Regulation of pseudorabies virus infectivity by the host factor NPSR
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摘要:目的
伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属甲型疱疹病毒科，是一种嗜神经性病毒，通过接触传播感染造成神经和呼吸系统疾病。猪是PRV的自然宿主，PRV的感染和流行对养猪业造成巨大经济损失。PRV侵染宿主中枢神经系统后，引发神经肽S(Neuropeptide S，NPS)系统表达水平的改变。NPS是一种神经肽物质，作为神经内分泌系统的关键成员在中枢神经系统中广泛分布，与慢性疾病相关联，NPS通过神经肽S受体(Neuropeptide S receptor，NPSR)介导多样化的生理功能，在机体内以NPS/NPSR系统形式共同参与神经内分泌−免疫网络调节。本研究探讨了NPS/NPSR系统在PRV感染宿主细胞中的作用，以期待开发新的抗PRV靶点。
方法通过CRISPR/Cas9构建NPS和NPSR敲除的PK15细胞系，利用qPCR、免疫荧光、Western blot、免疫共沉淀(CO-IP)等方法检测感染PRV病毒后细胞系的抗病毒能力及NPSR与病毒表面糖蛋白的结合能力。
结果NPSR敲除能减弱PRV对PK15细胞的感染能力，而NPS基因敲除增强了PRV对PK15细胞的感染能力。NPSR敲除细胞在PRV吸附过程中能减少病毒的侵入量，因此NPSR是潜在的PRV入侵受体。CO-IP试验证明，NPSR与病毒包膜蛋白gB和gD存在相互作用。
结论NPSR通过与病毒表面糖蛋白结合促进PRV感染，NPSR可能是PRV感染神经系统的受体因子之一。NPSR敲除能显著抑制PRV对PK15细胞的感染。NPSR可为开发PRV防控药物和治疗策略提供新的研究靶点。
Abstract:ObjectivePseudorabies virus (PRV), belonging to the herpesviridae family, is a neurotropic virus that spreads infection and causes neurological and respiratory diseases through contact. Pigs are the natural hosts of PRV, and PRV infections and epidemics cause great economic losses to the pig industry. PRV infection of the host central nervous system triggers changes in the expression level of the neuropeptide S (NPS) system, a neuropeptide substance that is widely distributed in the central nervous system as a key member of the neuroendocrine system, and is associated with chronic diseases. NPS mediates diverse physiological functions through the neuropeptide S receptor (NPSR), which participates in the regulation of the neuroendocrine-immune network in the body as the NPS/NPSR system together. In this study, we investigated the role of the NPS/NPSR system in PRV-infected host cells in anticipation of developing new anti-PRV targets.
MethodNPS and NPSR knock-out PK15 cell lines were constructed by CRISPR/Cas9 method. The antiviral ability of cell lines infected with PRV virus and the binding ability of NPSR to viral surface glycoproteins were detected by qPCR, immunofluorescence, Western blot and co-immunoprecipitation (CO-IP).
ResultNPSR knockout attenuated the infectivity of PRV on PK15 cells, while NPS knockout enhanced the infectivity of PRV on PK15 cells. NPSR knockout cells reduced viral invasion during PRV adsorption, thus NPSR was a potential PRV invasion receptor. The interaction of NPSR with viral envelope proteins gB and gD were demonstrated by CO-IP experiment.
ConclusionNPSR promotes PRV infection by binding to viral surface glycoproteins, and NPSR may be one of the receptor factors for PRV infection of the nervous system. NPSR knockout significantly inhibits the infection of PK15 cells by PRV. NPSR may provide new research targets for the development of drugs and therapeutic strategies for PRV prevention and control.
