Regulation of pseudorabies virus infectivity by the host factor NPSR
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摘要:目的
伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属甲型疱疹病毒科，是一种嗜神经性病毒，通过接触传播感染造成神经和呼吸系统疾病。猪是PRV的自然宿主，PRV的感染和流行对养猪业造成巨大经济损失。PRV侵染宿主中枢神经系统后，引发神经肽S(Neuropeptide S，NPS)系统表达水平的改变。NPS是一种神经肽物质，作为神经内分泌系统的关键成员在中枢神经系统中广泛分布，与慢性疾病相关联，NPS通过神经肽S受体(Neuropeptide S receptor，NPSR)介导多样化的生理功能，在机体内以NPS/NPSR系统形式共同参与神经内分泌−免疫网络调节。本研究探讨了NPS/NPSR系统在PRV感染宿主细胞中的作用，以期待开发新的抗PRV靶点。
方法通过CRISPR/Cas9构建NPS和NPSR敲除的PK15细胞系，利用qPCR、免疫荧光、Western blot、免疫共沉淀(CO-IP)等方法检测感染PRV病毒后细胞系的抗病毒能力及NPSR与病毒表面糖蛋白的结合能力。
结果NPSR敲除能减弱PRV对PK15细胞的感染能力，而NPS基因敲除增强了PRV对PK15细胞的感染能力。NPSR敲除细胞在PRV吸附过程中能减少病毒的侵入量，因此NPSR是潜在的PRV入侵受体。CO-IP试验证明，NPSR与病毒包膜蛋白gB和gD存在相互作用。
结论NPSR通过与病毒表面糖蛋白结合促进PRV感染，NPSR可能是PRV感染神经系统的受体因子之一。NPSR敲除能显著抑制PRV对PK15细胞的感染。NPSR可为开发PRV防控药物和治疗策略提供新的研究靶点。
Abstract:ObjectivePseudorabies virus (PRV), belonging to the herpesviridae family, is a neurotropic virus that spreads infection and causes neurological and respiratory diseases through contact. Pigs are the natural hosts of PRV, and PRV infections and epidemics cause great economic losses to the pig industry. PRV infection of the host central nervous system triggers changes in the expression level of the neuropeptide S (NPS) system, a neuropeptide substance that is widely distributed in the central nervous system as a key member of the neuroendocrine system, and is associated with chronic diseases. NPS mediates diverse physiological functions through the neuropeptide S receptor (NPSR), which participates in the regulation of the neuroendocrine-immune network in the body as the NPS/NPSR system together. In this study, we investigated the role of the NPS/NPSR system in PRV-infected host cells in anticipation of developing new anti-PRV targets.
MethodNPS and NPSR knock-out PK15 cell lines were constructed by CRISPR/Cas9 method. The antiviral ability of cell lines infected with PRV virus and the binding ability of NPSR to viral surface glycoproteins were detected by qPCR, immunofluorescence, Western blot and co-immunoprecipitation (CO-IP).
ResultNPSR knockout attenuated the infectivity of PRV on PK15 cells, while NPS knockout enhanced the infectivity of PRV on PK15 cells. NPSR knockout cells reduced viral invasion during PRV adsorption, thus NPSR was a potential PRV invasion receptor. The interaction of NPSR with viral envelope proteins gB and gD were demonstrated by CO-IP experiment.
ConclusionNPSR promotes PRV infection by binding to viral surface glycoproteins, and NPSR may be one of the receptor factors for PRV infection of the nervous system. NPSR knockout significantly inhibits the infection of PK15 cells by PRV. NPSR may provide new research targets for the development of drugs and therapeutic strategies for PRV prevention and control.
