地锦Parthenocissus tricuspidata是葡萄科Vitaceae地锦属Parthenocissus的落叶藤本植物，俗称爬山虎，其环境适应力强，耐寒、耐旱和耐瘠薄，因其吸附攀援能力强，常种植于墙面、廊亭和山石等地。地锦能够吸附二氧化硫等有害气体，可以用作工业绿化材料，美化城市的同时还能有效地防暑隔热，是观赏性、装饰性和生态性较强的园林垂直绿化植物^[1]。地锦的果实、根和藤茎具有一定的药用价值，其果实富含花青素、有机酸和糖类等；根和藤茎富含芪类化合物，有活血止血、散淤血、通络解毒等作用^[2]。随着其在园林绿化中的普遍应用和广泛种植，地锦病害的发生日趋严重。目前报道的地锦病害有地锦叶锈病、白腐病和叶斑病等^[3-8]，严重影响了地锦的观赏价值和生态功能。近年来，国内外报道引起地锦叶斑病的病原菌主要有地锦叶点霉Phyllosticta partricusidatae、马卡假尾孢Pseudocercospora macadamiae、暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense、Septoria tormentillae和Diaporthe tulliensis等^[5-8]。为了解决玉龙县地锦叶斑病发生严重的问题，迫切需要一种简单、快速、有效的方法，能够在早期监测到侵染叶片，以便及时控制地锦叶斑病的发生和蔓延。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)能在等温条件下快速、特异、高效扩增DNA序列，无DNA变性阶段^[9]，具有特异性强、灵敏度高、耗时短和操作简单等优点，已成功应用于间座壳属、炭疽菌属、镰刀菌属以及平脐蠕孢属等植物病原真菌的检测^[10-13]。

本研究对云南省玉龙县地锦叶斑病的发生情况和严重程度进行调查，通过形态特征观察、多基因序列联合构建系统发育树确定地锦叶斑病菌的分类地位，科赫氏法则验证菌株对地锦的致病性；并设计特异性LAMP检测引物，建立地锦叶斑病菌的特异性快速检测方法，以期为该病害的正确诊断、早期检测和绿色防治提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料

2022年8月于云南省丽江市玉龙县采集具有典型叶斑病症状的地锦叶片和健康地锦叶片，密封保存带回实验室开展后续试验。

小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora、高粱附球菌Epicoccum sorghinum、暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporium、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、平脐蠕孢Bipolaris sp.、草茎点霉Phoma herbarum、越橘间座壳Diaporthe vaccinii和木贼镰刀菌Fusarium equiseti均由西南林业大学植物病理实验室提供。

1.2   病原菌的分离纯化

在感病的地锦叶片病健交界处切取5 mm×5 mm的组织块，使用75%(φ)乙醇溶液表面消毒30 s，无菌水冲洗1次，再放入0.1%(φ)氯化汞溶液中消毒1 min，后用无菌水连续漂洗3次，灭菌滤纸吸干水分后移接到PDA培养基上，置于26 ℃恒温培养箱培养5~7 d，对长出的菌落进行单孢分离纯化，方法参考文献[14]，纯化菌株接种于PDA斜面培养基后于4 ℃条件下保存。

1.3   病原菌的形态学观察

将分离纯化的病原菌株在PDA培养基上培养1周后观察并记录菌落形态，待菌落产孢后在显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗的形态特征，测量其大小并记录。将滤纸片裁剪为载玻片大小，中心留孔1 cm×2 cm，挑取PDA培养基上的适量菌丝均匀地放在滤纸孔旁，加入适量无菌水保湿，置于26 ℃培养箱中恒温培养6 d后镜检观察分生孢子链的形态。

1.4   病原菌的分子生物学鉴定

挑取纯化培养7 d的病原菌菌丝置于1.5 mL离心管中，采用CTAB法提取病原菌的DNA，分别使用引物ITS(ITS1/ITS4)、甘油醛−3−磷酸脱氢酶基因gpd(gpd1/gpd2)和链格孢属主要过敏源基因Alt a1(Alt-for/Alt-rev)^[15]对病原菌DNA进行PCR扩增。扩增产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序。将获得菌株的ITS (533 bp)、gpd (578 bp)和Alt a1序列(682 bp)在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，使用MEGA 6.0软件，采用最大似然法构建ITS-gpd-Alt a1系统发育树。所使用的引物序列如表1所示。

