香蕉Musa spp.是我国重要的水果之一，随着复种指数的不断提高，病虫害对香蕉生产造成了严重影响。近年来，香蕉细菌性鞘腐病在我国云南、海南、广西、广东等地不同类型香蕉中发生较普遍，田间发病率一般为5%~10%，部分田块高达70%~80%^[1]。该病主要危害香蕉中下部叶鞘，病原从香蕉最外层叶鞘侵染，出现黑褐色小点，病斑不断扩大，从外层叶鞘向假茎扩展导致腐烂，叶片由下往上迅速黄化、萎蔫并干枯，极大影响香蕉产量和品质。

前人报道引起香蕉鞘腐病的病原菌主要有成团泛菌Pantoea agglomerans、香蕉小腔球菌Mycosphaerella musicola、刺腐菌Pythium spinosum、芭蕉假尾孢Pseudocercospora musae^[2]以及迪基氏菌属Dickeya spp.的不同种^[3-4]，如D. paradisiaca ^[5]、D. zeae^[6]和D. dadantii ^[1]。广东省微生物信号与病害防治重点实验室通过形态学、生理生化以及分子生物学方法对香蕉细菌性鞘腐病的病原进行了鉴定，病原为D. dadantii ^[1]，并对香蕉细菌性鞘腐病菌致病力强的菌株XJ12进行了全基因组序列分析^[7]，进一步表明引起香蕉细菌性鞘腐病的病原为D. dadantii。目前，细菌分类主要依靠病原表型特征、生理生化、血清学、Biolog系统、DNA-DNA杂交、PCR技术等。肖文超^[8]和Liu等^[1]根据病原的寄主范围、理化性质将引起香蕉细菌性鞘腐病的病原鉴定为D. dadantii，但研究发现在病原鉴定时16S rDNA不能用于区分亲缘关系比较近的种^{[1, 9]}。而管家基因是生命活动必需的基因，表达相对稳定，这类基因也常用于细菌分类^{[6, 10]}，研究发现dnaX比16S rDNA 能更好地区分由Dickeya spp. 引起的马铃薯黑茎病^{[6, 11]}。Liu等^[1]也发现dnaJ、dnaX、gyrB、recN、fusA、gyrA和recA 这7种管家基因能鉴定Dickeya spp.不同种。

来自不同地区或不同寄主的Dickeya菌株存在致病力分化现象，并且遗传多样性丰富^{[1, 5, 8, 12]}。目前，由D. dadantii引起的香蕉细菌性鞘腐病除已知病原^[1]及其全基因组序列^[7]外，鲜见病原致病性分化等方面的研究。我们在田间香蕉、粉蕉、大蕉等不同类型栽培品种上发现不同的疑似香蕉细菌性鞘腐病病株，为探究其病原，从这些疑似病株上再次分离出Dickeya菌株，并对这些菌株进行分子鉴定和致病性分化研究，为进一步研究香蕉细菌性鞘腐病菌的致病机理及防控奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

从不同的栽培品种中分离得到菌株15株：XJ1和XJ2分离自珠海斗门的香芽蕉‘巴西蕉’，XJ3和XJ4分离自珠海斗门的粉蕉‘广粉1号’，XJ5和XJ6分离自广州南沙的粉蕉‘粉蕉1号’， XJ7和XJ8分离自惠州博罗的香芽蕉‘巴西蕉’，XJ9和XJ10分离自惠州博罗的粉蕉‘粉蕉1号’，XJ11和XJ12分离自东莞横沥的香芽蕉‘巴西蕉’，XJ13和XJ14分离自东莞横沥的粉蕉‘粉蕉1号’， XJ15分离自东莞麻涌的大蕉‘东莞大蕉’。以华南农业大学植物病毒研究室保存的香蕉细菌性鞘腐病菌标准菌株XJ5-1为对照，该菌株分离自广州南沙的粉蕉‘广粉1号’。5~6叶期健康‘巴西蕉’购于华南植物园；假茎采自田间健康植株。

