Interaction mechanism between OsCdc48 and Pik1-H4, and its regulation on rice blast disease resistance
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摘要:目的
探究Pik1-H4与细胞周期蛋白OsCdc48的互作机制，明确其在稻瘟病抗性中的作用。
方法首先，分别利用酵母双杂交试验和荧光素酶互补试验验证Pik1-H4与OsCdc48的相互作用；然后，通过RT-qPCR分析OsCdc48在稻瘟病菌侵染后的表达情况及组织表达特异性；其次，分析OsCdc48的序列保守性、蛋白结构域、系统进化关系、蛋白质三维结构预测及其亚细胞定位；最后，利用CRISPR/Cas9创制OsCdc48突变体，并对其进行稻瘟病抗性鉴定和病程相关基因表达分析。
结果证实了Pik1-H4与OsCdc48的互作，且OsCdc48受稻瘟病菌侵染诱导表达。OsCdc48在各组织中均有表达，其编码蛋白定位于细胞核与细胞质。OsCdc48在不同物种中序列保守，与玉米和高粱的亲缘关系最近，预测会形成同源六聚体。OsCdc48功能缺失突变体ko-oscdc48病程相关基因上调表达，对稻瘟病抗性增强。
结论本研究为深入揭示OsCdc48与NLR蛋白Pik1-H4调控稻瘟病抗性的机制及水稻抗病育种提供了理论基础。
Abstract:ObjectiveTo investigate the interaction mechanism between Pik1-H4 and cell division cycle protein OsCdc48, clarify its role in rice blast disease resistance.
MethodFirstly, the interactions between Pik1-H4 and OsCdc48 were verified using yeast two-hybrid and luciferase complementation assays. Then, the expression patterns of OsCdc48 after infection of Magnaporthe oryzae and its tissue-specific expression were analyzed by RT-qPCR. Next, the determination of OsCdc48’s sequence conservation, protein domains, phylogenetic relationships, protein 3D structure prediction and subcellular localization were performed. Finally, OsCdc48 mutant was created using CRISPR/Cas9 technology, the resistance identification of transgenic mutant to rice blast disease and expression analysis of pathogenesis-related genes were also conducted.
ResultThe interactions between Pik1-H4 and OsCdc48 were confirmed, and OsCdc48 was induced by rice blast fungus infection. OsCdc48 was expressed in all tissues and was localized to the nucleus and cytoplasm. The sequence of OsCdc48 was conserved across different species, with the closest phylogenetic relationship to maize and sorghum, and it might form homologous hexamers. The OsCdc48 loss-of-function mutant ko-oscdc48 up-regulated the expression of disease-related genes and enhanced the resistance to rice blast disease.
ConclusionThis study lays a theoretical basis for further elucidating the mechanism of OsCdc48 and NLR protein Pik1-H4 regulating blast disease resistance and rice disease-resistant breeding.