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伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称I型猪疱疹病毒(Suid herpesvirus I)，属于α−疱疹病毒亚科，是具有包膜的双链DNA病毒，传播范围广泛，能在宿主体内快速复制[1]。PRV能感染多种家畜、家禽和野生动物[2]，感染动物可在发病数天后死亡[3]。猪是PRV的唯一自然宿主，主要病症体现在呼吸及神经性疾病，病毒感染病症伴随着猪的生长及种类有着不同的表现，其中仔猪致病率高，感染后出现高热、腹泻、精神萎靡及神经系统症状，伴有呼吸衰竭，以死亡转归；育肥猪呼吸困难，生长停滞；成年猪感染后主要为呼吸道疾病；种猪表现为不育；妊娠母猪出现生殖系统疾病甚至流产，流产胎儿的肝、脾和肺等存在多种病变[4-6]。PRV具有神经性的传播特征，主要通过鼻腔黏膜等上皮细胞进入机体并通过周围神经逆行到三叉神经感染呼吸道、中枢神经系统，然后在大脑和机体内复制扩散[6-7]，在周围神经系统中建立潜伏感染[8]。目前已有研究报道PRV具有人畜共患的风险。自2011年报道PRV的变异株[8-9]以来，已有多例人感染PRV的病例，研究表明病猪可能是人感染PRV的来源[10-11]。从感染者体内分离的毒株hSD-1/2019由多个PRV变异株重组而来[12]，PRV变异株可引起人的眼内炎和脑炎[3, 13-14]。
PRV入侵细胞需通过包膜糖蛋白与细胞受体间的级联反应介导，主要是由gD、gB、gC、gH和gL几种包膜糖蛋白介导。gB糖蛋白是病毒包膜的重要结构蛋白[15]。病毒侵入细胞时，gB糖蛋白和细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖相互作用，并与gH、gL形成复合物共同调节细胞膜和病毒包膜的融合[16-17]。而gD糖蛋白与细胞表面受体结合，促进PRV囊膜与靶细胞胞质膜的快速融合，加速gB、gH、gL复合物与细胞膜的渗透，将衣壳和病毒DNA运输至细胞内[17-18]。许多研究表明与PRV包膜主要糖蛋白作用的受体蛋白在病毒感染细胞时起重要作用，如宿主细胞受体Nectin-1能与PRV糖蛋白gD结合介导PRV进入的过程[19]，THBS3作为一种PRV辅助受体，通过其N和C末端与PRV gD相互作用促进病毒进入细胞[20]。
PRV感染宿主中枢神经系统后，宿主的神经肽S(Neuropeptide S，NPS)系统发生表达水平的改变，NPS是一个配体/受体相互作用的神经肽系统，与炎症反应相关。另有研究显示NPS可以调节焦虑相关的神经活动[21-23]。 NPS是神经内分泌系统的关键成员，与慢性炎症性疾病相关联，影响哺乳动物、啮齿动物和一些鸟类动物的炎症反应、精神性状、生育性状[24-26]，NPS与其同源受体NPSR(Neuropeptide S receptor)作用发挥生理活性[27]。NPS/NPSR在脑中形成一个神经递质系统，在机体组织和大脑内都广泛表达。作为NPS的受体，NPSR在动物大脑内广泛分布，在皮层、丘脑、下丘脑和杏仁核中表达[23, 28]。研究发现外源性的NPS能促使宿主感染PRV后的病理症状加剧，而干扰NPSR基因的表达后能有效减少PRV的复制，降低病毒感染水平[28-29]，因此可将其作为潜在的PRV的研究靶点。
PRV严重影响生猪养殖业的健康发展，在生产中主要依赖于疫苗接种进行防控，但是由于病毒的变异和毒力加强，造成疫苗保护力不足，PRV目前依然是危害养猪业的主要病原之一。本研究旨在探讨NPS/NPSR系统在PRV感染中的作用，为防控PRV开发新的药物靶点和抗病育种候选位点。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除NPS和NPSR在PK15细胞中的表达后，通过qPCR、IF、Western blot等技术检测NPS和NPSR敲除(Knockout，KO)细胞对PRV的感染能力，并通过CO-IP试验检测与NPSR相互作用的病毒表面蛋白，阐明NPSR在PRV感染中的关键作用。
1. 材料与方法
1.1 材料
PK15细胞、HEK-293T细胞、PRV毒株(Genbank登录号：MT197597)、PX495-neo质粒、PCR标准品质粒pMD-gE、pcDNA3.1质粒保存于华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术中心。采用PCR或RT-PCR扩增NPSR、NPS、PRV-gB、PRV-gD、PRV-gC、PRV-gH、PRV-gL真核表达载体目的基因编码区(CDS)并克隆入pcDNA3.1质粒。PK15细胞、HEK-293T细胞采用完全培养基[DMEM(GBICO)、10%(φ)FBS(viva cell)、1%(φ)Penicillin-Streptomycin Solution(pen strep)(GBICO)]培养，于37 ℃、5%(φ)CO2条件下培养。PRV毒株于−80 ℃保存。本研究使用的抗体包括抗NPSR抗体(Affinity)、抗PRV抗体(abcam)、抗HIS标签抗体(proteintech)、抗Flag标签抗体(TRANSGEN Biotech)、抗Tubulin抗体(PTM BIO)、抗Gapdh抗体(TRANSGEN Biotech)、HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(BBI Life Sciences)、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(BBI Life Sciences)、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(Beyotime)。
1.2 方法
1.2.1 利用CRISPR/Cas9系统构建NPS和NPSR基因敲除的细胞系