1.2   病菌分离纯化

取病、健交界处假茎1 cm×1 cm，用体积分数为70%的乙醇溶液消毒5~10 s，随后用蒸馏水漂洗。用无菌刀切取中间部分于0.5 mL无菌水中捣碎。用接种环取菌液在牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养。3次单菌落划线纯化后，得到纯培养病原菌。所获单菌落接种于LB液体培养基中，在27 ℃条件下振荡培养16~18 h，直至D_{600 nm}为1.0。

1.3   病菌接种

病原菌接种方法分为离体接种法和活体接种法。根据植物种类及特点，选择适合的接种方法。每个处理10株幼苗，或10块假茎。重复3次。致病性划分标准参考文献[5]。香蕉假茎采用离体接种法，将病原菌配制成1×10⁸ cfu/mL菌悬液；用无菌注射器针刺后，在针刺点滴上10 µL菌悬液，用保鲜膜封，喷水保湿，于30 ℃培养箱中培养48 h后，统计发病情况。香蕉幼苗采用活体接种法，用无菌注射器将1×10⁸ cfu/mL菌液注射到5~6叶期香蕉叶鞘，无菌培养液注射香蕉植株作为空白对照。喷水保湿1周后，统计发病情况。

1.4   PCR鉴定和系统进化树分析

细菌DNA抽提采用TIANGEN 细菌基因组DNA提取试剂盒，提取的DNA保存于−20 ℃备用。采用Dickeya属特异引物ADE1/ADE2^[13]，分别对分离的病原菌株进行PCR鉴定。根据管家基因的保守序列设计引物(表1)，对fusA、gyrA、recA、gyrB、dnaJ、dnaX 6个管家基因进行分析。利用软件MEGA5.1构建目标序列和来源于NCBI参考菌株序列的系统进化树。

表  1  本研究所用引物

Table  1.  Primers used in this study

引物 Primer	引物序列(5′→3′) Primer sequence	片段长度/bp Fragment length	引物来源 Source
ADE1	GATCAGAAAGCCCGCAGCCAGAT	420	[13]
ADE2	CTGTGGCCGATCAGGATGGTTTTGTCGTGC
fusA-F	GAACGCAGAACCACAGGTAAC	238	本研究 This study
fusA-R	CTGATCGGAGTCATTCCAGTTG
gyrA-F	GATTTCATTGATCGGCTGCTGG	368	本研究 This study
gyrA-R	CAACGAGGTGATGCTGTTCTC
recA-F	GATGTTGAAACGATCTCCACGG	291	本研究 This study
recA-R	CTGGAAATCTGTGATGCGCTG
gyrB-F	TAAGTTYGACGAYAACTCSTAYAARGT	973	[14]
gyrB-R	CCCCTTCCACCAGGTASAGTTC
dnaJ-F	TACGTTACACCATGGAGCTGAC	744	[8]
dnaJ-R	CGAAGAAACTTTTGGAACGTGG
dnaX-F	TATCAGGTTCTTGCCCGTAAGTGG	524	[11]
dnaX-R	GCTTTGAGATGAAACTGCAA

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1.5   代表菌株XJ12与参考菌株的共线性分析

对代表菌株XJ12的全基因组序列与参考菌株D. dadantii 3937、 D. chrysanthemi Ech1591、D. zeae Ech586 和D. paradisiaca Ech703的全基因组序列进行共线性分析，以进一步确定其分类地位。使用MUMmer3.2软件对代表菌株XJ12的基因组和参考菌株的基因组进行比对分析，以确定它们之间的共线性关系。

2.   结果与分析

2.1   香蕉细菌性鞘腐病病原分离鉴定

经3次单菌落划线培养，从发病程度不同的栽培品种中共分离获得菌株15株。对这些菌株分别采用Dickeya属特异引物ADE1/ADE2^[13]进行PCR鉴定，结果表明，这15株菌株和对照XJ5-1都能扩增出420 bp左右的目的条带，说明从不同香蕉栽培品种中分离的这15株菌株属于Dickeya spp.。