表  1  本研究PCR采用的引物信息

Table  1.  Primers for PCR used in this study

基因/序列 Gene/Sequence	引物名称 Primer name	引物序列(5′→3′) Primer sequence
ITS	ITS1 ITS4	TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC
gpd	gpd1 gpd2	CAACGGCTTCGGTCGCATTG GCCAAGGAGTTGGTTGTGC
Alt a1	Alt-for Alt-rev	ATGCAGTTCACCACCATCGC ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC

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1.5   致病性测定

采用划伤接种法测定菌株致病性，使用脱脂棉蘸取φ为75%乙醇溶液对健康地锦叶片进行表面消毒，后用灭菌刀片在地锦叶片划十字，将菌饼的菌丝面贴于创伤处，以接种空白PDA的无菌菌饼为对照，使用滤纸和棉花进行保湿，每个处理重复3次，观察并记录发病情况，对病斑进行病原菌的再次分离纯化及鉴定，确定菌株的分类地位。

1.6   地锦叶斑病菌的LAMP快速检测

1.6.1   引物设计及合成

基于“1.4”获得的地锦叶斑病菌Alt a1基因保守区，利用Primer Explore V5在线设计地锦叶斑病菌LAMP引物，包括2条外引物F3(5′-ACCACCGAGGGTGACTAC-3′)和B3(5′-TCGCTGTCGAAAGAGAAGTC-3′)，2条内引物FIP(5′-TGATGTTGAAGCCGAGGCTGTTTTCCGAGTTCTACGGACGC-3′)和BIP(5′-GGCTACCAACGGAGGAACACTCGCCGCAAGAGTACCAAGTG-3′)，1条环引物LB(5′-CTGCTCTCACTCAGCCGACAAG-3′)。

1.6.2   LAMP反应体系的优化

参考朱俊子等^[10]的方法建立地锦叶斑病菌LAMP反应体系(25 μL)：10×IsothermalAmp Buffer 2.5 μL、100 mmol/L MgSO₄ 1.5 μL、10 mmol/L dNTP Mix 3.5 μL、10 μmol/L F3和B3各0.5 μL、10 μmol/L FIP和BIP各4 μL、10 μmol/L LB 2 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、DNA模板1 μL，无菌水4.5 μL。上述反应体系设置2组，一组用于反应温度优化试验，设60、61、62、63、64、65和66 ℃ 7个温度，反应时间为60 min；另一组取前一组最佳反应温度，设20、30、40、50和60 min 5个时间梯度筛选最佳反应时间。2组试验最后均于80 ℃条件下反应10 min。反应结束后加入2 μL 1000× SYBR Green I染料观察产物颜色变化，后经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，通过反应产物颜色变化和电泳梯形条带的明亮程度来确定最适反应温度和反应时间。

1.6.3   LAMP 特异性及灵敏度验证

按照“1.4”中的方法提取常见病原菌小孢拟盘多毛孢、高粱附球菌、暹罗炭疽菌、尖孢镰刀菌、葡萄座腔菌、平脐蠕孢、草茎点霉、越橘间座壳和木贼镰刀菌的DNA，将1 μL DNA模板加入优化过的LAMP体系进行检测，判断LAMP引物的特异性。

对地锦叶斑病菌的DNA进行稀释，调整为1 ng/μL、1~100 pg/μL、1~100 fg/μL、100 ag/μL，将不同质量浓度的DNA作为模板进行LAMP检测，判断LAMP引物的灵敏性。