本研究构建了NPS和NPSR基因敲除的PK15细胞。利用CRISPR基因敲除原理设计靶向NPS和NPSR基因CDS的sgRNA，sgRNA序列及PCR鉴定引物如表1所示。合成sgRNA序列并连接入CRISPR打靶质粒PX495-neo构建相应的基因打靶载体。进行PK15基因打靶时，转染前在24孔板铺板PK15细胞，细胞汇合度在60%~70%时利用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)转染0.5 μg打靶质粒/孔，在24 h后将细胞梯度稀释，利用600 µg/mL的G418(MACKLIN)筛选15 d形成单细胞克隆，利用克隆环挑取单细胞克隆并扩大培养。对单细胞克隆逐个提取基因组DNA(Omega Bio-Tek)，以引物NPS-F/R和NPSR-F/R(表1)扩增NPS和NSPR打靶位点并测序鉴定基因型的变化。
表 1 引物信息Table 1. Primer information引物
Primer引物序列(5′→3′)
Primer sequenceNPSR-sgRNA GGTCATGTATGGCGTCCAGT NPS-sgRNA GGACAGCTGCCCAACTAGGA NPSR-F CCAAGTATGCTCCCAAAGGA NPSR-R TTGGGCTCAGCACACAGTAG NPS-F GTTTCAGCAAATCCCCCTTT NPS-R TGGTGTCAAACTTCTGCTGC FAM-PRV-gE CAGCGCGAGCCGCCCATCGTCAC PRV gE-F CCCACCGCCACAAAGAACACG PRV gE-R GATGGGCATCGGCGACTACCTG IL6-F AATCCAGACAAAGCCACCAC IL6-R TCCACTCGTTCTGTGACTGC IFNβ-F TGGAGGAAATCATGGAGGAG IFNβ-R ACTGTCCAGGCACAGCTTCT GAPDH-F CCACCCAGAAGACTGTGGAT GAPDH-R AAGCAGGGATGATGTTCTGG 1.2.2 病毒感染
细胞(PK15、NPSR-KO和对照)于37 ℃、5%(φ)CO2培养条件下在24孔板中培养，在100%汇合度时以PBS(GIBCO)清洗细胞3次，加入无血清DMEM(GIBCO)稀释的PRV感染细胞，1 h后弃去病毒液，用PBS清洗细胞3遍，加入无血清的DMEM培养基，培养24 h后收集病毒上清液，利用病毒DNA/RNA总核酸提取试剂盒(MAGEN)提取病毒DNA，通过qPCR分析细胞培养上清液中的病毒含量。同时收集下层细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，反转录后进行qPCR分析细胞内源基因的表达水平。
1.2.3 病毒吸附和内化
(NPSR-KO和对照)于37 ℃、5%(φ)CO2培养条件下在24孔板中培养，在100%汇合度时分别加入MOI=5.0和MOI=0.1的病毒剂量进行感染，将24孔板放入4 ℃冰箱吸附1 h，每15 min进行手动混匀，1 h后弃去病毒液并用PBS清洗细胞3次，并使用0.5 ng/mL蛋白酶K(Thermo Fisher Scientific)和0.5 g/L Trypsin-EDTA (1×)(GIBCO)清洗细胞3次，减少表面多余病毒附着。而后裂解细胞抽提并检测胞内病毒DNA含量，即为吸附的病毒量。检测病毒内化时，4 ℃吸附后将培养板转入37 ℃、5%(φ)CO2条件下继续培养1 h，裂解细胞检测胞内病毒DNA含量，即为内化水平。
1.2.4 免疫共沉淀
293T细胞在37 ℃、5%(φ)CO2条件下培养，转染前1 d消化细胞均匀铺于6孔板中，在汇合度70%时将pcDNA3.1-gB-flag、pcDNA3.1-gD-flag、pcDNA3.1-gC-flag、pcDNA3.1-gH-flag、pcDNA3.1-gL-flag、pcDNA3.1-NPSR-His和pcDNA3.1质粒利用Lipofectamine 3000共转染入细胞内。转染24 h后按1∶100的体积比加入PMSF(Beyotime)及RIPA(Beyotime)裂解液提取细胞蛋白质，加入抗HIS标签抗体在4 ℃条件下进行免疫沉淀，留取部分作为细胞总蛋白分析。12 h后在免疫沉淀样品中加入Pierce蛋白磁珠(Thermo Fisher Scientific)吸附抗体/蛋白复合物，吸附2 h后收集磁珠，并将蛋白变性进行Western blot分析。
1.2.5 PCR和qPCR
试验中细胞基因组DNA采用Tissue DNA Kit试剂盒(Omega Bio-Tek)提取，细胞总RNA采用TRIzol(Thermo Fisher Scientific)法提取。病毒DNA采用病毒DNA/RNA总核酸试剂盒(MAGEN)提取。检测NPS/NPSR基因敲除情况时，采用基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。4 ℃保存。病毒DNA含量采用TaqMan探针法qPCR进行检测，细胞内源基因的mRNA表达水平采用SYBR Green qPCR进行检测。病毒qPCR采用gE标准品进行绝对定量分析。目的基因mRNA表达水平以GAPDH作为内参基因采用ΔΔCt法进行相对定量分析。
1.3 数据统计分析
统计学分析采用SPSS19.0进行单因素方差分析或t检验分析，P < 0.05认为存在显著差异并有统计学意义。图表采用GraphPad Prism 5进行绘制。所有数据以平均值±标准偏差表示。
2. 结果与分析
2.1 利用CRISPR/Cas9进行NPS和NPSR基因敲除PK15细胞的筛选
为验证NPS和NPSR在PRV感染后的表达情况，采用MOI=1.0的PRV对PK15细胞进行感染，在24 h后收取感染细胞，提取总RNA后进行反转录和qPCR检测目的基因mRNA的表达水平。结果显示，在攻毒后，PK15细胞中的NPSR mRNA表达量显著下降(P < 0.001)，而NPS mRNA表达量则显著上升(P < 0.001)(图1)，且利用Western blot检测NPSR在蛋白水平变化趋势(P < 0.05)(图2、3)与NPSR mRNA表达情况一致。表明PRV感染显著影响了NPS和NPSR的表达量。为了进一步研究NPS/NPSR对PRV感染能力的影响，利用PK15细胞进行NPS/NPSR基因敲除单克隆细胞的筛选。选取NPS/NPSRCDS的20个碱基片段构建CRISPR/Cas9打靶质粒载体进行基因敲除；结果如图4所示，NPS基因敲除的单克隆细胞系在目标sgRNA处有1或2 bp纯合碱基片段缺失，NPSR基因敲除的单克隆细胞系在gRNA位点处分别含有+1 bp的纯合插入和(+1/−1)bp的双等位基因变异。进一步利用Western blot检验NPSR敲除细胞在蛋白水平的表达情况，通过选取经过同样筛选过程的野生型细胞(WT)作为对照组，每组进行3次重复，结果(图5)显示，NPSR在KO2细胞系的蛋白表达被完全敲除，而KO3细胞系残留部分NPSR蛋白，但是表达量相比于野生型明显降低。