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非洲猪瘟(African swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的急性、烈性、高度接触性的传染病。该病毒是一种有囊膜的双链DNA病毒，ASFV基因组大小约为170~190 kb，编码151~167个基因[1]。ASFV中，B646L基因编码的P72蛋白是ASFV的主要衣壳结构蛋白，也是ASFV检测中最常用的靶基因[2]；EP402R基因编码的CD2v蛋白和多基因家族成员MGF360/505基因均能够影响宿主的干扰素产生，且2个基因的缺失是研制非洲猪瘟疫苗的主要方向之一[3-4]。
目前尚无有效的疫苗和药物用于控制非洲猪瘟，只能通过早期检测淘汰来控制疫情的发展。已经建立的检测方法主要包括红细胞吸附试验、PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)及酶促重组酶扩增(Enzymatic recombinase amplification，ERA)等[5]。ERA是一种检测核酸的新技术，通过在模板内添加3种蛋白(DNA重组酶、单链结合蛋白和具有聚合链置换功能的DNA聚合酶)，并加入特异性引物和探针，在一定时间内(15~20 min)完成等温扩增[6]。本研究采用ASFV编码P72蛋白的B646L、编码CD2v蛋白的EP402R和MGF360/505基因作为目的基因模板，通过条件优化，建立用于快速检测ASFV的ERA等温扩增方法。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂
基础型核酸扩增试剂盒(ERA法)购自苏州先达基因科技有限公司；Phanta Max Super- Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司；GenStar 2×Taq PCR StarMix和Loading Dye购自广州康润生物公司；pMD18-T Vector Cloning试剂盒购自Takara公司；RaPure Viral RNA/DNA试剂盒购自广州美基生物科技有限公司。
1.2 病毒株与临床样品
猪繁殖和呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)的阳性DNA或cDNA样品均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。15 份ASFV阳性核酸样品由华南农业大学国家非洲猪瘟区域实验室(广州)提供。
1.3 引物和探针设计
根据GenBank公布的ASFV GZ201801(GenBank：MT496893.1)病毒基因序列，选取B646L基因(编码p72蛋白)序列、EP402R基因(编码CD2v蛋白)序列和多基因家族成员MGF360/505基因序列的相关片段。根据TwistDX公司给出的指导建议( https://www.twistdx.co.uk/en/support/rpa-assay-design-2)设计ERA引物和探针(表1)，通过BLAST比对确定引物和探针的特异性，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成标记。
表 1 ERA探针序列与构建目的片段的引物序列Table 1. ERA probe sequence and primer sequence for constructing target fragment引物/探针
Primer/probe序列(5′→3′)
Sequence产物长度/bp
Product sizeB646L-ERA-probe CTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCT(FAM-dT)(THF)
(BHQ1-dT)CTCTGCGTGGTGAGTGG-C3-spacerB646L-ERA-F1 CGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGG 173 B646L-ERA-R1 GATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAAC B646L-ERA-F2 ACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTA 135 B646L-ERA-R2 CGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGG B646L-ERA-F3 CGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGG 137 B646L-ERA-R3 GAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTA EP402R ERA-probe CATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAG(FAM-dT)(THF)
(BHQ1-dT)AATACACCTATTTAC-C3-spacerEP402R-ERA-F1 CCTGAATCTAATGAAGAAGAACAATGTCAGCATG 188 EP402R-ERA-R1 CACGGTTTAGGTAAGGGAAATGGGTTGAGT EP402R-ERA-F2 CGGTTTAGGTAAGGGAAATGGGTTGAGTGG 195 EP402R-ERA-R2 CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAG EP402R-ERA-F3 CCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAG 197 EP402R-ERA-R3 CACGGTTTAGGTAAGGGAAATGGGTTGAGT MGF-ERA-probe CAGCGCGTAACAGTAATATATTGTTAATGGAT(FAM-dT)(THF)
(BHQ1-dT)TATCCTTGGTAGAAGC-C3-spacerMGF-ERA-F1 TTGTACTGAAGTAAGCATAGCTTGGTTGAT 194 MGF-ERA-R1 GAATGGCGATTAAAATGTCTCCTGTATTAT MGF-ERA-F2 GAATGGCGATTAAAATGTCTCCTGTATTAT 192 MGF-ERA-R2 TATTGTACTGAAGTAAGCATAGCTTGGTTG MGF-ERA-F3 GTACTGAAGTAAGCATAGCTTGGTTGATGT 196 MGF-ERA-R3 GAATGGCGATTAAAATGTCTCCTGTATTAT B646L-18t-F TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCTGAAC 1 941 B646L-18t-R ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTAT EP402R-18t-F TAAAATGATAATACTTATTTTTTTAAT 1 087 EP402R-18t-R TTAAATAATTCTATCTACGTGAATA MGF-18t-F GTGTTGACAGATACCAGCCCGTAG 2 559 MGF-18t-R GTAAAGGCCGTGAAGAGCGATAA 1.4 DNA标准模板的制备