1.6.4   发病地锦叶片中链格孢的LAMP检测

根据“1.5”中的方法对健康地锦叶片接种链格孢，分别在接种后0、3、6、12、24、48、72和96 h后记录地锦叶片的感病情况并取样，使用CTAB法分别提取接种后发病地锦叶片和健康地锦叶片DNA，将获得的DNA作为模板加入建立的LAMP体系进行检测，同时对提取到的DNA使用Alt al基因进行PCR扩增，验证PCR体系对病斑组织中链格孢的检测效果。

2.   结果与分析

2.1   病害田间症状

云南省丽江市玉龙县地锦叶斑病发生严重，其发病部位多集中于叶缘或叶中央，叶斑初期为褐色圆点，随着叶斑的扩大，叶斑变为中心呈现灰白色、边缘为暗褐色的不规则斑块，病健交界处明显，后期病害为害严重，最终造成叶片枯死(图1)。

图  1  地锦叶斑病的田间症状

Figure  1.  Field symptoms on leaves of Parthenocissu tricuspidata

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2.2   病原菌的分离及形态特征

从采集的病害样品中分离纯化得到12株菌株，其中有9株分离菌株的培养性状和形态特征一致，选择YLDJYB01作为代表菌株进行后续研究。菌株YLDJYB01的形态学特征如图2所示，菌落初期为圆形或椭圆形，菌丝白色绒毛状，后期菌落呈灰白色至灰黑色绒状，菌落背面为中心黑色，边缘白色(图2A)。分生孢子链呈树状分枝(图2B)；分生孢子梗具隔膜(15.76~83.02) µm×(2.90~4.74) µm，单生或丛生，不分支或极少分支，颜色呈淡褐色至褐色，直立或膝状弯曲(图2C)；分生孢子在分生孢子梗的侧端或者顶端以短链方式着生，颜色呈淡褐色至褐色，倒棍棒形或长卵圆形，纵横分隔明显，横隔多为3个，分隔处稍缢缩或不缢缩，孢子大小为(14.60~33.09) µm×(6.61~14.44) µm(图2D)，基部稍钝圆具一短喙，颜色较分生孢子浅。根据病原菌形态特征，将该菌株初步确定为链格孢属Alternaria sp.。

图  2  地锦叶斑病菌的形态学特征

A：菌落正反面；B：分生孢子链；C：分生孢子梗；D：分生孢子。

Figure  2.  Morphological characters of the pathogen causing leaf spot of Parthenocissu tricuspidata

A: Surface of colony; B: Chains of conidia; C: Conidiophore; D: Conidia.

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2.3   病原菌的分子鉴定与系统发育分析

将获得的ITS、gpd和Alt a1 3个基因序列拼接后构建多基因系统发育树(图3)。菌株YLDJYB01与链格孢CBS 107.27、CBS 620.83、QY-2和CBS 121456聚在同一分支，自举值达到99%，结合形态学特征将引起地锦叶斑病的病原菌鉴定为链格孢A. alternata。

图  3  基于ITS、Alt a1和gpd序列构建的地锦叶斑病菌及相关菌株的系统发育树

Figure  3.  Phylogenetic tree based on ITS, Alt a1 and gpd sequences of the pathogen causing leaf spot of Parthenocissu tricuspidata and other related strains

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2.4   致病性测定

用菌株YLDJYB01的带菌菌块进行接种，接种1 d后，创伤部位出现黑色斑块，随着接种时间的延长，黑色斑块逐渐变大，与地锦田间病害发病初期症状一致，对照组未发病(图4)。对上述回接发病植物进行病原菌的再分离，获得的病原菌株与接种菌株一致，符合科赫氏法则，说明链格孢是引起地锦叶斑病的病原菌。

图  4  地锦叶斑病菌致病性验证

A~E：接种12、24、48、72和96 h；F：CK。

Figure  4.  Pathogenicity assay of pathogen causing leaf spot of Parthenocissu tricuspidata

A−E: 12, 24, 48, 72 and 96 h after inoculation; F: CK.

