Interaction mechanism between OsCdc48 and Pik1-H4, and its regulation on rice blast disease resistance
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摘要:目的
探究Pik1-H4与细胞周期蛋白OsCdc48的互作机制，明确其在稻瘟病抗性中的作用。
方法首先，分别利用酵母双杂交试验和荧光素酶互补试验验证Pik1-H4与OsCdc48的相互作用；然后，通过RT-qPCR分析OsCdc48在稻瘟病菌侵染后的表达情况及组织表达特异性；其次，分析OsCdc48的序列保守性、蛋白结构域、系统进化关系、蛋白质三维结构预测及其亚细胞定位；最后，利用CRISPR/Cas9创制OsCdc48突变体，并对其进行稻瘟病抗性鉴定和病程相关基因表达分析。
结果证实了Pik1-H4与OsCdc48的互作，且OsCdc48受稻瘟病菌侵染诱导表达。OsCdc48在各组织中均有表达，其编码蛋白定位于细胞核与细胞质。OsCdc48在不同物种中序列保守，与玉米和高粱的亲缘关系最近，预测会形成同源六聚体。OsCdc48功能缺失突变体ko-oscdc48病程相关基因上调表达，对稻瘟病抗性增强。
结论本研究为深入揭示OsCdc48与NLR蛋白Pik1-H4调控稻瘟病抗性的机制及水稻抗病育种提供了理论基础。
Abstract:ObjectiveTo investigate the interaction mechanism between Pik1-H4 and cell division cycle protein OsCdc48, clarify its role in rice blast disease resistance.
MethodFirstly, the interactions between Pik1-H4 and OsCdc48 were verified using yeast two-hybrid and luciferase complementation assays. Then, the expression patterns of OsCdc48 after infection of Magnaporthe oryzae and its tissue-specific expression were analyzed by RT-qPCR. Next, the determination of OsCdc48’s sequence conservation, protein domains, phylogenetic relationships, protein 3D structure prediction and subcellular localization were performed. Finally, OsCdc48 mutant was created using CRISPR/Cas9 technology, the resistance identification of transgenic mutant to rice blast disease and expression analysis of pathogenesis-related genes were also conducted.
ResultThe interactions between Pik1-H4 and OsCdc48 were confirmed, and OsCdc48 was induced by rice blast fungus infection. OsCdc48 was expressed in all tissues and was localized to the nucleus and cytoplasm. The sequence of OsCdc48 was conserved across different species, with the closest phylogenetic relationship to maize and sorghum, and it might form homologous hexamers. The OsCdc48 loss-of-function mutant ko-oscdc48 up-regulated the expression of disease-related genes and enhanced the resistance to rice blast disease.
ConclusionThis study lays a theoretical basis for further elucidating the mechanism of OsCdc48 and NLR protein Pik1-H4 regulating blast disease resistance and rice disease-resistant breeding.
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Keywords:
- Oryza sativa L. /
- Rice blast disease /
- Magnaporthe oryzae /
- Pik1-H4 /
- OsCdc48