以ASFV(GZ201801株)细胞培养悬液为样本，按照RaPure Viral RNA/DNA提取试剂盒说明书，对病毒悬液进行DNA提取。利用构建目的片段的引物(B646L-18t-F/R、EP402R-18t-F/R和MGF-18t-F/R)，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒，经过PCR后，获得B646L、EP402R和MGF360/505目的基因片段(表1)。PCR反应体系：2× Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(10 mmol·L−1) 2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L−1)各2 μL，DNA样本2 μL，ddH2O补足50 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、61 ℃(B646L)/43 ℃(EP402R)/57 ℃(MGF360/505) 15 s、72 ℃ 1 min(B646L)/1 min(EP402R)/1.5 min(MGF360/505)，35个循环；72 ℃延伸5 min。上述病毒核酸提取及扩增反应体系配置操作均在国家非洲猪瘟区域实验室(广州)所在的华南农业大学生物安全三级实验室完成。将纯化后的目的片段连接至pMD18-T载体后，送至广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。测序正确后，换算为拷贝数。
1.5 ERA方法的引物筛选
以构建的DNA标准质粒为模板，通过PCR获得ERA引物的产物(B646L-ERA-F1/R1、B646L-ERA-F2/R2和B646L-ERA-F3/R3，EP402R-ERA-F1/R1、EP402R-ERA-F2/R2和EP402R-ERA-F3/R3，MGF-ERA-F1/R1、MGF-ERA-F2/R2和MGF-ERA-F3/R3)，筛选出试验效果较优引物对。PCR反应体系：2 × Taq PCR StarMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L−1)各0.40 μL，模板2 μL，ddH2O补足20 μL。反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、59 ℃(B646L)/62 ℃(EP402R)/56 ℃(MGF360/505) 30 s、72 ℃ 45 s，5个循环；72 ℃延伸5 min。使用常规ERA方法，进行第2次引物筛选，筛选出试验效果较优引物对。ERA反应体系：溶解剂20 μL，上、下游引物(10 μmol·L−1)各2.10 μL，模板2 μL，激活剂2 μL，ddH2O补足50 μL。反应程序：37 ℃ 30 min，每15 s收集FAM荧光信号。
1.6 ERA方法反应体系因素水平设计与优化
参考ERA方法的使用说明[7]，采用L9(33)的正交方法设计方案(表2)。优化ERA体系中的温度、探针浓度、引物浓度、激活剂浓度。经试验得出结果，使用Minitab软件分析得出各因素的最优水平。
1.7 ERA方法的特异性试验
以PRRSV、CSFV和PRV的DNA或cDNA作为对照，ddH2O为空白对照，使用优化后的ERA方法进行荧光检测，通过观察有无扩增曲线，检测方法的特异性。
表 2 L9(33)试验方案Table 2. L9(33) experimental program序号
Order numberθ/℃ 探针体积/μL
Probe volume引物体积/μL
Primer volume激活剂体积/μL
Activator volume1 37 0.24 0.84 1 2 37 0.48 2.10 2 3 37 0.72 3.15 3 4 39 0.24 2.10 3 5 39 0.48 3.15 1 6 39 0.72 0.84 2 7 42 0.24 3.15 2 8 42 0.48 0.84 3 9 42 0.72 2.10 1 1.8 ERA方法的灵敏性试验
将pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFV-MGF按10倍梯度各稀释至拷贝数为106、105、104、103、102、101和100 μL−1。以各浓度梯度的pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFV-MGF为模板，同时加入ddH2O作为空白对照。使用优化后的ERA方法进行荧光检测，重复3次，检测方法的灵敏性。
1.9 ERA方法的重复性试验
以拷贝数为105、104和103 μL−1的pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFV-MGF为模板，ddH2O作为空白对照。使用优化后的ERA方法进行荧光检测，重复3次，检测方法的重复性。
1.10 ERA方法的临床样本验证检测
以15份ASFV DNA阳性样品和50份DNA阴性样品为模板，使用优化后的ERA方法进行荧光检测，并参照GB/T 18648—2020非洲猪瘟诊断技术标准[8]提供的B646L基因的扩增引物和探针检测样品，将2种方法的结果进行对比分析。
2. 结果与分析
2.1 DNA模板的制备
以ASFV GZ201801病毒基因组为模板，B646L-18t-F/R、EP402R-18t-F/R和MGF-18t-F/R为引物，分别扩增获得1 941、1 087和2 559 bp的特异性片段(图1A~1C)。将扩增片段纯化后，克隆到pMD18-T载体上，进行体外扩增检测得出结果(图1D~1F)并测序正确后，命名为pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFV-MGF。测得pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFV-MGF的DNA拷贝数分别为4.15×1010、4.67×1010和4.13×1010 μL−1。
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图 1 PCR扩增产物结果(A~C)以及质粒鉴定结果(D~F)M：DS2000 marker；M1：DS10000 marker；1：B646L；2：EP402R；3：MGF360/505Figure 1. PCR amplification product results (A−C) and plasmid identification results (D−F)2.2 ERA方法的引物筛选
将每对ERA引物，分别进行普通PCR，发现每对引物的特异性都很好(图2)。再使用ERA体系，对每对ERA引物进行荧光检测，挑选出最优的1对引物。以反应管内的荧光信号到达设定的阈值(△Rn=5000)时所经历的循环数(Cycle number)最低为原则，且荧光值最大为选择标准。分析后，B646L-ERA-F1/R1、EP402R-ERA-F2/R2、MGF-ERA-F1/R1分别为常规ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R、ERA-ASFV-MGF方法的最优引物对(图3)。
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图 2 普通PCR对不同引物的检测结果M：DS2000 marker；1：B646L-ERA-F1/R1；2：B646L-ERA-F2/R2；3：B646L-ERA-F3/R3；4：EP402R-ERA-F1/R1；5：EP402R-ERA-F2/R2；6：EP402R-ERA-F3/R3；7：MGF-ERA-F1/R1；8：MGF-ERA-F2/R2；9：MGF-ERA-F3/R3Figure 2. Normal PCR detection results of different primers![]()