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2.5   地锦叶斑病病原菌LAMP检测方法的建立

2.5.1   LAMP反应体系的优化

LAMP反应管均为绿色(图5A)，说明61~66 ℃均能反应，凝胶电泳结果(图5B)显示，65 ℃时条带最为清晰，因此65 ℃为最佳反应温度(图5B)。在反应20 min时LAMP反应管为橙色，电泳没有出现条带，而30~60 min的LAMP反应管均呈现绿色(图5C)，且电泳结果显示50 min时出现清晰明亮的梯形条带(图5D)，因此50 min为最佳反应时间。

图  5  LAMP反应体系的优化

A、B：LAMP反应温度优化；C、D: LAMP反应时间优化；A、C：以SYBR Green I为显色剂的LAMP反应；B、D: LAMP检测的电泳结果。在图A、B中，M：DL2000 DNA Marker；1~7：分别为60、61、62、63、64、65、66 ℃；8：阴性对照；在图C、D中，M：DL2000 DNA Marker；1~5：分别为20、30、40、50、60 min，6：阴性对照。

Figure  5.  Optimization of LAMP reaction system

A, B: Optimization of LAMP reaction temperature; C, D: Optimization of LAMP reaction time; A, C: LAMP reaction with SYBR Green I as color developer; B,D: Electrophoresis results detected by LAMP. In figure A and B, M: DL2000 DNA Marker; 1−7 represent 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 ℃ respectively; 8: Negative control; In figure C and D, M: DL2000 DNA Marker; 1−5 represent 20, 30, 40, 50, 60 min respectively, 6: Negative control.

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2.5.2   LAMP 特异性检测

按照建立并优化过的LAMP体系，分别以地锦叶斑病菌、小孢拟盘多毛孢、高粱附球菌、暹罗炭疽菌、尖孢镰刀菌、葡萄座腔球菌、平脐蠕孢、草茎点霉、越橘间座壳和木贼镰刀菌的DNA为模板进行LAMP反应扩增。如图6A所示，在供试菌株中，只有地锦叶斑病菌加入SYBR Green I后呈现绿色；其他菌株和阴性对照的LAMP反应管均为橙色。如图6B所示，LAMP产物电泳结果显示，以地锦叶斑病病原菌DNA为模板的LAMP产物能够跑出明亮清晰的梯形条带；以其他真菌为模板的LAMP产物电泳均没有出现条带，阴性对照不显色也无条带。显色情况和电泳结果均表明，本研究建立的LAMP检测方法具有特异性。

图  6  LAMP反应的特异性

M：DL2000 DNA Marker；1：链格孢菌Alternaria alternaria；2：小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora；3：高粱附球菌Epicoccum sorghinum；4：暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense；5：尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum；6：葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea；7：平脐蠕孢Bipolaris sp.；8：草茎点霉Phoma herbarum；9：越橘间座壳Diaporthe vaccinii；10：木贼镰刀菌Fusarium equisetum；11：阴性对照Negative control。

Figure  6.  Specificity of LAMP reaction

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2.5.3   LAMP 灵敏性检测

以不同质量浓度的地锦叶斑病原菌DNA为模板进行LAMP扩增，结果如图7所示，当地锦叶斑病原菌的DNA质量浓度最低为1 pg/μL时，LAMP反应管呈绿色，电泳出现梯形条带。试验结果说明本研究建立的LAMP检测方法对地锦叶斑病原菌DNA的最低检测质量浓度为1 pg/μL，灵敏度高。

图  7  LAMP反应的灵敏性

M：DL2000 DNA Marker；1：1 ng/μL；2~4：分别为100、10和1 pg/μL；5~7：分别为100、10和1 fg/μL；8：100 ag/μL；9：阴性对照。

Figure  7.  Sensitivity of LAMP reaction

M: DL2000 DNA Marker, 1: 1 ng/μL; 2−4 represent 100, 10 and 1 pg/μL respectively; 5−7 represent 100, 10 and 1 fg/μL, respectively; 8: 100 ag/μL; 9: Negative control.