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Keywords:
- Oryza sativa L. /
- Rice blast disease /
- Magnaporthe oryzae /
- Pik1-H4 /
- OsCdc48
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生物多样性是人类赖以生存的物质基础[1]，在自然生态系统中，鸟类处于能量金字塔中上层[2]。作为生物多样性监测的重要指示类群，鸟类的物种组成和群落结构特征是生态系统状态测度的重要指标[3]。对自然保护区野生动物多样性进行调查，是自然保护区发挥生物多样性保护优势的基础。因此，对保护区鸟类资源的调查，对广东省后续有效统筹管理各自然保护区内的生物资源、监测生物多样性和生态环境变化有重要意义。
广东翁源青云山省级自然保护区(以下简称青云山)属南岭东段的延伸部分，为长江水系−珠江水系的分水岭山脉之一[4]。保护区内存有较完整的亚热带常绿阔叶林森林生态系统，群落物种组成丰富，总体更新良好并处于演替初期[5]，保护区独特的地理环境、气候等条件，造就了丰富多样的鸟类资源，具有较高的保护价值和科研价值。目前对保护区的鸟兽调查研究较少，笔者在2016—2017年通过红外相机进行了保护区鸟兽调查[6]，在此基础上，本研究主要通过样线法对青云山的鸟类资源进行实地调查，完善保护区鸟类资源状况数据，并结合访问法和查阅历史资料，系统全面地分析青云山的鸟类多样性。通过本研究，不仅能够进一步了解青云山鸟类与栖息地环境之间的关系，还能为保护区保护鸟类尤其是珍稀濒危鸟类提供数据基础，为进一步保护该地生物多样性和保护区后续有效管理提供科学依据。
1. 研究地与研究方法
1.1 研究地概况
青云山(24°14′22″~24°21′45″N，114°07′50″~114°17′25″E)位于粤北山区翁源县的东南部，是由茶坑尾–雷公礤–青云山–瑶背山–茶坑尾所围合形成的闭合地域，总面积7359.0 hm2，属于中低山地貌，区内地形多为山地和丘陵。青云山保护区地属中亚热带季风气候区，夏季多雨、湿热同期，冬季少雨、干冷同期。年平均光照1 586.2 h，年平均气温20.6 ℃，年总积温7434 ℃，1月平均气温11.3 ℃，7月平均气温28.2 ℃，年平均相对湿度81%，年平均降水量1 693.9 mm，无霜期303 d。青云山处于粤北山区向珠三角平原的过渡区域，也是热带–亚热带过渡区，具备过渡区的敏感性和独特性，物种丰富度较高[5]。青云山共有野生维管植物178科630属1 289种，植被型共7种，即常绿阔叶林、常绿与落叶阔叶混交林、竹林、常绿阔叶灌丛、灌草丛、针阔叶混交林、暖性针叶林及人工栽培植被，地带性植被为常绿阔叶林[4]。
1.2 调查方法
2021年1—12月，采用样线法对青云山鸟类群落进行野外实地调查。共设定11条鸟类调查样线并编号，每条长2~5 km，覆盖保护区内典型区域和各类生境，生境类型根据地形地貌、植被类型和人类干扰状况等差异划分为林区、公路、村庄、水库4类(图1)。调查时间集中在早上和傍晚，调查人员2~3人为一组，同时沿固定样线以1~2 km/h的速度行进，用10×42双筒望远镜观察样线两侧和前方出现的鸟类，同时辅以录音、鸣声辨认、长焦相机摄影取证等方法进行物种鉴别与记录，记录内容包括鸟类的种类、数量、距离(水平、垂直)、性别、行为等。使用GPS卫星定位系统记录样线轨迹，11条样线总调查长度为29.42 km，单侧调查距离为50 m，调查面积为2.94 km2，占保护区总面积的4.00%。
同时，对保护区工作人员、当地居民等进行非诱导式访问，查阅保护区本底资料和科考报告，查找中国知网文献、中国观鸟记录中心记录、《秘境之眼》等网络平台资料，全面收集、梳理保护区鸟类资源信息。鸟类的鉴定主要参照《中国野外鸟类手册》[7]和《中国香港及华南鸟类野外手册》[8]；鸟类分类系统主要参照《中国鸟类观察手册》[9]；鸟类居留型和区系主要参考《中国动物地理》[10]；鸟类食性参考《EltonTraits 1.0: Species-level foraging attributes of the world’s birds and mammals》[11]；鸟类体质量参考《中国鸟类的生活史和生态学特征数据集》[12]。
1.3 数据处理
1.3.1 物种累积曲线
用Excel分别对各样线记录到的鸟类个体数进行统计，将不同鸟类的全部调查数据分样线进行汇总，运用EstimateS处理数据，以计算结果中的抽样次数(本研究中的样线数量)、个体数和物种数3组数据绘制抽样次数及个体数的物种累积曲线的平滑线散点图，根据物种累积曲线的上升趋势判断抽样是否充分[13]。
1.3.2 优势度
以公式(1)计算鸟类优势度：