2.2   分离菌株的致病性分化

根据陈康等^[5]的分类标准，致病力不同的Dickeya菌株可以分为3类，即强(++++)、 较强(+++)和中等(++)致病力菌株。将分离的15株菌株分别采用离体接种法接种‘巴西蕉’假茎，接种24 h后，在接种部位出现褐色小点，随后病斑扩大成黄褐色圆形或椭圆形水渍状斑(图1)，易流出病汁液，严重时变褐腐烂，并有臭味，与香蕉细菌性鞘腐病田间症状一致。接种48 h后，香蕉假茎发病情况统计表明，不同菌株致病力不同，其中强致病力菌株有XJ1、XJ8、XJ11、XJ12和对照XJ5-1；较强致病力菌株有XJ2、XJ3、XJ4和XJ7；中等致病力菌株有XJ5、XJ6、XJ9、XJ10、XJ13、XJ14和XJ15(表2)。

图  1  香蕉细菌性鞘腐病病菌不同致病性菌株接种‘巴西蕉’假茎(A~D)和幼苗(E~F)症状

A和E：强致病性菌株；B和F：较强致病性菌株；C和G：中等致病性菌株；D和H：清水对照

Figure  1.  Symptoms of pseudostems (A−D) and seedlings (E−F) of ‘Brazilian banana’ inoculated with different pathogenic strains of banana bacterial sheath rot

A and E: Strong pathogenic strain; B and F: Relatively strong pathogenic strain; C and G: Moderate pathogenic strain; D and H: Water control

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表  2  香蕉细菌性鞘腐病菌菌株接种‘巴西蕉’假茎和幼苗的致病力分化

Table  2.  Pathogenicity differentiation of strains of banana bacterial sheath rot inoculated on pseudostems and seedlings of ‘Brazilian banana’

菌株 Isolate	假茎 Pseudostem			幼苗 Seedling
	严重度 Severity	致病性 Pathogenicity		严重度 Severity	致病性 Pathogenicity
XJ5-1(CK)	++++	强 Strong		++++	强 Strong
XJ1	++++	强 Strong		++++	强 Strong
XJ2	+++	较强 Relatively strong		+++	较强 Relatively strong
XJ3	+++	较强 Relatively strong		+++	较强 Relatively strong
XJ4	+++	较强 Relatively strong		+++	较强 Relatively strong
XJ5	++	中 Moderate		++	中 Moderate
XJ6	++	中 Moderate		++	中 Moderate
XJ7	+++	较强 Relatively strong		+++	较强 Relatively strong
XJ8	++++	强 Strong		++++	强 Strong
XJ9	++	中 Moderate		++	中 Moderate
XJ10	++	中 Moderate		++	中 Moderate
XJ11	++++	强 Strong		+++	较强 Relatively strong
XJ12	++++	强 Strong		++++	强 Strong
XJ13	++	中 Moderate		++	中 Moderate
XJ14	++	中 Moderate		++	中 Moderate
XJ15	++	中 Moderate		++++	强 Strong

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采用活体接种法接种5~6叶期健康‘巴西蕉’叶鞘，接种1 d后，在叶鞘处出现褐色小点，症状与接种香蕉假茎相同；接种7 d后，‘巴西蕉’叶片变黄(图1)，与香蕉细菌性鞘腐病田间症状相同。‘巴西蕉’发病情况统计表明，这15株菌株中，XJ1、XJ8、XJ12、XJ15和对照XJ5-1属于强致病力菌株；XJ2、XJ3、XJ4、XJ7和XJ11为较强致病力菌株；XJ5、XJ6、XJ9、XJ10、XJ13和XJ14为中等致病力菌株(表2)。

2种接种方法结果都表明，引起香蕉细菌性鞘腐病的这15株菌株致病力出现明显分化，强致病力菌株有XJ1、XJ8、XJ12和对照XJ5-1，较强致病力菌株有XJ2、XJ3、XJ4、XJ7和XJ11，其余为中等致病力菌株。