图 3 常规ERA对不同引物的检测结果Figure 3. Routine ERA detection results of different primer pairsB1: B646L-ERA-F1/R1; B2: B646L-ERA-F2/R2; B3: B646L-ERA-F3/R3; E1: EP402R-ERA-F1/R1; E2: EP402R-ERA-F2/R2; E3: EP402R-ERA-F3/R3; M1: MGF-ERA-F1/R1; M2: MGF-ERA-F2/R2; M3: MGF-ERA-F3/R32.3 ERA方法条件优化
用最优的1对引物按表2试验方案进行ERA反应，每个组合重复4次，以设定的阈值所经历的循环数最低为原则，记录结果。9组试验结果经过极差分析，得出每个因素的最佳水平，最终列出最佳反应体系。50 μL反应体系中，ERA-ASFV-B646L：42 ℃，探针0.48 µL，上、下游引物各3.15 µL，激活剂2 µL，溶解剂20 µL，ddH2O 21.22 µL；ERA-ASFV-EP402R：42 ℃，探针0.24 µL，上、下游引物各2.10 µL，激活剂2 µL，溶解剂20 µL，ddH2O 23.56 µL；ERA-ASFV-MGF：42 ℃，探针0.48 µL，上、下游引物各3.15 µL，激活剂2 µL，溶解剂20 µL，ddH2O 21.22 µL。
2.4 ERA方法的特异性试验
对PRRSV、CSFV、PRV的DNA或cDNA进行ERA检测，ddH2O为空白对照。结果(图4)显示，该方法对其他3种病毒的DNA或cDNA无特异性扩增，表明该方法具有较强的特异性。
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图 4 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的特异性检测PRRSV：猪繁殖和呼吸综合征病毒，PRV：伪狂犬病毒，CSFV：猪瘟病毒Figure 4. The specificity detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methodsPRRSV: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRV: Pseudorabies virus, CSFV: Classical swine fever virus2.5 ERA方法的灵敏性试验
以拷贝数为100~106 μL−1梯度的pMD18T-ASFV-B646L、pMD18T-ASFV-EP402R和pMD18T-ASFV-MGF质粒为模板，使用优化过的ERA方法进行检测。结果显示，ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法检测所用时间分别为16、7和13 min，且对质粒拷贝数的检测限均为102 μL−1(图5)。
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图 5 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的灵敏性检测Figure 5. The sensitivity detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods2.6 ERA方法的重复性试验
以拷贝数为105、104和103 μL−1的标准质粒分别作为模板，进行3次ERA扩增反应。结果(表3)显示，标准质粒浓度越高，重复性越好，但所构建的方法不适合非洲猪瘟的定量试验。
2.7 ERA方法的临床样本验证
采用ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法同时检测ASFV 15份阳性核酸样品和50份阴性核酸样品，使用GB/T 18648—2020非洲猪瘟诊断技术标准[8]提供的检测方法与之进行比较。结果显示，本试验建立的3种检测方法的检测结果与推荐方法检测结果的符合率为100%。所构建的方法适合非洲猪瘟的定性试验。
表 3 ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法的重复性检测Table 3. The repeatability detection of ERA-ASFV-B646L, ERA-ASFV-EP402R and ERA-ASFV-MGF methods方法
Method标准质粒拷贝数/μL−1
Standard plasmid copy number循环数
Cycle number变异系数/%
Coefficient of variationERA-ASFV-B646L 105 6.71 5.54 104 8.79 6.15 103 13.86 10.57 ERA-ASFV-EP402R 105 6.64 1.20 104 8.30 9.15 103 8.64 10.45 ERA-ASFV-MGF 105 6.92 5.95 104 9.64 1.72 103 11.73 5.61 3. 讨论与结论
目前，我国非洲猪瘟疫情总体可控，大部分猪场正在通过改变传统养殖结构限制非洲猪瘟疫情对养猪行业的影响。在尚无有效的治疗药物和商品化疫苗的情况下，只能通过生物安全配合实验室检测来防控疫情[9-10]。实验室检测方法种类很多，但各有优缺点[11]，ELISA有着操作简单、重复性好等特点，但不适用于ASFV感染的暴发期，且存在假阳性的诊断[12]；LAMP方法具有高特异性、高灵敏性的特点，但获得检测结果至少需要40 min，也易产生假阳性结果[13]。ERA检测方法作为新型分子病原学诊断方法，在37~42 ℃的条件下即可实现核酸扩增，仅需要20 min左右的检测周期，在适合条件下改变试验条件，依然可以保持较高的灵敏度和较强的特异性[14-15]；例如Xia等[16]使用逆转录–酶促重组等温扩增技术(Reverse transcription-enzymatic recombinase amplification，RT-ERA)对新冠病毒(COVID-19)RNA的双基因同时检测，25 min内得出结果，无需特殊设备就可进行简便的居家检测。
目前构建的ERA-ASFV核酸检测方法需要注意以下问题。首先，普通移液枪无法吸取精确体积的黏性溶解剂，导致结果的重复性不是很好；在添加含有溶解剂溶液的过程中，需要使用为吸取黏性液体而设计的移液器。其次，ERA方法反应非常迅速，扩增曲线会在短时间内迅速上升并进入平台期；所以，当加入所有试剂成分后，需要立即检测荧光。另外，目前建立的ERA-ASFV方法只能在病毒检测中作为定性的方法；检测结束后，反应不会自行终止，需要高温灭活试管中的蛋白。
综上所述，本试验建立的ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF方法特异性强，对应的最低拷贝数检测限均为102 μL−1，分别在16、7和13 min内即可完成反应。参照GB/T 18648—2020非洲猪瘟诊断技术标准[8]推荐方法，经过对比，与推荐检测方法结果一致。本研究结果可为ASFV检测提供一种新方法，并为今后ASFV的ERA多基因检测打下良好技术基础。
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图 1 PRV感染后PK15细胞内NPSR和NPS的mRNA表达水平
“***”表示在P < 0.001水平差异显著(t检验)
Figure 1. mRNA expression levels of NPSR and NPS in PK15 cells after PRV infection
“***” indicates significant differences at P < 0.001 (t test)
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图 2 PRV感染PK15细胞后NPSR蛋白Western blot检测结果