$$ P_{i}=C_{i}/(C_{1}+C_{2}+C_{3}+\cdots +C_{n})\text{，} $$ (1) 式中，Pi为i物种的个体数占所有物种个体总数的比例，Ci为i物种在某一生境中的总个体数，C1+C2+C3+…+Cn为第1，2，3，…，n种鸟在相同生境个体数的总和。P≥5%为优势种、1%<P<5%为常见种、P≤1%为稀有种[14]。
1.3.3 鸟类群落特征
根据Wilman等[11]发表的EltonTraits 1.0鸟类食性数据，参照Felice等[15]的研究，将鸟类的主要食性划分为以下5个类别：1)食虫鸟类(Invertebrate)：食物组成中昆虫占比大于或等于60%；2)肉食鸟类(VertFishScav)：食物组成中哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类等脊椎动物及其尸体总占比大于或等于60%；3)植食/种食鸟类(PlantSeed)：食物组成中非生殖植物材料和种子占比大于或等于60%；4)食果/食蜜鸟类(FruiNect)：食物组成中果实和花蜜占比大于或等于60%；5)杂食鸟类(Omnivore)：非单一食物组成且各食物类型占比均低于60%。
为便于统计不同生境鸟类生物量情况，将鸟类体质量(m)分为5组：m≤50 g、50 g<m≤200 g、200 g<m≤1 000 g、1 000 g<m≤2 000 g、m> 2 000 g[16]。
生物量(E)计算公式[17]：
$$ E=\displaystyle\sum {m}_{i}{n}_{i}\text{，} $$ (2) 式中，mi为第i种鸟类的平均体质量，g；ni为第i种鸟类的个体数量。
1.3.4 α多样性指数
本研究选取的α多样性指数分别有Gleason指数(dGL)、Shannon-Wienner生物多样性指数(H′)、Margalef物种丰富度指数(M)、Pielou均匀度指数(J′)、Simpson优势度指数(D)[18-19]。
$$ {d}_{\mathrm{G}\mathrm{L}}={S}/\mathrm{ln}A \text{，} $$ (3) $$ {H}'=-\displaystyle\sum \nolimits _{i=1}^{S}{P}_{i}\mathrm{ln}{P}_{i} \text{，} $$ (4) $$ M=\left({{{S}}}-1\right)/\mathrm{ln}N \text{，} $$ (5) $$ {J}'=\dfrac{{H}'}{{H}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}} \text{，} $$ (6) $$ {H}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}={\mathrm{log}}_{2}S \text{，} $$ (7) $$ D=1-\displaystyle\sum \nolimits _{i=1}^{S}{{P}_{i}}^{2} \text{，} $$ (8) 式中，S为鸟类总种数，A为保护区面积，Hmax为最大的物种多样性指数，N为总个体数量。
1.3.5 β多样性指数
用β多样性指数测度鸟类群落在不同生境之间的差异时，选取Sorensen相似性系数(Si)和Morisita-Horn (CMH)相似性系数[16]。
$$ {S}_{i}=\dfrac{2{S}_{\mathrm{A}\mathrm{B}}}{{S}_{\mathrm{A}}+{S}_{\mathrm{B}}} \text{，} $$ (9) $$ {C}_{{\rm{MH}}}=\dfrac{2{N}_{{\rm{A}}}{N}_{{\rm{B}}}\displaystyle\sum \nolimits _{i}{a}_{i}{b}_{i}}{{N}_{{\rm{B}}}^{2}\displaystyle\sum \nolimits _{i}{a}_{i}^{2}+{N}_{{\rm{A}}}^{2}\displaystyle\sum \nolimits _{i}{b}_{i}^{2}} \text{，} $$ (10) 式中，SA和SB为A、B两生境各自的鸟类种数，SAB为A、B两生境共有的鸟类种数，ai和bi为第i个物种在两生境各自的总个体数，NA和NB为两生境各自的物种总个体数。
2. 结果与分析
2.1 物种累积曲线
根据绘制的物种累积曲线(图2)，2个曲线特征均表现为上升舒缓的典型抛物线，没有直线性上升的趋势，表明对青云山鸟类种群的调查接近充分。