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图 1 PRV感染后PK15细胞内NPSR和NPS的mRNA表达水平“***”表示在P < 0.001水平差异显著(t检验)Figure 1. mRNA expression levels of NPSR and NPS in PK15 cells after PRV infection“***” indicates significant differences at P < 0.001 (t test)![]()
图 2 PRV感染PK15细胞后NPSR蛋白Western blot检测结果Mr表示相对分子质量，MOCK及感染PRV组每组设置3次重复Figure 2. Western blot result of NPSR protein after PRV infection of PK15 cellsMr indicates relative molecular mass, three replicates are set up for each MOCK and PRV infected group![]()
图 3 PRV感染PK15细胞后NPSR蛋白水平的变化“*”表示在P < 0.05水平差异显著(t检验)Figure 3. Changes in NPSR protein levels after PRV infection of PK15 cells“*” indicates significant difference at P < 0.05 (t test)![]()
图 4 NPS及NPSR阳性克隆细胞的靶点序列测序图谱蓝色记号部分为sgRNA序列，+/−表示增加或缺失相应数量碱基，仅选取部分测序图谱作为展示Figure 4. Target sequencing of NPS and NPSR knockout positive cells coloniesThe blue markers are sgRNA sequences, +/− indicates adding or missing the corresponding number bases, and only some sequencing profiles are selected for demonstration![]()
图 5 Western blot检测NPSR-KO细胞及野生型(WT)细胞中NPSR蛋白质水平Mr表示相对分子质量Figure 5. Western blot detection of NPSR protein levels in NPSR-KO cells and wild-type (WT) cellsMr indicates relative molecular mass2.2 NPS/NPSR基因敲除PK15细胞对PRV感染具有抗性
为了验证NPS/NPSR-KO细胞对PRV感染能力的变化，我们对KO细胞和野生型对照细胞进行PRV感染。以MOI=1.0的PRV感染细胞，24 h后检测细胞上清液中gE拷贝数，作为培养上清液中的病毒载量指标，结果如图6所示。病毒在NPSR-KO细胞内的拷贝数显著降低(P < 0.001)，有明显的抗病毒效果(图6A)；而NPS-KO细胞内的病毒感染量则显著上升(P < 0.01)(图6B)。为了进一步验证NPS/NPSR对PRV感染的影响，我们在细胞中过表达NPS或NPSR质粒。NPS和NPSR过表达质粒(NPS-OE、NPSR-OE)转染细胞24 h后再进行PRV感染(MOI=1.0)，结果如图6C所示，过表达NPSR (NPSR-OE)后病毒表达量上升(P < 0.05)。另外我们分别使用MOI=0.1和MOI=1.0检测细胞在PRV感染下的存活率，MOI=0.1时，36 h时野生型(WT)对照组细胞死亡较多，敲除细胞存活率高且存在显著差异(P < 0.05)；而MOI=1.0时，野生型细胞存活率随时间逐步下降，而NPSR-KO细胞存活率相对较高且存在显著差异(图7)。在显微镜下可以观测到，在PRV感染下，野生型(WT)对照组细胞死亡相比于敲除组(KO)更加严重(图8)。
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图 6 NPS及NPSR基因敲除和过表达后PRV在PK15细胞内的复制水平图A、B中，WT1和WT2为经过与敲除细胞相同的筛选流程而未突变的PK15细胞系；图C中，WT为纯野生型细胞；“*”“**”“***”分别表示在P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001水平差异显著(t检验)Figure 6. PRV replication level in PK15 cells after NPS and NPSR knockout and overexpressionIn figure A and B, WT1 and WT2 are unmutated PK15 cell lines that underwent the same screening process as the knockout cells; In figure C, WT are pure wild-type cells; “*” “**” “***” indicate significant differences at P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001 levels respectively (t test)![]()