Mr表示相对分子质量，MOCK及感染PRV组每组设置3次重复
Figure 2. Western blot result of NPSR protein after PRV infection of PK15 cells
Mr indicates relative molecular mass, three replicates are set up for each MOCK and PRV infected group
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图 3 PRV感染PK15细胞后NPSR蛋白水平的变化
“*”表示在P < 0.05水平差异显著(t检验)
Figure 3. Changes in NPSR protein levels after PRV infection of PK15 cells
“*” indicates significant difference at P < 0.05 (t test)
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图 4 NPS及NPSR阳性克隆细胞的靶点序列测序图谱
蓝色记号部分为sgRNA序列，+/−表示增加或缺失相应数量碱基，仅选取部分测序图谱作为展示
Figure 4. Target sequencing of NPS and NPSR knockout positive cells colonies
The blue markers are sgRNA sequences, +/− indicates adding or missing the corresponding number bases, and only some sequencing profiles are selected for demonstration
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图 5 Western blot检测NPSR-KO细胞及野生型(WT)细胞中NPSR蛋白质水平
Mr表示相对分子质量
Figure 5. Western blot detection of NPSR protein levels in NPSR-KO cells and wild-type (WT) cells
Mr indicates relative molecular mass
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图 6 NPS及NPSR基因敲除和过表达后PRV在PK15细胞内的复制水平
图A、B中，WT1和WT2为经过与敲除细胞相同的筛选流程而未突变的PK15细胞系；图C中，WT为纯野生型细胞；“*”“**”“***”分别表示在P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001水平差异显著(t检验)
Figure 6. PRV replication level in PK15 cells after NPS and NPSR knockout and overexpression
In figure A and B, WT1 and WT2 are unmutated PK15 cell lines that underwent the same screening process as the knockout cells; In figure C, WT are pure wild-type cells; “*” “**” “***” indicate significant differences at P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001 levels respectively (t test)
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图 7 CCK8检测PRV感染后对细胞活力影响
“*”和“**”分别表示在P < 0.05、P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 7. CCK8 detection of the effect of PRV infection on cell viability
“*” and “**” indicate significant differences at P < 0.05, P < 0.01 levels respectively (t test)
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图 8 PRV(MOI=1.0)感染24 h后细胞的病变状态
Figure 8. The cytopathic effect status of cells after PRV infection with MOI=1.0 for 24 h
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图 9 免疫荧光检测PRV对NPSR敲除细胞的感染能力
绿色荧光为PRV多克隆抗体阳性信号，蓝色DAPI染色为细胞核阳性信号，PRV+DAPI为ImageJ软件处理合成
Figure 9. Infectivity analysis of NPSR knockout cells with PRV infection by immunofluorescence
Green fluorescence is the positive signal of PRV polyclonal antibody, blue DAPI staining is the positive signal of cell nucleus, PRV+DAPI is synthesised by ImageJ software processing
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图 10 免疫荧光试验中PRV阳性感染细胞相对比例
通过ImageJ分析PRV阳性感染细胞比例，“*”表示在P < 0.05水平差异显著(t检验)
Figure 10. Relative proportion of PRV-positive infected cells in immunofluorescence experiments
The proportion of PRV-positive infected cells is analyzed by ImageJ, “*” indicates significant difference at P < 0.05 level (t test)
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图 11 NPS和NPSR基因敲除细胞感染PRV后炎症因子的mRNA表达量
“**”“***”分别表示在P < 0.01、P < 0.001水平差异显著(t检验)
Figure 11. mRNA expression of inflammatory factors in NPS and NPSR knockout cells with PRV infection
“**” “***” indicate significant differences at P < 0.01, P < 0.001 levels respectively (t test)
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图 12 NPSR基因敲除影响PRV病毒吸附过程
“**”表示在P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 12. NPSR knockout affects PRV virus attachment process