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图 2 青云山鸟类群落调查的物种累积曲线Figure 2. Species accumulation curves of bird community survey in Qingyunshan依据EstimateS的计算结果，青云山基于多度的物种估计值(Abundance-base coverage estimator，ACE)为79.78，基于盖度的物种估计值(Incidence-based coverage estimator，ICE)为98.09，即这2种方法对青云山鸟类的物种丰富度估计为80种和98种。从抽样效果来看，实际调查到的物种数目(73种)为估计值的74.49%~91.25%，高于60%，表明抽样接近充分，调查效果较好[20]。
2.2 鸟类群落组成
样线法共记录鸟类11目36科73种，结合查阅资料和访问调查，共统计鸟类17目51科168种(详见中国知网网络首发版附表)，约占韶关市已记录鸟类物种数(322种[21])的52.17%，约占广东省已记录鸟类物种数(555种[22])的30.27%。以雀形目物种最为丰富，占比达58.93%；其次为鹰形目，再其次为鹃形目，其他目的物种相对较少。种类最多的科为鹟科，13种，占总种数的7.74%。保护区单种目有雁形目、䴙䴘目、鲣鸟目、鸻形目、咬鹃目和隼形目共6目，占总目数的35.29%；单种科有20科，占总科数的39.22%。与青云山以往记录比较，此次实地调查新增4种鸟类，即栗苇鳽Ixobrychus cinnamomeus、白腹凤鹛Erpornis zantholeuca、锈脸钩嘴鹛Erythrogenys erythrogenys、白颊噪鹛Pterorhinus sannio。
2.3 鸟类群落特征
168种鸟类中，东洋界鸟种103种(占鸟类物种总种数的61.31%)，广布种40种(占比23.81%)，古北界25种(占比14.88%)。本次调查的鸟类区系组成以东洋界物种占优势，这与其所处的地理位置特征相符。居留型方面，留鸟119种(占鸟类物种总种数的70.83%)，冬候鸟27种(占比16.07%)，夏候鸟16种(占比9.52%)，旅鸟6种(占比3.57%)。生态类型方面，青云山鸟类以林鸟为主，共152种(其中，鸣禽99种，攀禽23种，猛禽19种，陆禽11种)，占物种总种数的90.48%，水鸟16种(涉禽13种，游禽3种)，占比9.52%。
食性方面，食虫鸟类85种(占鸟类物种总种数的50.60%)，杂食鸟类29种(占比17.26%)，食肉鸟类24种(占比14.29%)，植食/种食鸟类19种(占比11.31%)，食果/食蜜鸟类11种(占比6.55%)。
依据实地调查的鸟类数据分析，林区、公路、村庄、水库生境中的鸟类食性组成均以食虫为主。4类生境中，食虫鸟类种类在公路最多，平均数量在村庄最多；杂食鸟类种类在村庄最多，平均数量在林区最多(表1)。
表 1 不同食性的鸟类在不同生境间的物种数及数量1)Table 1. Number of species and individuals of birds with different diet habits in different habitats生境 Habitat 物种数 Species number 样线平均鸟类数量 Average number of birds in the transect I O V P F I O V P F 林区 Forest 20 7 2 0 4 59 38 1 0 4 公路 Highway 25 9 0 3 3 24 19 0 3 5 村庄 Village 18 12 2 5 2 83 23 2 22 4 水库 Reservoir 18 6 1 1 2 66 16 1 1 2 1)I：食虫鸟类，O：杂食鸟类，V：食肉鸟类，P：植食/种食鸟类，F：食果/食蜜鸟类；样线平均鸟类数量=鸟类数量/样线数 1)I: Invertebrate, O: Omnivore, V: VertFishScav, P: PlantSeed, F: FruiNect; Average number of birds in the transect= Individual number/transect number 鸟类体质量方面，m≤50 g的有79种，50 g<m≤200 g的有53种，200 g<m≤1 000 g的有28种，1 000 g<m≤2 000 g的有7种，m>2 000 g的有1种。对不同生境之间鸟类平均生物量进行比较，发现林区生境的生物量最高(12 369 g)，村庄生境的生物量次之(11 246 g)，水库生境的生物量相对较低(7 176 g)，公路生境的生物量最低(6 360 g)。
2.4 优势种
样线调查记录到73种鸟类，优势种为赤红山椒鸟Pericrocotus speciosus、栗背短脚鹎Hemixos castanonotus、淡眉雀鹛Alcippe hueti。林区优势种有赤红山椒鸟、红嘴蓝鹊Urocissa erythrorhyncha、灰树鹊Dendrocitta formosae等5种；公路优势种有红嘴蓝鹊、黄颊山雀Machlolophus spilonotus、小黑领噪鹛Garrulax monileger等6种；村庄优势种有棕背伯劳Lanius schach、淡眉雀鹛、黑领椋鸟Gracupica nigricollis 3种；水库优势种有小䴙䴘Tachybaptus ruficollis、灰喉山椒鸟Pericrocotus solaris、红头长尾山雀Aegithalos concinnus等7种。不同生境的专有种(只在某种生境中出现的鸟类)[16]分别为：村庄16种、公路7种、林区6种、水库3种。