图 7 CCK8检测PRV感染后对细胞活力影响“*”和“**”分别表示在P < 0.05、P < 0.01水平差异显著(t检验)Figure 7. CCK8 detection of the effect of PRV infection on cell viability“*” and “**” indicate significant differences at P < 0.05, P < 0.01 levels respectively (t test)![]()
图 8 PRV(MOI=1.0)感染24 h后细胞的病变状态Figure 8. The cytopathic effect status of cells after PRV infection with MOI=1.0 for 24 h2.3 免疫荧光验证PRV对NPSR基因敲除细胞的感染能力
为了进一步验证PRV在野生型(WT)和敲除细胞内的增殖情况，我们采用2种感染复数MOI=1.0 (图9A)和MOI=0.1(图9B)感染PK15细胞后进行免疫荧光(IF)染色。通过选取1个野生型和2个敲除型细胞，每组设置3次重复，在细胞密度达到100%时进行PRV感染，感染24 h后进行PRV抗体IF染色，利用倒置荧光显微镜采集图片。在2种MOI感染的情况下，相比于WT细胞，NPSR-KO细胞的病变程度明显减弱，蚀斑大小和细胞脱落都明显降低，感染传播范围也较小。通过定量荧光细胞数量，NPSR-KO细胞中PRV阳性细胞数相比于WT组显著减少(P < 0.05) (图10)。
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图 9 免疫荧光检测PRV对NPSR敲除细胞的感染能力绿色荧光为PRV多克隆抗体阳性信号，蓝色DAPI染色为细胞核阳性信号，PRV+DAPI为ImageJ软件处理合成Figure 9. Infectivity analysis of NPSR knockout cells with PRV infection by immunofluorescenceGreen fluorescence is the positive signal of PRV polyclonal antibody, blue DAPI staining is the positive signal of cell nucleus, PRV+DAPI is synthesised by ImageJ software processing![]()
图 10 免疫荧光试验中PRV阳性感染细胞相对比例通过ImageJ分析PRV阳性感染细胞比例，“*”表示在P < 0.05水平差异显著(t检验)Figure 10. Relative proportion of PRV-positive infected cells in immunofluorescence experimentsThe proportion of PRV-positive infected cells is analyzed by ImageJ, “*” indicates significant difference at P < 0.05 level (t test)2.4 NPS和NPSR敲除细胞感染PRV后炎症因子的表达量变化
NPS/NPSR介导机体的炎症反应[30-31]，炎症因子可以调节机体免疫反应并对外界病毒的入侵做出调节[32]。为了验证敲除NPS/NPSR后细胞调节病毒感染的机制，我们检测IL-6、IFN-β基因的表达水平，探究NPS/NPSR敲除后免疫应答相关因子的表达量变化。以MOI=0.1的PRV感染细胞24 h后，NPSR-KO细胞中的IFN-β表达水平相较野生型(WT)细胞显著降低(P < 0.001)，WT和NPS-KO细胞的IFN-β表达水平没有显著差异(图11A、11B)。在IL-6的表达上，感染病毒后的NPSR-KO细胞的IL-6表达水平显著下降(P < 0.01)，而NPS-KO细胞的IL-6表达水平显著上升(P < 0.01) (图11C、11D)。这些结果显示NPSR或NPS基因敲除后，免疫相关因子的表达并没有预期的变化(提升IFN-β水平以抑制病毒感染)，因此可能存在其他信号通路调节NPS/NPSR对PRV的感染能力。
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图 11 NPS和NPSR基因敲除细胞感染PRV后炎症因子的mRNA表达量“**”“***”分别表示在P < 0.01、P < 0.001水平差异显著(t检验)Figure 11. mRNA expression of inflammatory factors in NPS and NPSR knockout cells with PRV infection“**” “***” indicate significant differences at P < 0.01, P < 0.001 levels respectively (t test)2.5 NPSR基因敲除影响PRV病毒吸附
PRV通过病毒包膜糖蛋白与细胞受体的相互作用入侵宿主细胞。疱疹病毒的糖蛋白gD、gB与多种宿主表面蛋白在入侵过程中相互作用将病毒输入细胞质[19, 33]。为了解NPSR蛋白是否在病毒吸附及内化过程中起作用，我们选取MOI=5.0的高病毒量和MOI=0.1的低病毒量进行PRV感染，吸附试验中，感染病毒后将细胞放入4 ℃孵育，定时轻摇保证病毒充分吸附，1 h后收取细胞提取胞内病毒DNA进行qPCR分析。与吸附试验采取相同感染复数进行病毒感染，4 ℃吸附1 h后放入37 ℃培养箱继续培养1 h促进病毒内化，之后收集细胞提取胞内病毒DNA进行qPCR分析。结果显示，在低病毒感染复数条件下，NPSR-KO细胞吸附的病毒量显著减少(P < 0.01)，而在内化过程中则没有显著的差异(图12)。细胞在吸附水平的病毒量下降说明NPSR蛋白在病毒入侵过程中起重要作用，NPSR可能与病毒胞膜蛋白相互作用介导PRV感染。
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图 12 NPSR基因敲除影响PRV病毒吸附过程“**”表示在P < 0.01水平差异显著(t检验)Figure 12. NPSR knockout affects PRV virus attachment process“**” indicates significant difference at P < 0.01 level (t test)2.6 NPSR通过与PRV表面糖蛋白相互作用影响病毒感染