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水稻Oryza sativa L.是世界上重要的粮食作物，养活了世界上一半的人口[1]。然而，水稻生产受到各种生物胁迫的困扰，其中稻瘟病是制约全球水稻产量的最重要因素之一[2]。由于其对水稻生产造成巨大影响，水稻与稻瘟病的相互作用已有数十年的研究历史，并已成为植物−真菌相互作用研究的模型系统[3]。在真菌入侵期间，水稻细胞首先识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，触发特异但相对低水平的免疫反应，即PAMP诱导免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)[4]。植物细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)识别病原菌的PAMPs或损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)，引发一系列免疫反应，包括钙离子内流、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)激活、植物激素合成、气孔关闭、胼胝质沉积、转录和代谢重编程等，从而抵御病原菌的入侵[5]。为了成功感染，病原体释放多种效应因子干扰PTI[6-7]。为了对抗这些效应因子，植物利用抗病(Resistance，R)蛋白识别病原体效应因子，触发效应因子诱导免疫(Effector-triggered immunity，ETI)[8]，从而局部限制病原体的传播[7]。ETI依赖于R基因发挥作用，而利用R基因也是生产上防控稻瘟病最经济、有效和环保的策略[9]。目前已鉴定和克隆的大多数稻瘟病R基因编码NLR类受体蛋白，其中Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pikh和Pita等NLR蛋白表现出持续的广谱抗病性[10]，具有较好的应用前景，在水稻种植区有较好的应用价值。解析这些NLR蛋白介导的水稻广谱抗瘟机制对进一步有效利用R基因具有重要意义。
OsCdc48是AAA-ATPase酶家族成员，参与调控多种细胞生命活动。已有研究证实，OsCdc48蛋白要经过翻译后修饰的调节，以同源六聚体结构形式与互作蛋白或者辅助因子共同作用将其引导至不同的细胞信号传导途径，涵盖免疫、蛋白合成与降解、细胞周期调节、基因组稳定性、囊泡运输、自噬等[11-12]。在拟南芥中，AtCDC48与激酶SERK1相互作用介导拟南芥中防御相关信号的转导[13-14]，同时研究还发现AtCDC48A会影响富含亮氨酸的重复蛋白转换进而调节拟南芥的免疫[15]。在水稻中，其同源蛋白OsCdc48对于叶片衰老、生长、发育和存活至关重要[16]，然而，OsCdc48是否调节水稻对稻瘟病真菌的免疫尚不清楚。本研究旨在探究OsCdc48与Pik1-H4的互作机制及其在稻瘟病抗性中的作用，为进一步解析NLR蛋白介导的水稻抗瘟机制提供新见解。
1. 材料与方法
1.1 水稻材料和稻瘟病菌株
本试验所用到的主要水稻材料包括：‘丽江新团黑谷’(LTH)、以LTH为背景构建的Pik-H4近等基因系(Near-isogenic line)材料Pik-H4 NIL以及‘中花11’。水稻材料种植在人工气候室(温度28 ℃、黑暗12 h/光照12 h)。
稻瘟病菌生理小种GDYJ7于广东省阳江市自然病圃分离、获得，该生理小种属于籼型致病菌株，致病范围较广，且含有无毒基因AvrPikE。Pik-H4 NIL对GDYJ7具有抗性而对不含有无毒基因AvrPikE的GUY11菌株不具有特异性免疫。
1.2 稻瘟病接种
参考Li等[17]的方法分别对3周龄感病材料LTH和抗病材料Pik-H4 NIL进行稻瘟病菌喷雾接种。孢子数量调节至5×105 mL−1(含φ为0.01%的吐温−20)，使用含0.01%(φ)吐温−20的ddH2O作为对照。将接种稻瘟病菌后的水稻幼苗置于25 ℃、相对湿度为85%的暗室24 h，然后在24~26 ℃、14 h光照/10 h黑暗循环、相对湿度为85%的人工气候室培养。按照0、12、24、36、48、60、72 h取样进行RNA的提取与荧光定量分析，每个处理3次生物学重复。突变体抗性检测采用离体打孔方法接种鉴定，孢子数量同喷雾接种，在接种7 d后测量病斑长度。
1.3 酵母双杂交试验
利用聚乙二醇(PEG3350)/醋酸锂(LiAc)转化法将不同的试验组合的质粒共同转入酵母菌株Y2H Gold中，涂布在SD/-Trp-Leu缺陷培养基上，于30 ℃培养箱培养3~4 d。待长出单克隆后，将各个组合的酵母挑取单克隆进行梯度稀释，点板至SD/-Trp-Leu，涂布在含4 mg·mL−1 X-α-Gal(5−溴−4−氯−3−吲哚−α−D−半乳糖苷)溶液的SD/-Trp-Leu-His-Ade缺陷培养基(以含有pGBKT7-Lam和pGADT7-T的Y2H Gold酵母菌株为阴性对照、含有pGBKT7-P53和pGADT7-T的Y2H Gold酵母菌株为阳性对照)上，于30 ℃培养箱培养3~5 d，观察酵母的生长情况。
1.4 荧光素酶互补试验
将荧光素酶互补试验相关质粒转化到GV3101农杆菌感受态细胞，在LB固体培养基(含50 μg·mL−1卡那霉素和50 μg·mL−1利福平)于30 ℃黑暗培养2 d，挑取完成转化的农杆菌转移至对应抗性的LB液体培养基中，30 ℃扩摇至D600 nm=0.6，离心去上清液，用侵染液(含10 mmol·L−1 MgCl2、10 mmol·L−1 MES、150 μmol·L−1乙酰丁香酮，pH=5.6)调整菌液浓度至D600 nm=0.4，然后室温静置2 h，按照试验组合将农杆菌两两混匀。选择生长4~5周、状态良好的烟草，侵染前干旱1 h。从叶片下表皮注射菌液，保持每片叶片内各个注射位置面积一致，注射完成后保温保湿、暗处理1 d，正常培养2 d后，使用植物活体成像仪(Berthold NightSHADE LB985)拍照观察。