2.3   利用16S rDNA进行鉴定

选取强致病力菌株XJ12、较强致病力菌株XJ2以及中等致病力菌株XJ13的DNA进行16S rDNA分析，以明确这些病原分类地位。核苷酸序列分析表明，这3株香蕉菌株和D. dadantii序列相似性为97.1%以上。但是根据16S rDNA构建的系统进化树，由于D. dadantii不同菌株排列紧密，以致无法区分。因此，根据16S rDNA构建的系统进化树难以判断这些菌株的分类地位。而16S rDNA基因序列的相似性分析表明，所获得的分离物属于D. dadantii。

2.4   利用管家基因进行系统进化树分析

为了进一步判断所获菌株的分类地位，对XJ2、XJ12、XJ13菌株DNA的6个管家基因 fusA、gyrA、recA、gryB、dnaJ、dnaX进行PCR扩增，结果表明，PCR扩增结果与预期相符。随后分别构建了单个管家基因和多个管家基因的系统进化树。

分别根据fusA、gyrA、dnaJ、dnaX单个基因构建的系统进化树表明，XJ2、XJ12、XJ13和对照XJ5-1与D. dadantii 3937等位于同一分支上，表明所分离的菌株和D. dadantii亲缘关系最近，与Dickeya其他种的亲缘关系较远。分别根据recA和gyrB单个基因构建的系统进化树中，XJ2、XJ12、XJ13和对照XJ5-1分别与D. dadantii的其他种构成一个分支，而参考菌株D. dadantii 3937为一个独立分支。根据fusA、gyr A、recA、gryB、dnaJ、dnaX 6个管家基因共同构建的系统进化树中，XJ2、XJ12、XJ13和对照XJ5-1菌株都位于同一个分支，而D. dadantii 3937则位于独立分支(图2)，XJ2、XJ12、XJ13、对照XJ5-1菌株与D. dadantii 3855和D. dadantii 6467亲缘关系最近。表明由多基因共同构建的进化树比单基因构建的进化树更利于了解菌株的进化关系。

图  2  基于6个管家基因构建的香蕉细菌性鞘腐病不同致病力菌株和NCBI参考菌株的系统进化树

Figure  2.  Phylogenetic analysis of different pathogenic strains of banana bacterial sheath rot and reference strains from NCBI based on six housekeeping genes

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虽然16S rDNA构建的系统进化树不能区分致病力不同的Dickeya菌株；但在不同单个管家基因构建的系统进化树和由6个管家基因共同构建的系统进化树中，菌株XJ2、XJ12、XJ13和对照XJ5-1与D. dadantii亲缘关系比较近。因此，管家基因比16S rDNA能更好地区分D. dadantii不同菌株。

2.5   菌株XJ12与Dickeya其他种的共线性分析

为了进一步分析代表菌株XJ12与Dickeya其他种的亲缘关系，将XJ12全基因组序列和Dickeya中已报道全序列的4个种进行共线性分析，以明确菌株XJ12与Dickeya基因组的一致性和变异性。结果表明，菌株XJ12和D. dadantii 3937、D. chrysanthemi Ech1591、D. zeae Ech586 、D. paradisiaca Ech703基因组的比对覆盖率分别是96.54%(图3)、79.12%、75.59%和37.43%。说明代表菌株XJ12与D. dadantii 3937共线性关系最好，两者存在大量的同源基因，仅少数基因易位。进一步证明了代表菌株XJ12属于D. dadantii。

图  3  香蕉细菌性鞘腐病菌株XJ12与Dickeya dadantii 3937的共线性分析

上轴表示D. dadantii 3937基因组，下轴表示XJ12基因组；红色的连线是指正向比对，蓝色的连线是指反向比对；右边标注的百分比是指菌株XJ12与D. dadantii 3937的基因组比对覆盖度

Figure  3.  Collinearity analysis of strain XJ12 of banana bacterial sheath rot and Dickeya dadantii 3937

The upper axis representes the genome of D. dadantii 3937, and the lower axis represents the genome of strain XJ12; The red lines refer to the forward alignment, the blue lines refer to the reverse alignment; The percentage marked on the right side is the coverage of genome comparison between strain XJ12 and D. dadantii 3937