在PRV入侵过程中主要糖蛋白gD诱导gH/gL蛋白复合物的相互作用，进而激活融合蛋白gB进行质膜融合[34]，有研究显示gD突变体能显著提高PRV的吸附和内化能力[35]。在病毒入侵过程中多种病毒表面糖蛋白起重要作用，而宿主细胞表面的潜在受体蛋白通过与病毒表面糖蛋白相互作用介导病毒入侵，敲除或敲低受体蛋白能降低病毒对宿主细胞的感染能力。我们采用免疫共沉淀(CO-IP)试验检测NPSR和病毒表面糖蛋白的相互作用。试验选择病毒包膜糖蛋白gB、gD、gH、gL和gC，构建真核表达质粒且携带FLAG标签位点。同时构建NPSR-HIS真核表达质粒，以HIS标签和FLAG标签作为检测方式。利用293T细胞共转染2种质粒，分别设立对照组和试验组进行转染，在36 h后收取样品，一部分用HIS标签抗体进行CO-IP试验，剩余样品用于INPUT对照，抗体孵育完毕后加入磁珠对抗体−抗原结合物进行下拉，收集磁珠进行蛋白变性，将2种不同处理的样品收集后进行Western blot试验。糖蛋白gB、gD和gH能被抗体下拉，因此存在与NPSR蛋白的互作，暗示NPSR可能通过与gB、gD和gH结合介导PRV入侵细胞的过程。其中gB和gD与NSPR作用较强，而gH与NSPR作用较弱(图13A~13C)。gL、gC与NPSR没有互作(图13D、13E)；可能原因是gL与gB形成蛋白复合体发挥作用，单独的gL并不能与受体互作，而gC则是与细胞外基质中的硫酸肝素蛋白聚糖相互作用附着在细胞上。为了进一步验证采用双质粒共转染的CO-IP试验结果，我们检测内源性NSPR和PRV糖蛋白的结合情况，通过分别在PK15细胞转染Flag标记的gB、gD、gH、gL和gC表达质粒，用Flag标签进行CO-IP检测，结果(图14)显示，内源性的NPSR能被gB和gD下拉。由于gH与NPSR相互作用较弱，因此内源性的NPSR可能较难与gH进行CO-IP。这里的结果与双质粒共转染结果一致，证实了gB和gD与NSPR的相互作用。
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图 13 双质粒共转染证实NPSR通过与PRV表面糖蛋白相互作用影响病毒的感染Mr表示相对分子质量，内参采用Tubulin或GAPDH蛋白Figure 13. NPSR affects viral infection by interacting with PRV surface glycoproteins through co-transfection of NPSR- and PRV surface glycoprotein-expressing plasmidsMr indicates relative molecular mass, the internal reference is Tubulin or GAPDH protein![]()
图 14 内源性CO-IP检测证实NPSR与PRV表面糖蛋白的相互作用Mr表示相对分子质量，内参采用Tubulin或GAPDH蛋白Figure 14. Interaction between endogenous NPSR and PRV surface glycoproteins by CO-IP assayMr indicates relative molecular mass, the internal reference is Tubulin or GAPDH protein3. 讨论与结论
3.1 讨论
自发现PRV以来，通过扑杀消毒、疫苗接种等多种方法渐渐杜绝了PRV在家猪中的广泛流行，但随着病毒变异和毒力加强，近年来PRV不时卷土重来，甚至已经蔓延到其他物种[1]。Bartha-K61疫苗株广泛用于预防PRV，而自2011年以来，PRV变异株开始在全国范围内传播，由于传统疫苗的保护力下降使得PRV防控变得困难。由于PRV感染的嗜神经性，因此宿主神经系统的一些蛋白可能在介导PRV感染和传播过程中起关键作用[3,5]。NPS是由20个氨基酸组成的神经肽[23]。NPS通过与其受体NPSR结合介导多样化的生理功能。NPS/NPSR系统在调节中枢和外周神经功能中都起着重要作用[23-24]。研究发现NPS/NPSR mRNA在猪的各组织中也广泛表达，且与人相同，在多种生理功能中发挥重要作用，如NPS可能是有效的神经免疫调节因子，通过NPSR诱导慢性炎症，并通过募集依赖性炎症单核细胞形成一个持续的反馈循环，影响免疫稳态的维持[30]。本研究在体外培养细胞上探讨了NPS/NPSR系统在PRV感染过程中的作用，为PRV防控提供新的研究靶点。
Li等[29]研究表明在干扰NPSR后细胞的抗病毒能力上升，说明基因层面的修饰可以增加宿主对病毒的抗性。我们选择CRISPR/Cas9系统对NPS/NPSR基因在PK15细胞中进行敲除，建立了稳定的NPS/NPSR-KO细胞系，对细胞系进行PRV感染，结果表明在NPSR-KO细胞中PRV的感染能力显著下降，但NPS-KO细胞反而促进病毒的复制，存在与NPSR-KO细胞相反的作用。进一步研究显示，PRV感染后，NPSR-KO细胞内的细胞病变效应明显减少，细胞的存活率也相对较高。PRV抗体的免疫荧光检测也表明NPSR-KO细胞对PRV感染具有抗性。我们探讨的NPSR影响PRV感染的机制与前人研究不同，Li等[29]显示NPSR/NPS系统通过调节宿主的先天免疫系统影响病毒复制，但是我们通过检测相关免疫因子并未发现与预期一致的变化。进一步研究显示，NPSR可以与多种PRV表面糖蛋白相结合，考虑到PRV对神经系统的嗜性，并且其为膜蛋白，我们猜测NPSR是PRV感染神经系统的辅助受体因子。因此NPSR可以为开发PRV及其他疱疹病毒感染的防控药物和治疗策略提供新的靶点。
PRV的感染主要分为4个不同阶段：1)病毒吸附细胞；2)病毒内化进入细胞；3)病毒基因组复制；4)病毒释放。通过不同病毒感染复数检测PRV在NPSR-KO细胞上的吸附和内化能力，可以看到在吸附阶段，较低感染复数情况下，病毒吸附结合能力明显减弱，与WT细胞存在显著差异。这个结果显示PRV可能与较多的细胞表面蛋白结合，因此高滴度感染造成病毒的饱和吸附，掩盖了NPSR缺失造成的少量降低。上述研究表明NPSR可能与PRV包膜糖蛋白存在潜在结合，在病毒入侵阶段起作用。在预计的结合蛋白gD、gB、gC、gH、gL中，通过CO-IP检测到gB和gD与NPSR存在较强的相互作用。NPSR的敲除减少了病毒糖蛋白与靶细胞的识别及入侵能力，从而降低了PRV对宿主细胞的感染。