2.5 珍稀保护及特有物种
青云山记录的168种鸟类中，有国家一级重点保护鸟类黄腹角雉Tragopan caboti、黄胸鹀Emberiza aureola 2种，国家二级重点保护鸟类30种；世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录极危(CR)物种1种，易危(VU)3种，近危(NT)1种；中国脊椎动物红色名录濒危(en)物种2种，易危(vu)3种，近危(nt)14种；列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录Ⅰ有1种，附录Ⅱ有22种；广东省重点保护野生动物23种；国家保护的重要生态、科学、社会价值的陆生野生动物即“三有”动物有98种。中国特有种[12]8种，占中国特有鸟类总种数117种的6.84%。
2.6 不同生境鸟类群落α多样性
对比4种生境类型的α多样性指数计算结果(表2)，鸟类Shannon-Wiener多样性指数(H′)最高的生境类型是村庄(3.24)，最低的是林区(2.72)；Marglef丰富度指数(M)最高的生境是公路(7.34)，最低的是水库(5.26)；Pielou均匀度指数(J′)最高的生境是村庄(0.61)，最低的是林区(0.54)；Simpson优势度指数(D)最高的生境为公路和村庄并列(0.94)，最低的是林区(0.90)。
表 2 不同生境鸟类群落α多样性1)Table 2. The α diversity of bird communities in different habitats生境Habitat S N H′ M Hmax J′ D 林区 Forest 33 305 2.72 5.59 5.04 0.54 0.90 公路 Highway 40 203 3.18 7.34 5.32 0.60 0.94 村庄 Village 39 265 3.24 6.81 5.29 0.61 0.94 水库 Reservoir 28 169 2.88 5.26 4.81 0.60 0.93 总和 Total 73 942 3.59 10.51 6.19 0.58 0.95 1)S：物种数，N：个体数，H′：Shannon-Wiener多样性指数，M：Margalef丰富度指数，Hmax：最大多样性指数，J′：Pielou均匀度指数，D：Simpson优势度指数 1)S: Species number; N: Individual number, H′: Shannon-Wiener diversity index, M: Margalef richness index, Hmax:Maximum diversity index, J′: Pielou evenness index, D: Simpson dominance index 2.7 不同生境鸟类群落β多样性
对青云山不同生境类型之间的鸟类群落相似性进行分析(表3)，2种相似性系数越接近1.00，表示生境间鸟类群落的相似性越高[23]。Morisita-Horn相似性系数(CMH)在林区–水库之间最大(0.73)，共有种18种，在村庄–水库之间最小(0.34)，共有种13种；Sorensen相似性系数(Si)在林区−水库之间最大(0.62)，而其余生境两两之间均低于0.60，可视为不相似[24-25]，在林区–村庄之间最小(0.35)，共有种12种。
表 3 不同生境鸟类群落β多样性1)Table 3. The β diversity of bird communities in different habitats生境 Habitat 林区 Forest 公路 Highway 村庄 Village 水库 Reservoir 林区 Forest 0.69 0.39 0.73 公路 Highway 0.55 0.40 0.56 村庄 Village 0.35 0.46 0.34 水库 Reservoir 0.62 0.57 0.39 1)左下方数值为Sorensen相似性系数，右上方数值为Morisita-Horn相似性系数 1)The values in the lower left are the Sorensen similarity coefficients, and the values in the upper right are the Morisita-Horn similarity coefficients 2.8 与其他保护区比较