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3.   讨论与结论

近年来，D. dadantii引起的香蕉细菌性鞘腐病越来越严重，已对我国香蕉生产造成严重威胁。由D. dadantii引起的香蕉细菌性鞘腐病为广东省微生物信号与病害防治重点实验室首次发现^[8]，目前报道了该病原的鉴定^[1]及全基因组序列^[7]，但是该病害的相关研究不多。本研究从不同品种以及发病程度不同的香蕉中再次分离出香蕉细菌性鞘腐病病原，并进行了分子鉴定及致病性分化研究。这些结果再次表明，引起香蕉细菌性鞘腐病的病原为D. dadantii，但是致病性出现分化，为D. dadantii致病机理的研究奠定基础。

常用的细菌分类不再局限于细菌的理化性质等普通生物学鉴定方法，16S rDNA序列、ITS序列和管家基因等也常应用于细菌分类鉴定^{[1, 15-17]}，如Van Der Wolf 等^[16]通过7个管家基因成功鉴定了马铃薯黑茎病的病原Dickeya spp.，说明管家基因能准确区分Dickeya spp.不同种。因为16S rDNA基因序列高度保守，对亲缘关系较近的种区分度不高。在基因复制过程中单基因可能产生基因丢失和基因重组，影响生物进化，在单基因分析时易出现偏差^[15]；而应用多个管家基因进行细菌分类鉴定可以减少这种影响^[18]。因此，多个管家基因比16S rDNA更适合Dickeya不同种系统发育分析，能更准确地反应Dickeya不同种之间的关系。本研究从田间不同类型香蕉病株上分离到15株菌株，PCR初步鉴定为Dickeya成员，但是发现16S rDNA不能区分Dickeya不同种；而采用多个管家基因dnaJ、dnaX、gyrB、fusA、gyrA和recA构建的进化树，能区分D. dadantii不同菌株，这与其他学者^[1]的研究结果一致。共线性关系分析进一步说明香蕉细菌性鞘腐病菌株XJ12与D. dadantii 3937关系密切；同时，也反映了多个管家基因对Dickeya不同种分类的准确性。

由于遗传、栽培环境和寄主的不同，同种Dickeya不同菌株之间，可能由于基因重组或基因突变引起核苷酸序列发生变化，并造成不同菌株间可能存在致病力分化或寄主专化性现象^{[5, 19-20]}。系统了解Dickeya属不同种、菌株之间的致病力差异，将有利于揭示Dickeya病菌的致病力分化机制和致病的分子机理。Dickeya中同种病原的不同菌株之间在不同寄主植物上表现出不同的致病力，如香蕉软腐病菌菌株和水稻基腐病菌属于同种病原，但是接种不同属植物却表现出不同的致病力^[21]。Zhou 等^[22]发现在D. zeae EC1中转录调控因子slyA基因突变后，其毒素Zeamines产量明显降低，同时还影响该菌胞外酶产量、运动性以及生物膜的形成，即s1yA基因突变直接影响了D. zeae EC1 致病性。本研究结果表明，分离自不同类型香蕉的细菌性鞘腐病不同菌株之间致病性差异明显。一般情况下，田间侵染‘巴西蕉’的菌株致病性强于侵染粉蕉的菌株，可能与这些菌株致病基因的差异有关。

香蕉细菌性病害常见的接种方法有伤根法、灌根法、假茎离体接种法和盆栽活体接种法，但是同种病原采用不同的接种方法可能出现结果不一致的情况，而不同生长期的香蕉植株的抗病性也存在一定差异^[5]。在研究致病力分化时，本研究也出现少数致病力结果不一致的情况，如XJ15在离体接种时为中等致病力菌株，而活体接种时为强致病力菌株，是接种方法还是香蕉植株本身的抗病性导致的致病性差异有待进一步研究。

本研究首次对不同类型香蕉的细菌性鞘腐病病原进行了分子鉴定和致病力差异分析，明确了多个管家基因对于Dickeya不同种划分的优势以及同种D. dadantii不同菌株间存在明显的致病力差异，为香蕉细菌性鞘腐病的流行防控提供了一定理论依据。