3.2 结论
本研究结果表明NPSR是PRV感染PK15细胞的宿主因子，NPSR可以与PRV表面糖蛋白gB和gD相结合促进病毒感染。NPSR基因敲除降低PRV对PK15细胞的感染能力，但NPS敲除细胞对PRV感染没有抑制效果。本研究证明了NPSR的表达与PRV感染的相关性，为PRV防控和抗病育种提供有效的研究靶点和候选基因位点。
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图 1 PRV感染后PK15细胞内NPSR和NPS的mRNA表达水平
“***”表示在P < 0.001水平差异显著(t检验)
Figure 1. mRNA expression levels of NPSR and NPS in PK15 cells after PRV infection
“***” indicates significant differences at P < 0.001 (t test)
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图 2 PRV感染PK15细胞后NPSR蛋白Western blot检测结果
Mr表示相对分子质量，MOCK及感染PRV组每组设置3次重复
Figure 2. Western blot result of NPSR protein after PRV infection of PK15 cells
Mr indicates relative molecular mass, three replicates are set up for each MOCK and PRV infected group
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图 3 PRV感染PK15细胞后NPSR蛋白水平的变化
“*”表示在P < 0.05水平差异显著(t检验)
Figure 3. Changes in NPSR protein levels after PRV infection of PK15 cells
“*” indicates significant difference at P < 0.05 (t test)
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图 4 NPS及NPSR阳性克隆细胞的靶点序列测序图谱
蓝色记号部分为sgRNA序列，+/−表示增加或缺失相应数量碱基，仅选取部分测序图谱作为展示
Figure 4. Target sequencing of NPS and NPSR knockout positive cells colonies
The blue markers are sgRNA sequences, +/− indicates adding or missing the corresponding number bases, and only some sequencing profiles are selected for demonstration
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图 5 Western blot检测NPSR-KO细胞及野生型(WT)细胞中NPSR蛋白质水平
Mr表示相对分子质量
Figure 5. Western blot detection of NPSR protein levels in NPSR-KO cells and wild-type (WT) cells
Mr indicates relative molecular mass
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图 6 NPS及NPSR基因敲除和过表达后PRV在PK15细胞内的复制水平
图A、B中，WT1和WT2为经过与敲除细胞相同的筛选流程而未突变的PK15细胞系；图C中，WT为纯野生型细胞；“*”“**”“***”分别表示在P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001水平差异显著(t检验)
Figure 6. PRV replication level in PK15 cells after NPS and NPSR knockout and overexpression
In figure A and B, WT1 and WT2 are unmutated PK15 cell lines that underwent the same screening process as the knockout cells; In figure C, WT are pure wild-type cells; “*” “**” “***” indicate significant differences at P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001 levels respectively (t test)
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图 7 CCK8检测PRV感染后对细胞活力影响
“*”和“**”分别表示在P < 0.05、P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 7. CCK8 detection of the effect of PRV infection on cell viability
“*” and “**” indicate significant differences at P < 0.05, P < 0.01 levels respectively (t test)
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图 8 PRV(MOI=1.0)感染24 h后细胞的病变状态