1.5 RT-qPCR
使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取水稻叶片RNA，使用AceQ公司Evo-M-MLV反转录预混试剂盒进行反转录，使用诺唯赞的AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix试剂盒进行荧光定量分析，并在ABI StepOne实时荧光定量PCR检测系统上进行RT-qPCR反应。使用Excel进行数据分析，与管家基因OsActin进行比较，使用2–△△CT法计算相对表达水平[18]。本试验使用的基因特异性引物列于表1。
表 1 本研究用到的引物Table 1. Primers used in this study名称
Name正向序列(5′→3′)
Forward sequence反向序列(5′→3′)
Reverse sequenceOsCdc48-target TAGGTCTCCTTATGGACCCCC GTTTTAGAGCTAGAA CGGGTCTCAATAAAGCAGTATTGCACCAGCCGGGAA OsCdc48-test AGACCTTTTCCTTGTTAGGGG AGCTTTGAGCCCATCCATAAG OsActin TGTATGCCAGTGGTCGTACCA CCAGCAAGGTCGAGACGAA OsCdc48-qPCR GAATGCTCTTGCCAAATACACC TCCTCCGCTTCTCCATCTCG PR10 CGCCGCAAGTCATGTCCTA GCTTCGTCTCCGTCGAGTGT OsPAL1 AGGAGCTCGGCTGCGTATT ATGCCGAGGAACACCTTGTT PR1a GGAAGTACGGCGAGAACATC TGGTCGTACCACTGCTTCTC OsCdc48-AAA2-CLuc agaacacgggggacgagctcATGTCCAAAGGTGTTCTGTT atcgagtacgcggaccggccATCAGGCAGAGGAATGTAGA OsCdc48-AAA1-CLuc agaacacgggggacgagctcCCTCCAAAGGGCATACTGCTT atcgagtacgcggaccggccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA2 taccagattacgctcatatgATGTCCAAAGGTGTTCTGTT gctcgagctcgatggatcccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA1 taccagattacgctcatatgCCTCCAAAGGGCATACTGCTT gctcgagctcgatggatcccTTTAGGCTTGAAGGTAAGCC Pik1 H4-NLuc ggacgagctcggtacccATGGAGGCGGCTGCCATG gtacgagatctggtcgacGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT BD-Pik1 H4 gaggaggacctgcatATGATGGAGGCGGCTGCCATG gcaggtcgacggatccctaGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT 1.6 生物信息学分析
使用国家水稻数据中心数据库(https://www.ricedata.cn/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询基因序列、蛋白家族；通过SMART网站(http://smart.emblheidelberg.de/)分析蛋白结构域；使用MEGA 11软件对OsCdc48进行氨基酸序列比对，完成进化树分析；利用DNAMAN进行蛋白序列多重比较分析；利用UNIPROT(https://www.uniprot.org/)对OsCdc48蛋白的三维结构进行预测分析。
1.7 亚细胞定位试验
将‘中花11’种子去壳消毒后，接种到1/2MS固体培养基中，黑暗培养14 d。挑取健康粗壮的白化苗，利用酶解法[19]制备水稻的原生质体。将试验组OsCdc48-GFP与NLS-RFP质粒、对照组35S-GFP与NLS-RFP质粒分别混匀，采用PEG转化法转化到水稻原生质体中，于26 ℃黑暗培养14 h，使用激光共聚焦显微镜(Carl ZEISS LSM800 with Airysan)观察。
1.8 利用CRISPR/Cas9创制ko-oscdc48水稻突变体
为了获得ko-oscdc48突变体，设计了引物OsCdc48-target以合成引导RNA(gRNA)，进而靶向靶基因的外显子。合成的gRNA经寡核苷酸退火形成各自的寡核苷酸衔接子，然后将其单独连接到pRGEB32载体。将CRISPR/Cas9质粒转入根癌农杆菌EHA105中，然后通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织[20]。利用引物OsCdc48-test对转基因植株的目标基因靶点进行PCR扩增，然后测序，作进一步检测分析。
2. 结果与分析
2.1 Pik1-H4与OsCdc48的相互作用分析