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2.5.4   LAMP反应体系对地锦发病组织的检测

提取人工接种地锦叶斑病病原菌0、3、6、12、24、48、72和96 h后的地锦病斑组织DNA，以其为模板进行LAMP扩增，结果显示，人工接种地锦叶斑病原菌12 h后的地锦叶片中能够检测出链格孢(图8A)，显色反应为绿色，而此时接种叶片还未出现发病症状。电泳检测后结果发现，在12 h时扩增出的梯形条带较浅，随着接种时间的延长梯形条带逐渐清晰明亮(图8B)。

图  8  LAMP反应体系对人工接种链格孢地锦叶片的检测

M：DL2000 DNA Marker；1：阳性对照Positive control；2~9： 0、3、6、12、24、48、72、96 h。

Figure  8.  LAMP detection of Alternaria alternata in artificially inoculated leaves of Parthenocissu tricuspidata

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3.   结论与讨论

本研究经形态观察、致病性测定以及多基因系统发育分析，明确引起云南丽江玉龙县地锦叶斑病的病原菌为链格孢。链格孢寄主范围极其广泛，能侵染多数植物的叶、茎、花和果实等，如桃黑斑病、青脆李果斑病、莴笋叶斑病和樱桃黑斑病等^[16-19]，但鲜见链格孢引起地锦叶斑病的报道。链格孢属的分生孢子形态特征明显易鉴定到属，但部分链格孢种间序列相似性高，仅仅依靠ITS基因序列无法准确区分属内的亲缘种^[20]。一些研究者采用多基因联合构建系统发育树的方式对链格孢小种进行更为准确的鉴定^[18]，本研究基于形态学特征以及结合ITS、gpd和Alt a1多基因联合构建系统发育树，将地锦叶斑病菌鉴定为链格孢A. alternata。

链格孢引起的地锦叶斑病早期症状较轻，肉眼很难判断，而传统的组织分离鉴定方法耗时长、操作复杂，在田间对链格孢引起的病害进行早期鉴定存在困难，因此有部分研究者针对链格孢的基因设计引物建立了LAMP快速检测体系。Liu等^[21]针对引起苹果褐斑病的病原菌Aapg-1基因设计了一对LAMP特异性引物，在反应条件为65 ℃ 60 min时，最低检测灵敏度为1 fg/μL；Moghimi等^[22]研究引起柑橘褐斑病的病菌链格孢，针对ACTTS2基因设计LAMP特异性引物，在反应条件为65 ℃ 60 min时，最低检测灵敏度为2 pg/μL；Zhang等^[23]基于β-tubulin设计链格孢LAMP特异性引物，最低检测灵敏度为3 pg/μL。链格孢过敏源基因Alt a1是链格孢属中控制链格孢霉毒素合成的基因，本研究基于链格孢的Alt a1基因设计了一组可以特异性检测链格孢的LAMP引物，该体系对地锦上已报道过的叶斑病病原菌暹罗炭疽菌没有特异性扩增反应，对小孢拟盘多毛孢、尖孢镰刀菌等常见病原菌也没有特异性扩增反应，该体系在反应条件为65 ℃ 50 min时能检测到的病菌最低DNA质量浓度为1 pg/μL，说明针对同一病原菌但不同的靶基因设计的LAMP引物的灵敏度会存在一定的差异，同时反应时间也对检测灵敏度有一定的影响。LAMP对菌丝DNA具有较高的敏感性，为了得到LAMP体系检测人工接种发病地锦叶片组织中链格孢的最短检出时间，对接种链格孢不同时间的地锦叶片同时进行LAMP和PCR检测，LAMP检测到的接种最短时间为12 h，相较于PCR检测所需时间更短。本研究中，链格孢的最低检测时间与谢学文等^[24]检测人工接种茄匍柄霉以及崔林开等^[13]从人工接种的小麦发病组织中检测出麦根腐平脐蠕孢的时间一致，试验结果表明在症状出现之前，采用LAMP检测方法就能够检测到链格孢，从而可以对链格孢引起的病害进行早期监测，及时预防病害的传播和蔓延。

本研究建立的地锦叶斑病菌的LAMP快速检测技术特异性强、灵敏度高、检测结果可视化，可为地锦上链格孢引发病害的早期预警提供理论依据。