Figure 8. The cytopathic effect status of cells after PRV infection with MOI=1.0 for 24 h
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图 9 免疫荧光检测PRV对NPSR敲除细胞的感染能力
绿色荧光为PRV多克隆抗体阳性信号，蓝色DAPI染色为细胞核阳性信号，PRV+DAPI为ImageJ软件处理合成
Figure 9. Infectivity analysis of NPSR knockout cells with PRV infection by immunofluorescence
Green fluorescence is the positive signal of PRV polyclonal antibody, blue DAPI staining is the positive signal of cell nucleus, PRV+DAPI is synthesised by ImageJ software processing
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图 10 免疫荧光试验中PRV阳性感染细胞相对比例
通过ImageJ分析PRV阳性感染细胞比例，“*”表示在P < 0.05水平差异显著(t检验)
Figure 10. Relative proportion of PRV-positive infected cells in immunofluorescence experiments
The proportion of PRV-positive infected cells is analyzed by ImageJ, “*” indicates significant difference at P < 0.05 level (t test)
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图 11 NPS和NPSR基因敲除细胞感染PRV后炎症因子的mRNA表达量
“**”“***”分别表示在P < 0.01、P < 0.001水平差异显著(t检验)
Figure 11. mRNA expression of inflammatory factors in NPS and NPSR knockout cells with PRV infection
“**” “***” indicate significant differences at P < 0.01, P < 0.001 levels respectively (t test)
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图 12 NPSR基因敲除影响PRV病毒吸附过程
“**”表示在P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 12. NPSR knockout affects PRV virus attachment process
“**” indicates significant difference at P < 0.01 level (t test)
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图 13 双质粒共转染证实NPSR通过与PRV表面糖蛋白相互作用影响病毒的感染
Mr表示相对分子质量，内参采用Tubulin或GAPDH蛋白
Figure 13. NPSR affects viral infection by interacting with PRV surface glycoproteins through co-transfection of NPSR- and PRV surface glycoprotein-expressing plasmids
Mr indicates relative molecular mass, the internal reference is Tubulin or GAPDH protein
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图 14 内源性CO-IP检测证实NPSR与PRV表面糖蛋白的相互作用
Mr表示相对分子质量，内参采用Tubulin或GAPDH蛋白
Figure 14. Interaction between endogenous NPSR and PRV surface glycoproteins by CO-IP assay
Mr indicates relative molecular mass, the internal reference is Tubulin or GAPDH protein
表 1 引物信息
Table 1 Primer information
引物
Primer引物序列(5′→3′)
Primer sequenceNPSR-sgRNA GGTCATGTATGGCGTCCAGT NPS-sgRNA GGACAGCTGCCCAACTAGGA NPSR-F CCAAGTATGCTCCCAAAGGA NPSR-R TTGGGCTCAGCACACAGTAG NPS-F GTTTCAGCAAATCCCCCTTT NPS-R TGGTGTCAAACTTCTGCTGC FAM-PRV-gE CAGCGCGAGCCGCCCATCGTCAC PRV gE-F CCCACCGCCACAAAGAACACG PRV gE-R GATGGGCATCGGCGACTACCTG IL6-F AATCCAGACAAAGCCACCAC IL6-R TCCACTCGTTCTGTGACTGC IFNβ-F TGGAGGAAATCATGGAGGAG IFNβ-R ACTGTCCAGGCACAGCTTCT GAPDH-F CCACCCAGAAGACTGTGGAT GAPDH-R AAGCAGGGATGATGTTCTGG 
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