浓度及处理时间的加大而下降，且12 h 16 g·L−1 EMS处理受到抑制也最为明显，此时冠幅和地径分别为9.66 cm和1.70 mm，仅达到对照组的49.90%和52.63%。
表 3 不同EMS处理对大花紫薇幼苗生长的影响1)Table 3. Effects of different EMS treatments on the growth of Lagerstroemia speciosa seedlingst/h ρ/(g·L−1) 株高/cm
Plant
height冠幅/cm
Crown
width地径/mm
Ground
diameter8 0 32.23 ± 0.53a 23.54 ± 1.69a 3.53 ± 0.11a 12 22.61 ± 0.70b 18.22 ± 0.93b 2.87 ± 0.13b 14 19.53 ± 0.66c 16.81 ± 1.06bc 2.51 ± 0.07c 16 18.28 ± 0.64c 16.01 ± 0.61cd 2.09 ± 0.05d 18 14.10 ± 0.30d 14.64 ± 0.34de 1.97 ± 0.12d 20 11.15 ± 0.76e 13.25 ± 0.38e 2.00 ± 0.07d 10 0 32.01 ± 0.24a 20.96 ± 0.58a 3.37 ± 0.05a 12 20.49 ± 0.86b 15.23 ± 0.14b 2.51 ± 0.06b 14 13.77 ± 0.56c 13.82 ± 0.60b 2.15 ± 0.05c 16 10.87 ± 0.48d 10.94 ± 0.56c 1.87 ± 0.08d 18 8.95 ± 0.52e 10.29 ± 0.30c 1.89 ± 0.05d 20 12 0 30.31 ± 0.16a 19.36 ± 0.86a 3.23 ± 0.08a 12 16.29 ± 0.32b 13.73 ± 0.59b 2.29 ± 0.06b 14 11.36 ± 0.48c 10.59 ± 0.22c 2.00 ± 0.06c 16 8.28 ± 0.30d 9.66 ± 0.25c 1.70 ± 0.03d 18 20 1) 相同时间同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)。
1) Different lowercase letters of the same column of the same time indicate significant differences (P < 0.05， Duncan’s method).表 4 不同EMS处理对大花紫薇幼苗叶片的影响1)Table 4. Effects of different EMS treatments on the leaves of Lagerstroemia speciosa seedlingst/h ρ/(g·L−1) 叶长/cm
Leaf length叶宽/cm
Leaf width叶形指数
Leaf index叶面积/cm2
Leaf area8 0 14.69 ± 0.41a 7.23 ± 0.25a 2.03 ± 0.02b 84.70 ± 3.94a 12 12.89 ± 0.43b 6.16 ± 0.23b 2.10 ± 0.05b 65.05 ± 2.44b 14 12.89 ± 0.26b 6.12 ± 0.04b 2.11 ± 0.04b 62.18 ± 1.14b 16 10.47 ± 0.38c 4.89 ± 0.12c 2.15 ± 0.03b 38.68 ± 3.33c 18 10.10 ± 0.35c 4.81 ± 0.17c 2.12 ± 0.01b 40.07 ± 3.18c 20 8.73 ± 0.65c 3.71 ± 0.33d 2.44 ± 0.04a 28.45 ± 4.62d 10 0 14.70 ± 0.27a 7.25 ± 0.16a 2.03 ± 0.01c 85.90 ± 2.03a 12 12.03 ± 0.30b 5.79 ± 0.16b 2.08 ± 0.02bc 59.68 ± 0.97b 14 9.88 ± 0.29c 4.71 ± 0.16c 2.10 ± 0.03bc 38.69 ± 1.04c 16 8.58 ± 0.31d 4.01 ± 0.11d 2.16 ± 0.02b 30.22 ± 1.38d 18 7.71 ± 0.12d 3.30 ± 0.07e 2.42 ± 0.02a 21.08 ± 1.03e 20 12 0 14.95 ± 0.08a 7.34 ± 0.10a 2.04 ± 0.01b 78.47 ± 0.31a 12 11.81 ± 0.04b 5.65 ± 0.04b 2.09 ± 0.01b 53.41 ± 0.39b 14 9.89 ± 0.46c 4.62 ± 0.26c 2.14 ± 0.02b 36.96 ± 0.92c 16 9.04 ± 0.21c 3.89 ± 0.16d 2.42 ± 0.08a 29.32 ± 1.56d 18 20 1) 相同时间同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P < 0.05， Duncan’s法)。
1) Different lowercase letters of the same column of the same time indicate significant differences (P < 0.05， Duncan’s method).表4反映了不同EMS处理对大花紫薇幼苗叶片的影响，结果显示EMS处理组的叶长、叶宽及叶面积均受到抑制，与对照组差异显著，并且随着EMS浓度和处理时间的加大，抑制作用越明显，10 h 18 g·L−1 EMS处理叶片生长受抑制情况最强，其叶长为7.71 cm，叶宽为3.30 cm，叶面积为21.08 cm2，分别是对照组的52.45%、45.52%和24.54%。叶形指数受EMS处理影响不明显，不同处理组随着EMS浓度的升高，叶形指数缓慢递增。当处理时间为8 h时，不同浓度EMS处理组叶形指数为2.10~2.44，当处理时间为10 h时，不同浓度EMS处理组叶形指数为2.08~2.42，当处理时间为12 h时，不同浓度EMS处理组叶形指数为2.09~2.42。此外，由于12 h 18 g·L−1 EMS和12 h 20 g·L−1 EMS处理导致种子萌发无胚根产生，相关处理组移栽后无存活植株。