“**” indicates significant difference at P < 0.01 level (t test)
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图 13 双质粒共转染证实NPSR通过与PRV表面糖蛋白相互作用影响病毒的感染
Mr表示相对分子质量，内参采用Tubulin或GAPDH蛋白
Figure 13. NPSR affects viral infection by interacting with PRV surface glycoproteins through co-transfection of NPSR- and PRV surface glycoprotein-expressing plasmids
Mr indicates relative molecular mass, the internal reference is Tubulin or GAPDH protein
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图 14 内源性CO-IP检测证实NPSR与PRV表面糖蛋白的相互作用
Mr表示相对分子质量，内参采用Tubulin或GAPDH蛋白
Figure 14. Interaction between endogenous NPSR and PRV surface glycoproteins by CO-IP assay
Mr indicates relative molecular mass, the internal reference is Tubulin or GAPDH protein
表 1 引物信息
Table 1 Primer information
引物
Primer引物序列(5′→3′)
Primer sequenceNPSR-sgRNA GGTCATGTATGGCGTCCAGT NPS-sgRNA GGACAGCTGCCCAACTAGGA NPSR-F CCAAGTATGCTCCCAAAGGA NPSR-R TTGGGCTCAGCACACAGTAG NPS-F GTTTCAGCAAATCCCCCTTT NPS-R TGGTGTCAAACTTCTGCTGC FAM-PRV-gE CAGCGCGAGCCGCCCATCGTCAC PRV gE-F CCCACCGCCACAAAGAACACG PRV gE-R GATGGGCATCGGCGACTACCTG IL6-F AATCCAGACAAAGCCACCAC IL6-R TCCACTCGTTCTGTGACTGC IFNβ-F TGGAGGAAATCATGGAGGAG IFNβ-R ACTGTCCAGGCACAGCTTCT GAPDH-F CCACCCAGAAGACTGTGGAT GAPDH-R AAGCAGGGATGATGTTCTGG 
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[1] POMERANZ L E, REYNOLDS A E, HENGARTNER C J. Molecular biology of pseudorabies virus: Impact on neurovirology and veterinary medicine[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2005, 69(3): 462-500. doi: 10.1128/MMBR.69.3.462-500.2005
[2] 王春芳, 付琦媛, 郑宾宾, 等. 伪狂犬病毒跨物种感染与传播[J]. 病毒学报, 2022, 38(4): 1001-1006. [3] BO Z, LI X. A review of pseudorabies virus variants: Genomics, vaccination, transmission, and zoonotic potential[J]. Viruses, 2022, 14(5): 1003. doi: 10.3390/v14051003
[4] VERPOEST S, CAY B, FAVOREEL H, et al. Age-dependent differences in pseudorabies virus neuropathogenesis and associated cytokine expression[J]. Journal of Virology, 2017, 91(2): e02058-16.
[5] NARITA M, IMADA T, HARITANI M. Immunohistological demonstration of spread of Aujeszky’s disease virus via the olfactory pathway in HPCD pigs[J]. Journal of Comparative Pathology, 1991, 105(2): 141-145. doi: 10.1016/S0021-9975(08)80069-2
[6] ZHENG H H, FU P F, CHEN H Y, et al. Pseudorabies virus: From pathogenesis to prevention strategies[J]. Viruses, 2022, 14(8): 1638. doi: 10.3390/v14081638
[7] NAUWYNCK H, GLORIEUX S, FAVOREEL H, et al. Cell biological and molecular characteristics of pseudorabies virus infections in cell cultures and in pigs with emphasis on the respiratory tract[J]. Veterinary Research, 2007, 38(2): 229-241. doi: 10.1051/vetres:200661
[8] CHEN J, LI G, WAN C, et al. A comparison of pseudorabies virus latency to other alpha-herpesvirinae subfamily members[J]. Viruses, 2022, 14(7): 1386. doi: 10.3390/v14071386
[9] HUANG X, QIN S, WANG X, et al. Molecular epidemiological and genetic characterization of pseudorabies virus in Guangxi, China[J]. Archives of Virology, 2023, 168(12): 285. doi: 10.1007/s00705-023-05907-2
[10] LIU Q, KUANG Y, LI Y, et al. The epidemiology and variation in pseudorabies virus: A continuing challenge to pigs and humans[J]. Viruses, 2022, 14(7): 1463. doi: 10.3390/v14071463
[11] LI X D, FU S H, CHEN L Y, et al. Detection of pseudorabies virus antibodies in human encephalitis cases[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2020, 33(6): 444-447.