与广东省其他省级自然保护区比较(表4)，青云山记录鸟类种数较多，且Gleason指数相对较高，林鸟占比高，鸟类资源多样性较高。
表 4 青云山保护区与其他保护区对比Table 4. Comparison between Qingyunshan Reserve and other reserves保护区 Reserve 面积/hm2Area 级别种类 Level type 鸟类种数 Number of bird species Gleason指数(G) Gleason index 调查时间/年 Survey time 目 Order 科 Family 种 Species 林鸟 Forest bird 水鸟 Water bird 林鸟 Forest bird 水鸟 Water bird 总和 Total 青云山省级自然保护区 Qingyunshan Provincial Nature Reserve 7 359.0 17 51 168 152 16 17.07 1.80 18.87 1 白盆珠省级自然保护区[26]Baipenzhu Provincial Nature Reserve 4 163.5 16 45 151 119 32 14.28 3.84 18.12 >1 乳源大峡谷省级自然保护区[27]Grand Canyon Provincial Nature Reserve 4 022.9 15 45 146 136 10 16.39 1.20 17.59 >1 惠东古田省级自然保护区[28]Huidong Gutian Provincial Nature Reserve 2 189.2 13 41 115 97 18 12.61 2.34 14.95 >1 阴那山自然保护区[29]Yinna Mountain Nature Reserve 2 566.0 14 42 175 140 35 17.83 4.46 22.29 1 龙文–黄田省级自然保护区[30]Longwen-Huangtian Provincial Natural Reserve 7 960.5 13 40 150 130 20 14.47 2.23 16.70 1 3. 讨论与结论
3.1 鸟类群落组成与食性
在利用物种累积曲线证明实地调查接近充分的前提下，本研究共统计到17目51科168种鸟类。相比佟富春等[6]通过红外相机监测到的2目3科9种鸟类，本次调查综合性更强，突破了红外相机监测的局限性，调查结果更全面、完整，补充了保护区鸟类资源状况。本次调查的青云山鸟类优势种为赤红山椒鸟、栗背短脚鹎、淡眉雀鹛，数量多、种群分布广且稳定。
食物资源是鸟类群落结构和分布的决定性因素之一[24]，公路处于林地和村庄之间，兼有天然和人造食物资源，因此，昆虫资源多样，食虫鸟类种类最多。村庄的农耕区土壤动物丰富，农作物的茎叶、花果等吸引蜂、蛾蝶类昆虫取食，因此，食虫鸟类平均数量最多。村庄食物资源丰富，能满足大量鸟类的食物需求，特别是帮助鸟类安全度过食物匮乏的冬季，因此，杂食鸟类种类最多[31]。林区内各类小生境异质性较其他3类生境高，为鸟类提供了脊椎动物、昆虫、花蜜、果实、种子等多种多样的食物资源，因此，杂食鸟类平均数量最多。
3.2 保护区不同生境鸟类生物量
不同生境之间鸟类平均生物量从高到低依次为：林区、村庄、水库、公路。食物资源丰富度和植被结构多样性是群落生物量高低的决定因素，鸟类群落的物种数、密度和个体数量、体质量等对生物量都有一定的影响，同时生境资源的丰富度以及鸟类群落对生境的适应性在生物量方面起着关键作用[32]。林区生境以森林生态系统和灌丛生态系统为主，为林鸟提供了丰富的植物性和动物性食物资源，森林植被类型主要为常绿阔叶林和针叶林，垂直结构复杂，层次丰富，隐蔽性良好，人为干扰小，是大多数鸟类的理想栖息地，尤其有利于大型鸟类隐藏、筑巢[33]，如白鹇Lophura nycthemera、灰胸竹鸡Bambusicola thoracicus等鸡形目鸟类，体质量较大，主要生活在远离人类活动区域的林区[34]。村庄生境的鸟类群落多样性指数较高，食物资源丰富，但人类活动频繁，植被类型单一，结构层次较简单，缺乏大型鸟类。水库生境以水体为主，位于林间，常绿阔叶林是此生境的主要植被类型，但由于水电站的工程建设，影响周边植被，不适宜鸟类生活。公路一般在林区之间，两旁以针阔混交林为主，但植被覆盖率较低，汽车鸣笛和灯光会影响鸟类活动，公路周边以生物量较小的雀形目鸟类为主[34]。
3.3 保护区不同生境鸟类群落多样性