我们前期筛选到可能与Pik1-H4互作的蛋白OsCdc48(Os03g0151800)，为了验证Pik1-H4与OsCdc48的互作，我们构建了pGBKT7-Pik1-H4、pGADT7-OsCdc48-AAA1(第243—379位氨基酸)、pGADT7-OsCdc48-AAA2(第516—655位氨基酸)载体，并进一步利用酵母双杂交进行相互作用验证。结果(图1)表明，所有共转的酵母组合均能在SD/-Trp-Leu缺陷培养基上正常生长，证明2种质粒被同时成功转入了酵母细胞中。pGBKT7-Pik1-H4+pGADT7-OsCdc48-AAA1和pGBKT7-Pik1-H4+pGADT7-OsCdc48-AAA2均能够在SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-Gal缺陷培养基上生长，菌落均显蓝色，表明Pik1-H4与OsCdc48-AAA1及OsCdc48-AAA2均能在酵母细胞中发生相互作用。为进一步验证Pik1-H4与OsCdc48-AAA1及OsCdc48-AAA2互作关系的真实性，构建了Pik1-H4与OsCdc48-AAA1及OsCdc48-AAA2荧光素酶互补试验载体，侵染烟草后通过植物活体成像仪拍照观察。结果如图2A、2B所示，在烟草细胞中，Pik1-H4与OsCdc48-AAA1及OsCdc48-AAA2均表现较强的荧光信号，表明Pik1-H4与OsCdc48存在相互作用。
2.2 稻瘟病菌侵染过程中OsCdc48在Pik-H4 NIL中的表达分析
在Pik-H4 NIL中，OsCdc48的表达量受稻瘟病菌诱导，在6、12、24、48、60、72 h上调(图3A)；在LTH中，OsCdc48的表达量在接种稻瘟病菌6、36、60 h后显著下调(图3B)。上述结果说明在Pik-H4 NIL中OsCdc48响应稻瘟病菌侵染，并有可能参与抗病反应信号通路。
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图 3 稻瘟病菌侵染过程中OsCdc48的表达分析图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，各图中柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。Figure 3. Analysis of OsCdc48 expression during infection with Magnaporthe oryzaeData presented in two figures are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns in each figure indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).2.3 OsCdc48基因序列分析
在国家水稻数据中心数据库搜索OsCdc48，分析发现：OsCdc48基因序列全长5 587 bp，有9个外显子和8个内含子，编码区全长2 430 bp，编码含809个氨基酸的蛋白(图4A)。通过SMART网站分析蛋白结构域发现其有4个结构域：OsCdc48_N(由第32—115位氨基酸组成)、OsCdc48_2(由第132—198位氨基酸组成)、2个AAA结构域(分别由第243—379位氨基酸和第516—655位氨基酸组成)，属于一个Ⅱ型AAA-ATPase蛋白(图4B)。为进一步分析OsCdc48在不同物种中的亲缘关系，在NCBI下载不同物种Cdc48的蛋白序列，通过MEGA 11构建系统发育树。结果(图4C)表明，OsCdc48与拟南芥Arabidopsis thaliana AtCdc48的亲缘关系较远，与高粱Sorghum bicolor和玉米Zea mays Cdc48的亲缘关系较近。对水稻和拟南芥Cdc48蛋白序列在DNAMAN上进行蛋白序列多重比较分析，尽管拟南芥AtCdc48与水稻OsCdc48在进化树上距离比较远，但是多重比较结果显示它们具有91.1%的相似性(图4D)，说明了Cdc48在不同物种中的序列保守性。我们进一步利用UNIPROT对OsCdc48蛋白的三维结构进行预测分析，发现其是由6个单体形成1个六圆环的同源六聚体(图4E)。
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图 4 OsCdc48序列分析图C中，黑色圆点为OsCdc48；图D中，第1个序列为OsCdc48，第2个序列为AtCdc48。Figure 4. Sequence analysis of OsCdc48In figure C, the black dot represents OsCdc48; In figure D, the first sequence represents OsCdc48, the second sequence represents AtCdc48.2.4 OsCdc48亚细胞定位及其编码基因的组织表达分析
为了明确OsCdc48蛋白在水稻细胞中的定位，本试验构建了OsCdc48与GFP融合表达载体，以35S-GFP与NLS-RFP为对照，分析OsCdc48在水稻原生质体中的亚细胞定位。结果(图5)表明，在试验组中可观察到定位于细胞核的GFP荧光与核定位RFP信号的荧光完全重合，同时发现部分GFP荧光在细胞质中；对照组中水稻细胞各个部位均可观察到绿色荧光信号，部分GFP荧光与核定位RFP信号重叠。上述结果说明OsCdc48蛋白定位于细胞核和细胞质中。