[12] PENG Z, LIU Q, ZHANG Y, et al. Cytopathic and genomic characteristics of a human-originated pseudorabies virus[J]. Viruses, 2023, 15(1): 170. doi: 10.3390/v15010170
[13] YANG H, HAN H, WANG H, et al. A case of human viral encephalitis caused by pseudorabies virus infection in China[J]. Frontiers in Neurology, 2019, 10: 534. doi: 10.3389/fneur.2019.00534
[14] LIU Q, WANG X, XIE C, et al. A novel human acute encephalitis caused by pseudorabies virus variant strain[J]. Clinical Infectious Diseases, 2021, 73(11): E3690-E3700. doi: 10.1093/cid/ciaa987
[15] YE G, LIU H, ZHOU Q, et al. A tug of war: Pseudorabies virus and host antiviral innate immunity[J]. Viruses, 2022, 14(3): 547. doi: 10.3390/v14030547
[16] SAPIR A, AVINOAM O, PODBILEWICZ B, et al. Viral and developmental cell fusion mechanisms: Conservation and divergence[J]. Developmental Cell, 2008, 14(1): 11-21. doi: 10.1016/j.devcel.2007.12.008
[17] CONNOLLY S A, JARDETZKY T S, LONGNECKER R. The structural basis of herpesvirus entry[J]. Nature Reviews Microbiology, 2021, 19(2): 110-121. doi: 10.1038/s41579-020-00448-w
[18] TAN L, WANG K, BAI P, et al. Host cellular factors involved in pseudorabies virus attachment and entry: A mini review[J]. Frontiers in Veterinary Science, 2023, 10: 1314624. doi: 10.3389/fvets.2023.1314624
[19] ZHANG N, YAN J, LU G, et al. Binding of herpes simplex virus glycoprotein D to nectin-1 exploits host cell adhesion[J]. Nature Communications, 2011, 2: 577. doi: 10.1038/ncomms1571
[20] PAN Y, GUO L, MIAO Q, et al. Association of THBS3 with glycoprotein D promotes pseudorabies virus attachment, fusion, and entry[J]. Journal of Virology, 2023, 97(2): e01871-22.
[21] GRUND T, NEUMANN I D. Neuropeptide S induces acute anxiolysis by phospholipase C-dependent signaling within the medial amygdala[J]. Neuropsychopharmacology, 2018, 43(5): 1156-1163. doi: 10.1038/npp.2017.169
[22] GOTTSCHALK M G, DOMSCHKE K. Genetics of generalized anxiety disorder and related traits[J]. Dialogues in Clinical Neuroscience, 2017, 19(2): 159-168. doi: 10.31887/DCNS.2017.19.2/kdomschke
[23] XU Y L, REINSCHEID R K, HUITRON-RESENDIZ S, et al. Neuropeptide S: A neuropeptide promoting arousal and anxiolytic-like effects[J]. Neuron, 2004, 43(4): 487-497. doi: 10.1016/j.neuron.2004.08.005
[24] TAPMEIER T T, RAHMIOGLU N, LIN J, et al. Neuropeptide S receptor 1 is a nonhormonal treatment target in endometriosis[J]. Science Translational Medicine, 2021, 13(608): eabd6469. doi: 10.1126/scitranslmed.abd6469
[25] SMITH K L, PATTERSON M, DHILLO W S, et al. Neuropeptide S stimulates the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and inhibits food intake[J]. Endocrinology, 2006, 147(7): 3510-3518. doi: 10.1210/en.2005-1280
[26] FANG C, ZHANG J, WAN Y, et al. Neuropeptide S (NPS) and its receptor (NPSR1) in chickens: Cloning, tissue expression, and functional analysis[J]. Poultry Science, 2021, 100(12): 101445. doi: 10.1016/j.psj.2021.101445
[27] ERDMANN F, KÜGLER S, BLAESSE P, et al. Neuronal expression of the human neuropeptide S receptor NPSR1 identifies NPS-induced calcium signaling pathways[J]. PLoS One, 2015, 10(2): e0117319.