鸟类群落多样性与其赖以生存的生境密切相关，生境的植被多样性和空间异质性在鸟类群落多样性形成过程中起着决定性作用[35]。保护区不同生境鸟类群落Shannon-Wiener多样性指数高低排序为村庄>公路>水库>林区，Marglef丰富度指数排序为公路>村庄>林区>水库，Pielou均匀度指数排序为村庄>公路=水库>林区，Simpson优势度指数排序为村庄=公路>水库>林区，综上可知，村庄生境的鸟类群落多样性最高，公路次之，水库较低，而林区最低。保护区内的村庄分布在林区之间，与自然环境接近，鸟类能快速地在村庄和林地之间活动[23]，同时临近公路，即村庄位于不同生境交界处，出现不同生境的种类共生现象，表现出一定程度的边缘效应，导致鸟类在村庄生境的富集度最为显著[36-37]。保护区内森林边缘处的村庄属于混合型栖息地，不同于林内的环境和生物变化特征，村庄鸟类可以同时利用林缘和人类生产活动的产品。同时，村庄生境包括农田和菜地，可提供种子、果蔬、根茎、昆虫等食物，是白鹡鸰Motacilla alba、棕背伯劳、白腰文鸟Lonchura striata等多种鸟类的主要觅食场所。村庄开阔度高，鸟类食物来源丰富，取食较林地容易，人类生活垃圾增加了村庄中伴人生活的鸟类数量，如麻雀Passer montanus等城市依赖型鸟类常被人类抛弃的食物碎屑所吸引[38-39]。林区植被覆盖率高，因为高大的乔木和密集的灌木遮挡，林内光线不足，视野不佳，不利于观察，加之林鸟警惕性高，移动快速，尤其是占比最多的雀形目鸟类，体型较小，且大部分鸟类非繁殖季节较少鸣叫或鸣唱，难以被发现。林区采用样线法调查难度较大，调查结果可能与林区实际的鸟类群落组成及多样性情况存在一定偏差。由于边缘效应、空间异质性、食物资源丰富度及取食难易程度等因素，村庄中鸟类的多样性和密度要高于林地中心。
根据Morisita-Horn(CMH)相似性系数计算结果，林区–水库之间相似度最高，村庄–水库之间相似度最低；根据Sorensen相似性系数(Si)计算结果，林区–水库之间相似度最高，林区–村庄之间相似度最低。水库建在林区内，植被类型、植物景观均与林区相似，推测食物资源的相似性可能是2种相似性系数均在林区–水库生境间最高的主要原因之一。鸟类对栖息繁殖的生境条件具有主动选择性，不同生境的植被覆盖率、植被高度、食源植物种类和丰富度、水源、干扰类型与强度等环境条件，导致不同生境中鸟类群落成分的差异。村庄的主要景观为人工建筑，与农田交错排布，植被主要为农作物，食物来源趋于同质化，鸟类物种组成可变性低，人类在此聚居，人的活动频繁，因此多为伴人鸟种。水库属于人为改造生境，而食物来源较村庄少；林区空间异质性较高，人类活动少，对自然环境的人为干扰低，故水库和林区分别在2种相似性系数上表现为与村庄的鸟类群落组成不相似。
3.4 结论与建议
青云山水热条件良好，植物资源丰富，生境类型多样，为多种鸟类提供了觅食、栖息和繁殖的场所，因而青云山鸟类资源丰富，珍稀濒危鸟类众多。鸟类区系、居留型、生态类型、食性分别以东洋界、留鸟、鸣禽、杂食和食虫鸟类为主；鸟类平均生物量以林区最高；鸟类群落多样性以村庄最高；林区和水库生境的鸟类群落相似度最高。由于青云山为亚热带常绿阔叶林，森林保存较为完整，森林覆盖率较高，垂直分层结构复杂，形成多样的微环境，为鸟类取食和栖息提供了较大的生态位空间，鸟类种数较多。同时，青云山的亚热带常绿阔叶林群落物种组成丰富，群落总体更新良好并处于演替初期[5]，植物优势物种多样，而植物丰富度对鸟类丰富度有正向影响，鸟类物种丰富度随植被结构异质性的增加而增加[40]。因此，与其他保护区相比，青云山鸟类种数和丰富度较高，是生物多样性保护的前沿阵地，值得密切关注。
建议保护区重点关注珍稀濒危鸟类，并进行长期的生物学、生态学监测，在迁徙季节提高鸟类调查的频率以及时长。同时，将红外相机监测与样点、样线调查相结合，逐步建立和完善保护区生物资源数据库，建立生物多样性持续动态监测体系，实现动物资源监测的自动化、常态化。植被影响着鸟类物种丰富度和分布，建议保护区增加原生林分的植被异质性，防止生境特有鸟种的流失[40]。在保护乔木林的同时，增加植被垂直结构的层次和水平结构的延续性，为林下鸟类提供繁殖、摄食和隐蔽条件。建议加强科普宣教，提高周边居民的生态保护意识，严格管控各类工程建设及旅游项目进入保护区，避免人类活动对生态环境的破坏。建议保护区与科研院所合作，关注环境因子、鸟类功能特征、种间作用关系等因素对鸟类分布格局的影响[41]，探索跨区域的多方联动保护协调机制。
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图 3 稻瘟病菌侵染过程中OsCdc48的表达分析
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，各图中柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。
Figure 3. Analysis of OsCdc48 expression during infection with Magnaporthe oryzae
Data presented in two figures are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns in each figure indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).