为分析OsCdc48的组织表达特异性，提取水稻叶片、种子、愈伤组织、茎、根、颖壳和花的RNA，进一步通过RT-qPCR来检测OsCdc48在各个组织中的表达情况。结果(图6)表明，OsCdc48在种子中的表达水平最高，其次是在愈伤组织中；在根和花中的表达水平相似；在茎、叶和颖壳中的表达水平最低。综上所述，OsCdc48蛋白在水稻各组织中均有表达。
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图 6 OsCdc48在水稻各组织中的相对表达量图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。Figure 6. Relative expression of OsCdc48 in various rice tissuesData presented in figure are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).2.5 利用CRISPR/Cas9技术创制ko-oscdc48突变体
为了明确OsCdc48与Pik1-H4互作具体的分子调控模式，本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除抗病材料Pik-H4 NIL中的OsCdc48，获得1株纯合突变体，其在OsCdc48的第4个外显子缺失了1 bp，命名为ko-oscdc48。该突变体缺失的1个碱基引起了氨基酸移码突变，导致编码的蛋白提前终止(图7)。ko-oscdc48的株型与野生型Pik-H4 NIL的株型相似(图8)。
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图 7 ko-oscdc48突变体的靶位点和突变序列Figure 7. Target sites and mutation sequences of ko-oscdc48 mutant2.6 OsCdc48对水稻稻瘟病抗性的调控分析
为了分析OsCdc48在水稻对稻瘟病抗性中的作用，我们使用相对于野生型Pik-H4 NIL的毒性菌株GUY11(不含AvrPikE)和无毒稻瘟病菌株GDYJ7(含AvrPikE)分别接种处理ko-oscdc48和Pik-H4 NIL。结果表明，无论接种GDYJ7还是GUY11，与Pik-H4 NIL相比，ko-oscdc48植株对稻瘟病的抗性显著增强(图9、10)。为进一步了解敲除OsCdc48如何影响水稻对稻瘟病菌的抗性，分析了喷雾接菌24 h后水稻病程相关基因表达量的变化情况，以不接菌为对照(CK)。结果表明，在ko-oscdc48突变体中，接种GUY11后OsPR10、OsPR1a和OsPAL1的表达水平相较于Pik-H4 NIL明显上调，尤其是OsPR10和OsPAL1显著上调；类似地，在接种GDYJ7后，ko-oscdc48中OsPR10、OsPR1a和OsPAL1的表达水平也相较于野生型Pik-H4 NIL明显上调，特别是OsPR10和OsPR1a显著上调(图11)。这表明敲除OsCdc48上调水稻病程相关基因的表达，从而增强植株对稻瘟病的抗性。因此，OsCdc48通过影响病程相关基因的表达来负调控水稻对稻瘟病的抗性。
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图 9 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的表型Figure 9. Phenotype of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7![]()
图 10 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的病斑长度图中数据为平均值±标准差，n > 6，**表示突变体与野生型在P < 0.01水平差异显著(t检验)。Figure 10. Lesion length of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7Data presented in two figures are means ± standard deviations, n > 6, ** indicates significant differences between the mutant and wild type at P < 0.01 level (t test).![]()
图 11 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL病程相关基因的表达图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，*和***分别表示在P < 0.05和P < 0.001水平差异显著(t检验)。Figure 11. Expression of disease-related genes in ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7Data presented in three figures are means ± standard deviations of three independent experiments, * and *** indicate significant differences at P < 0.05 and P < 0.001 levels respectively (t test).3. 讨论与结论