3. 讨论与结论
3.1 讨论
EMS处理对种子发芽具有抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显，这是因为EMS浓度越高越易溶解产生有机酸，毒害作用越强，对种子造成不可逆的严重损伤[19]。王育川等[20]研究发现，随着EMS浓度和处理时间的加大，藜麦Chenopodium quinoa种子发芽势和发芽率呈现下降趋势，表明诱变剂EMS对种子发芽率及发芽势具有抑制作用。本研究通过设置不同浓度EMS和处理时间对大花紫薇进行诱变发现，EMS处理能够显著影响大花紫薇种子的发芽，随着EMS浓度的升高，处理时间的加长，发芽率、发芽势和发芽指数均减小，结果与前人结论一致。EMS处理影响种子发芽进程。本研究中随着EMS浓度及处理时间的加大，发芽起始时间变晚，发芽持续时间变长，但高浓度、长时间的处理组合下，可能由于诱变剂的毒害作用使得发芽种子数变少，发芽持续时间变短。该结论与伊风艳等[21]用EMS处理黄花苜蓿Medicago falcata种子的结论一致，但不同于赵塔等[22]处理党参Codonopsis pilosula种子的结果，不同之处在于党参种子发芽持续时间随着EMS浓度的升高而变短，这种差异可能是植物种类不同造成的，EMS处理降低大花紫薇种子活力，使种子发芽不整齐，造成发芽持续时间延长。胚轴及胚根的生长也受到EMS处理的影响。本研究结果显示，大花紫薇种子胚轴及胚根的长度与EMS浓度和处理时间呈负相关，这与李颜方等[23]对谷子‘晋谷21号’Setaria italica var. germanica进行EMS诱变时所获结果一致。
大量研究表明植株诱变相对致死率达50%时的剂量可作为EMS诱变最佳剂量，不仅可以保证获得更多的突变体植株，又可以增加植物多样性[24-28]。本研究结合大花紫薇种子发芽相对致死率及胚轴、胚根生长情况确定大花紫薇的EMS最适诱变剂量为10 h 18 g·L−1 EMS处理和12 h 16 g·L−1 EMS处理，该结果与伍汉斌等[29]对同属的紫薇进行EMS诱变时获得的半致死剂量相差较大，原因可能是选用的育种方式不同，本研究选用培养皿催芽，而后者选用沙藏法进行紫薇育苗，最终造成结果差异较大。因此，植物EMS诱变育种在剂量选择时需根据物种、条件进行调整，本研究得到的大花紫薇适宜的诱变剂量仅在本文特定的条件下使用，实际生产中可能需在此基础做出微调。
EMS诱变为不定向诱变，但不同处理组合对植物生长会产生一定的效应，且这种效应与EMS浓度及处理时间存在一定的关系[30]。续言等[31]研究发现高浓度的EMS处理促进尾叶紫薇叶片增大，较低浓度EMS处理则促进株高增长，而对幼苗的冠幅和地径等的处理效应不明显。常媚瑕[32]在EMS诱变朝天椒Capsium annuum var. conoides研究中发现，随着EMS浓度的升高、处理时间的延长，大花紫薇幼苗在株高、冠幅、地径、叶长、叶宽、叶面积等方面均受到抑制，而叶形指数较对照处理变大。本研究结果与前者存在差异，和后者相一致，这可能是因为EMS诱变效应存在很大的随机性，处理个体差异较大，在选苗测定时导致差异的产生，为探究具体变化规律需加大测定样本进行进一步分析。
表型性状的突变类型及突变频率对评价诱变群体具有重要意义[33]。张慧等[34]认为EMS诱变后产生的多为隐性突变，突变性状在M1代很少表现，只有经过自交后才能有所表现，因此有关诱变的研究不在M1代对诱变植株进行选择；而Greene等[35]则认为EMS诱发的突变以显性突变为主，诱变性状多为主基因控制的性状，便于突变体的筛选。木本植物生长周期较长，即使是显性突变，也需要在植物成熟后才能确定，本研究EMS诱导获得的大花紫薇植株目前尚不能确定是否发生有益突变，未来将长期对其进行观测，期望能够获得理想的突变单株。
3.2 结论
目前，EMS诱导大花紫薇研究鲜见报道，对其影响大花紫薇种子萌发的情况更是知之甚少。本研究通过设置不同浓度EMS溶液和诱变时间，探究出不同处理对大花紫薇种子萌发、幼苗生长及叶片情况的动态影响，进而确定了大花紫薇种子EMS诱变最佳剂量。利用大花紫薇种子进行EMS诱变时，EMS浓度越高、诱导时间越长，种子发芽率、发芽势及发芽指数受到抑制越明显，萌发初期的生长受抑制效应越强，胚轴及胚根越短，甚至会完全抑制胚根的生长，导致移栽无法存活。最终以半致死剂量作为大花紫薇种子EMS诱变标准，本研究确定了16 g·L−1 EMS处理12 h和18 g·L−1 EMS处理10 h是大花紫薇适宜的诱变剂量，为后续大花紫薇种质资源挖掘、创新利用及优良品系创制提供了材料和理论依据。
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图 3 稻瘟病菌侵染过程中OsCdc48的表达分析
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，各图中柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。
Figure 3. Analysis of OsCdc48 expression during infection with Magnaporthe oryzae
Data presented in two figures are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns in each figure indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).
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图 4 OsCdc48序列分析
图C中，黑色圆点为OsCdc48；图D中，第1个序列为OsCdc48，第2个序列为AtCdc48。
Figure 4. Sequence analysis of OsCdc48
In figure C, the black dot represents OsCdc48; In figure D, the first sequence represents OsCdc48, the second sequence represents AtCdc48.