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图 4 OsCdc48序列分析
图C中，黑色圆点为OsCdc48；图D中，第1个序列为OsCdc48，第2个序列为AtCdc48。
Figure 4. Sequence analysis of OsCdc48
In figure C, the black dot represents OsCdc48; In figure D, the first sequence represents OsCdc48, the second sequence represents AtCdc48.
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图 6 OsCdc48在水稻各组织中的相对表达量
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，柱子上方的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著(单因素方差分析)。
Figure 6. Relative expression of OsCdc48 in various rice tissues
Data presented in figure are means ± standard deviations of three independent experiments, different lowercase letters above the columns indicate significant differences at P < 0.05 (One-way ANOVA).
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图 7 ko-oscdc48突变体的靶位点和突变序列
Figure 7. Target sites and mutation sequences of ko-oscdc48 mutant
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图 9 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的表型
Figure 9. Phenotype of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
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图 10 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL的病斑长度
图中数据为平均值±标准差，n > 6，**表示突变体与野生型在P < 0.01水平差异显著(t检验)。
Figure 10. Lesion length of ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
Data presented in two figures are means ± standard deviations, n > 6, ** indicates significant differences between the mutant and wild type at P < 0.01 level (t test).
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图 11 接种GUY11和GDYJ7后ko-oscdc48与野生型Pik-H4 NIL病程相关基因的表达
图中数据是3次独立试验的平均值±标准差，*和***分别表示在P < 0.05和P < 0.001水平差异显著(t检验)。
Figure 11. Expression of disease-related genes in ko-oscdc48 compared to the wild type Pik-H4 NIL after inoculation with GUY11 and GDYJ7
Data presented in three figures are means ± standard deviations of three independent experiments, * and *** indicate significant differences at P < 0.05 and P < 0.001 levels respectively (t test).
表 1 本研究用到的引物
Table 1 Primers used in this study
名称
Name正向序列(5′→3′)
Forward sequence反向序列(5′→3′)
Reverse sequenceOsCdc48-target TAGGTCTCCTTATGGACCCCC GTTTTAGAGCTAGAA CGGGTCTCAATAAAGCAGTATTGCACCAGCCGGGAA OsCdc48-test AGACCTTTTCCTTGTTAGGGG AGCTTTGAGCCCATCCATAAG OsActin TGTATGCCAGTGGTCGTACCA CCAGCAAGGTCGAGACGAA OsCdc48-qPCR GAATGCTCTTGCCAAATACACC TCCTCCGCTTCTCCATCTCG PR10 CGCCGCAAGTCATGTCCTA GCTTCGTCTCCGTCGAGTGT OsPAL1 AGGAGCTCGGCTGCGTATT ATGCCGAGGAACACCTTGTT PR1a GGAAGTACGGCGAGAACATC TGGTCGTACCACTGCTTCTC OsCdc48-AAA2-CLuc agaacacgggggacgagctcATGTCCAAAGGTGTTCTGTT atcgagtacgcggaccggccATCAGGCAGAGGAATGTAGA OsCdc48-AAA1-CLuc agaacacgggggacgagctcCCTCCAAAGGGCATACTGCTT atcgagtacgcggaccggccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA2 taccagattacgctcatatgATGTCCAAAGGTGTTCTGTT gctcgagctcgatggatcccCATCAGGAACACCAATGTCAA AD-OsCdc48-AAA1 taccagattacgctcatatgCCTCCAAAGGGCATACTGCTT gctcgagctcgatggatcccTTTAGGCTTGAAGGTAAGCC Pik1 H4-NLuc ggacgagctcggtacccATGGAGGCGGCTGCCATG gtacgagatctggtcgacGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT BD-Pik1 H4 gaggaggacctgcatATGATGGAGGCGGCTGCCATG gcaggtcgacggatccctaGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCAAT 
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