目前水稻中已有30个稻瘟病抗性基因被克隆，除Pid2与pi-21外，其他的均编码NBS-LRR类蛋白[21]，这类R蛋白直接或间接地识别稻瘟病菌分泌的效应蛋白，从而激活下游的抗病信号途径使水稻产生抗性[22]。为了阐明R基因在植物免疫信号通路和网络的功能，人们对R基因进行了深入的研究。在水稻中，NLR抗病蛋白PigmR可通过与PICI1竞争性结合，保护PICI1免受稻瘟病菌效应因子的攻击，从而促进乙烯生成，增强水稻对稻瘟病的广谱抗性[23]；OsVOZ1/2转录因子作为桥梁连通泛素连接酶APIP10和Piz-t，负调控对稻瘟病的基础抗性和正调控NLR受体蛋白Piz-t介导的ETI反应[24]；Pijx蛋白与ATP合成酶β亚基互作，促进其泛素化降解，从而激活呼吸暴发氧化酶的活性，诱导活化氧暴发，使水稻株系获得抗性[25]；SH3P2优先与AvrPib互作，使SH3P2从Pib的CC结构域分离，减轻SH3P2介导的Pib二聚化抑制，进而激活Pib介导的抗性[26]；Pik1-H4互作蛋白OsCOL9可以激活乙烯和水杨酸途径，正向调控稻瘟病抗性[27]；同样与Pik1-H4互作的蛋白OsBIHD1通过影响发病相关基因和乙烯途径正向调控稻瘟病的抗性[28]。
R蛋白通常会与一些调节R蛋白结合能力、稳定性及定位等的宿主蛋白互作形成R蛋白复合体来调控防御反应。未受病原物侵染时，R蛋白复合体一般稳定地处于非激活状态；受病原物侵染时，R蛋白复合体的结构可能会被病原物分泌的效应蛋白改变从而被激活并产生一系列生理生化反应，最终使植物产生过敏性坏死反应[29-31]。如果没有病原物侵染时R蛋白复合体被激活或者R蛋白被组成型表达，植物则通常会出现自我免疫、严重的生理缺陷甚至死亡的现象[32-34]，如Pto、Prf及Rps2等抗性基因的过度表达会使植物产生组成型激活的抗病反应[35-36]；RPW8的过度表达甚至会引起植物出现致死表型[37]。这些研究表明植物在没有受到病原物侵染时，R基因及其表达产物必须受到严密的调控才能维持植物个体的正常生长发育[38]。
DNA甲基化、转录调控、RNA加工、蛋白质修饰、蛋白质稳定性及蛋白核质运输等的调控在R基因介导自身免疫反应发生过程中起重要作用[39]。目前对R基因调控的研究多集中于转录后水平的调节上：如亚麻抗病基因N、L6，抗烟草花叶病毒N基因及拟南芥抗病基因RPP5、RPS4均存在转录后选择性剪切的现象[33, 40-41]。
前期研究中，我们以Pik1-H4为诱饵蛋白，进行酵母双杂交文库的筛选，在其中鉴定到1个细胞周期蛋白OsCdc48；本研究进一步证实Pik1-H4与OsCdc48存在直接的相互作用，而且OsCdc48的表达受到稻瘟病菌的显著诱导，推测OsCdc48在Pik1-H4介导的抗病通路中发挥一定作用。通过原生质体游离技术和激光共聚焦技术观察到该蛋白定位于细胞核和细胞质，这一结果与Shi等[16]、Huang等[42]一致。组织表达特异性试验证明，OsCdc48在各个组织均有表达，但在种子和愈伤组织中表达量较高，推测可能与OsCdc48参与细胞周期调控有关。在酵母和哺乳动物中，Cdc48识别并从每个细胞结构中分离错误折叠的泛素化底物，并将它们解折叠到细胞质或细胞核中以进行随后的蛋白酶体降解[43-44]。最近在植物中也发现CDC48有类似功能，CDC48A缺陷导致拟南芥中泛素化叶绿体蛋白积累，导致ROS水平上升[45]。值得注意的是，ROS应激下会影响CDC48A解折叠酶水平来调控植物免疫反应[46]。巧合的是，在水稻中发现敲除OsCdc48也会导致水稻严重的ROS积累，从而使水稻衰老[16]。然而OsCdc48如何在稻瘟病菌入侵过程中发挥作用还未知，在接种稻瘟病菌后，抗病材料中OsCdc48被显著诱导，同时我们发现敲除突变体ko-oscdc48通过上调病程相关基因的表达增强植株对稻瘟病的抗病性。推测稻瘟病菌入侵后会提高OsCdc48的水平，一方面OsCdc48靶向Pik1-H4进而促进其蛋白质降解，另一方面促进稻瘟病菌诱导的ROS的清理。ko-oscdc48中通过靶向Pik1-H4进而促进其蛋白质降解过程被阻断，Pik1-H4持续积累，同时稻瘟病菌诱导的ROS清理也受阻，从而提高水稻对稻瘟病菌的抗性，具体的调控机制还需要进一步的研究证实。
综上所述，本研究进一步证实了OsCdc48与Pik1-H4存在相互作用，OsCdc48的表达受稻瘟病显著诱导，通过上调病程相关基因的表达负调控水稻对稻瘟病的抗性。本研究为进一步深入揭示OsCdc48与NLR蛋白Pik1-H4互作调控稻瘟病抗性的机制及其抗病育种利用奠定了重要基础。
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图 3 稻瘟病菌侵染过程中OsCdc48的表达分析
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，各图中柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。
Figure 3. Analysis of OsCdc48 expression during infection with Magnaporthe oryzae
Data presented in two figures are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns in each figure indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).