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图 6 OsCdc48在水稻各组织中的相对表达量
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。
Figure 6. Relative expression of OsCdc48 in various rice tissues
Data presented in figure are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).
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图 7 ko-oscdc48突变体的靶位点和突变序列
Figure 7. Target sites and mutation sequences of ko-oscdc48 mutant
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图 9 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的表型
Figure 9. Phenotype of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
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图 10 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的病斑长度
图中数据为平均值±标准差，n > 6，**表示突变体与野生型在P < 0.01水平差异显著(t检验)。
Figure 10. Lesion length of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
Data presented in two figures are means ± standard deviations, n > 6, ** indicates significant differences between the mutant and wild type at P < 0.01 level (t test).
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图 11 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL病程相关基因的表达
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，*和***分别表示在P < 0.05和P < 0.001水平差异显著(t检验)。
Figure 11. Expression of disease-related genes in ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
Data presented in three figures are means ± standard deviations of three independent experiments, * and *** indicate significant differences at P < 0.05 and P < 0.001 levels respectively (t test).
表 1 本研究用到的引物
Table 1 Primers used in this study
名称
Name正向序列(5′→3′)
Forward sequence反向序列(5′→3′)
Reverse sequenceOsCdc48-target TAGGTCTCCTTATGGACCCCC GTTTTAGAGCTAGAA CGGGTCTCAATAAAGCAGTATTGCACCAGCCGGGAA OsCdc48-test AGACCTTTTCCTTGTTAGGGG AGCTTTGAGCCCATCCATAAG OsActin TGTATGCCAGTGGTCGTACCA CCAGCAAGGTCGAGACGAA OsCdc48-qPCR GAATGCTCTTGCCAAATACACC TCCTCCGCTTCTCCATCTCG PR10 CGCCGCAAGTCATGTCCTA GCTTCGTCTCCGTCGAGTGT OsPAL1 AGGAGCTCGGCTGCGTATT ATGCCGAGGAACACCTTGTT PR1a GGAAGTACGGCGAGAACATC TGGTCGTACCACTGCTTCTC OsCdc48-AAA2-CLuc agaacacgggggacgagctcATGTCCAAAGGTGTTCTGTT atcgagtacgcggaccggccATCAGGCAGAGGAATGTAGA OsCdc48-AAA1-CLuc agaacacgggggacgagctcCCTCCAAAGGGCATACTGCTT atcgagtacgcggaccggccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA2 taccagattacgctcatatgATGTCCAAAGGTGTTCTGTT gctcgagctcgatggatcccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA1 taccagattacgctcatatgCCTCCAAAGGGCATACTGCTT gctcgagctcgatggatcccTTTAGGCTTGAAGGTAAGCC Pik1 H4-NLuc ggacgagctcggtacccATGGAGGCGGCTGCCATG gtacgagatctggtcgacGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT BD-Pik1 H4 gaggaggacctgcatATGATGGAGGCGGCTGCCATG gcaggtcgacggatccctaGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT 
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