[28] XU Y L, GALL C M, JACKSON V R, et al. Distribution of neuropeptide S receptor mRNA and neurochemical characteristics of neuropeptide S-expressing neurons in the rat brain[J]. Journal of Comparative Neurology, 2007, 500(1): 84-102. doi: 10.1002/cne.21159
[29] LI C, MA Y, CAI Z, et al. Neuropeptide S and its receptor NPSR enhance the susceptibility of hosts to pseudorabies virus infection[J]. Research in Veterinary Science, 2022, 146: 15-23. doi: 10.1016/j.rvsc.2022.03.008
[30] D’AMATO M, BRUCE S, BRESSO F, et al. Neuropeptide S receptor 1 gene polymorphism is associated with susceptibility to inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2007, 133(3): 808-817. doi: 10.1053/j.gastro.2007.06.012
[31] VENDELIN J, BRUCE S, HOLOPAINEN P, et al. Downstream target genes of the neuropeptide S-NPSR1 pathway[J]. Human Molecular Genetics, 2006, 15(19): 2923-2935. doi: 10.1093/hmg/ddl234
[32] NEURATH M F, FINOTTO S. IL-6 signaling in autoimmunity, chronic inflammation and inflammation-associated cancer[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2011, 22(2): 83-89.
[33] XU J J, CHENG X F, WU J Q, et al. Pseudorabies virus pUL16 assists the nuclear import of VP26 through protein-protein interaction[J]. Veterinary Microbiology, 2021, 257: 109080. doi: 10.1016/j.vetmic.2021.109080
[34] VALLBRACHT M, REHWALDT S, KLUPP B G, et al. Functional relevance of the N-terminal domain of pseudorabies virus envelope glycoprotein H and its interaction with glycoprotein L[J]. Journal of Virology, 2017, 91(9): e00061.
[35] WU H, QI H, WANG B, et al. The mutations on the envelope glycoprotein D contribute to the enhanced neurotropism of the pseudorabies virus variant[J]. Journal of Biological Chemistry, 2023, 299(11): 105347. doi: 10.1016/j.jbc.2023.105347
-
期刊类型引用(14)
1. 潘婷婷，康喜龙，黄霞，孟闯，潘志明，焦新安. 非洲猪瘟诊断靶标的研究进展. 微生物学通报. 2025(02): 510-521 . 
百度学术
2. 苗雅倩，杨艳歌，赵健淞，魏莹，王秀娟，袁飞，王正亮，张峰. 配方乳粉中6种致病菌双重酶促等温扩增快速检测方法的建立. 微生物学报. 2025(03): 1319-1336 . 百度学术
3. 赵健淞，杨艳歌，刘通，魏莹，李红娜，李涛，孙冬梅，袁飞. 现制直饮品中铜绿假单胞菌的ERA快速检测. 中国食品学报. 2025(04): 376-385 . 百度学术
4. 华冰洁. 非洲猪瘟的研究进展. 中国动物保健. 2024(02): 7-8+28 . 百度学术
5. 潘建良. 非洲猪瘟防控期间养猪场生物安全管理探讨. 今日畜牧兽医. 2023(02): 22-23+26 . 百度学术
6. 王帅，杨艳歌，吴占文，李红娜，李涛，孙冬梅，袁飞. 重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展. 食品科学. 2023(09): 297-305 . 百度学术
7. 林志伟，王帅，王迎春，吴占文，李涛，李红娜，杨艳歌，袁飞. 婴儿配方乳粉中食源性致病菌双重ERA快速检测方法的建立. 食品科学. 2023(18): 347-354 . 百度学术
8. 杨艳歌，王帅，李红娜，李涛，吴占文，孙冬梅，袁飞. 沙门氏菌ERA可视化快速检测方法的建立. 中国食品学报. 2023(10): 261-272 . 百度学术
9. 杨艳歌，吴占文，李涛，王帅，李红娜，孙冬梅，袁飞. GI和GII诺如病毒ERA的可视化快速检测. 华南理工大学学报(自然科学版). 2023(12): 140-151 . 百度学术
10. 王翠，许宗丽，黄溢泓，覃艳然，梁竞臻，周师师，刘针伶，黄小武，马小蓉，李志源，严斯刚. 非洲猪瘟病原学检测技术研究进展. 中国动物检疫. 2022(02): 74-81 . 百度学术
11. 张帅，刘媛，赵云环，刘莹，左玉柱，范京惠. 非洲猪瘟病毒研究进展. 中国兽医学报. 2022(12): 2569-2577 . 百度学术
12. 魏晓通，周宇航，刘扬，荣馨锐，张士新，徐亚维. 酶促恒温扩增技术快速鉴定食品中牡蛎成分. 食品科技. 2022(11): 255-261 . 百度学术
13. 倪俊芬，陈前岭，仲向前. 我国对非洲猪瘟病毒的研究进展综述. 中国猪业. 2022(06): 70-74 . 百度学术
14. 王良辉. 精准清洗消毒是防控非洲猪瘟的重要措施. 兽医导刊. 2021(23): 79-80 . 百度学术
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