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图 4 OsCdc48序列分析
图C中，黑色圆点为OsCdc48；图D中，第1个序列为OsCdc48，第2个序列为AtCdc48。
Figure 4. Sequence analysis of OsCdc48
In figure C, the black dot represents OsCdc48; In figure D, the first sequence represents OsCdc48, the second sequence represents AtCdc48.
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图 6 OsCdc48在水稻各组织中的相对表达量
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。
Figure 6. Relative expression of OsCdc48 in various rice tissues
Data presented in figure are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).
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图 7 ko-oscdc48突变体的靶位点和突变序列
Figure 7. Target sites and mutation sequences of ko-oscdc48 mutant
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图 9 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的表型
Figure 9. Phenotype of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
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图 10 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的病斑长度
图中数据为平均值±标准差，n > 6，**表示突变体与野生型在P < 0.01水平差异显著(t检验)。
Figure 10. Lesion length of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
Data presented in two figures are means ± standard deviations, n > 6, ** indicates significant differences between the mutant and wild type at P < 0.01 level (t test).
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图 11 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL病程相关基因的表达
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，*和***分别表示在P < 0.05和P < 0.001水平差异显著(t检验)。
Figure 11. Expression of disease-related genes in ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
Data presented in three figures are means ± standard deviations of three independent experiments, * and *** indicate significant differences at P < 0.05 and P < 0.001 levels respectively (t test).
表 1 本研究用到的引物
Table 1 Primers used in this study
名称
Name正向序列(5′→3′)
Forward sequence反向序列(5′→3′)
Reverse sequenceOsCdc48-target TAGGTCTCCTTATGGACCCCC GTTTTAGAGCTAGAA CGGGTCTCAATAAAGCAGTATTGCACCAGCCGGGAA OsCdc48-test AGACCTTTTCCTTGTTAGGGG AGCTTTGAGCCCATCCATAAG OsActin TGTATGCCAGTGGTCGTACCA CCAGCAAGGTCGAGACGAA OsCdc48-qPCR GAATGCTCTTGCCAAATACACC TCCTCCGCTTCTCCATCTCG PR10 CGCCGCAAGTCATGTCCTA GCTTCGTCTCCGTCGAGTGT OsPAL1 AGGAGCTCGGCTGCGTATT ATGCCGAGGAACACCTTGTT PR1a GGAAGTACGGCGAGAACATC TGGTCGTACCACTGCTTCTC OsCdc48-AAA2-CLuc agaacacgggggacgagctcATGTCCAAAGGTGTTCTGTT atcgagtacgcggaccggccATCAGGCAGAGGAATGTAGA OsCdc48-AAA1-CLuc agaacacgggggacgagctcCCTCCAAAGGGCATACTGCTT atcgagtacgcggaccggccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA2 taccagattacgctcatatgATGTCCAAAGGTGTTCTGTT gctcgagctcgatggatcccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA1 taccagattacgctcatatgCCTCCAAAGGGCATACTGCTT gctcgagctcgatggatcccTTTAGGCTTGAAGGTAAGCC Pik1 H4-NLuc ggacgagctcggtacccATGGAGGCGGCTGCCATG gtacgagatctggtcgacGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT BD-Pik1 H4 gaggaggacctgcatATGATGGAGGCGGCTGCCATG gcaggtcgacggatccctaGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT 
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