Disease resistance of SlJAZ7 and its interaction with SlTGA7 in tomato
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摘要:目的
细菌性斑点病是导致番茄Solanum lycopersicum减产的主要因素之一，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000)是细菌性斑点病的致病因子之一。瞬时沉默番茄JAZ7基因导致其对Pst DC3000的敏感性增加，然而，验证JAZ7基因抗细菌性斑点病的直接证据及其作用机理的报道较少。本研究从番茄叶片中克隆得到SlJAZ7基因，创制稳定遗传的过表达SlJAZ7的转基因番茄，分析其抗病功能和机理，研究其在转录水平和蛋白水平上与抗病性密切相关的SlTGA7的关系，为有效防治细菌性斑点病提供理论基础。
方法通过野生型和转基因番茄接种Pst DC3000的表型差异分析，鉴定SlJAZ7基因的抗病功能。使用RT-qPCR分析SlJAZ7和SlTGA7基因在Pst DC3000、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)和水杨酸(Salicylic acid，SA)处理下的表达模式和组织特异性。利用烟草瞬时表达的方法研究SIJAZ7和SlTGA7蛋白的亚细胞定位。利用酵母双杂交(Y2H)试验、双分子荧光互补(BiFC)试验和蛋白下拉(pull down)试验研究SlJAZ7蛋白与SlTGA7蛋白的互作关系，验证SlJAZ7的抗病功能和可能的抗病机理。
结果过表达SlJAZ7基因的转基因番茄叶片在Pst DC3000处理时受到的过氧化损伤较野生型更少，转基因株系中SlTGA7表达量升高，SlJAZ7基因在营养器官中高表达，且受到Pst DC3000诱导，响应MeJA、SA处理，SlTGA7基因在同样的处理下呈相反的变化趋势。SlJAZ7和SlTGA7蛋白均定位于细胞核。Y2H、BiFC和pull down试验同时证明SlJAZ7蛋白和SlTGA7蛋白存在互作关系。
结论过表达SlJAZ7基因有利于减少活性氧积累，提高番茄抗病性，同时SlJAZ7在转录水平正调控SlTGA7基因表达。SlJAZ7与SlTGA7存在互作，推测SIJAZ7基因可能通过提高Pst DC3000病原菌侵染时SITGA7基因的表达量，启动SITGA7下游抗病基因的表达来提高转基因番茄的抗病性，也可能通过与SITGA7蛋白结合，影响其调控MYC等转录因子的活性。这为进一步研究SlJAZ7的作用机制奠定了基础。
Abstract:ObjectiveBacterial spot disease is one of the main factors leading to tomato (Solanum lycopersicum) yield reduction, and Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) is one of the pathogenic factors of bacterial spot disease. Transient silencing of JAZ7 gene in tomato results in its increased susceptibility to Pst DC3000. At present, there are a few reports to verify the resistance function and mechanism of JAZ7 gene in tomato. In this study, we cloned SlJAZ7 gene in tomato leaves, and a stable genetic transgenic tomato with overexpression of SlJAZ7 was created to analyze its resistance function and mechanism, and the relationship between SlJAZ7 and SlTGA7, which is closely related to disease resistance, was studied at the transcriptional and protein levels, providing a theoretical basis for effective prevention and control of bacterial spot disease.
MethodThe resistance function of SlJAZ7 gene was determined by the phenotypic difference between wild type and transgenic tomato inoculated with Pst DC3000. RT-qPCR was used to analyze the tissue-specific expression of SlJAZ7 gene and SlTGA7 gene under Pst DC3000, methyl jasmonate (MeJA) and salicylic acid (SA) treatments. The subcellular localization of SIJAZ7 and SlTGA7 proteins was studied by transient expression of tobacco. The interaction between SlJAZ7 and SlTGA7 was verified by Y2H, BiFC and pull down experiments, to verify the disease resistance function and possible mechanism of SlJAZ7.
ResultTransgenic tomato leaves overexpressing SlJAZ7 gene had lower peroxidation damage than wild type when treated with pathogens, the expression level of SlTGA7 in transgenic lines increased. SlJAZ7 gene was highly expressed in nutrient tissues. SlJAZ7 gene was induced by Pst DC3000 and in response to MeJA and SA treatments. SlTGA7 gene showed opposite change trend under the same treatment. Both SlJAZ7 and SlTGA7 proteins were located in the nucleus. All Y2H, BiFC and pull down experiments proved the interaction between SlJAZ7 and SlTGA7.
ConclusionOverexpression of SlJAZ7 gene can reduce the accumulation of reactive oxygen species and improve tomato disease resistance. SlJAZ7 positively regulates SlTGA7 gene expression at the transcriptional level. SlJAZ7 interacts with SlTGA7. It is speculated that SIJAZ7 gene may improve the disease resistance of transgenic tomato by increasing the expression level of SITGA7 gene during pathogen infection, initiating the expression of downstream resistance genes of SITGA7, or by binding with SITGA7 protein, affecting its regulation of MYC and other transcription factors. The result lays a foundation for further research on the mechanism of SlJAZ7.
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Keywords:
- Tomato /
- SlJAZ7 /
- Protein interaction /
- Disease resistance /
- Methyl jasmonate /
- Salicylic acid
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近年来，随着我国农业生产的快速发展，对农业机械化的需求大幅增加，推进农机装备技术改进，研发适合国情、农民需要、先进适用的各类智能农机装备迫在眉睫。在农机装备智能领域，高效喷雾施药技术的一个主要标准是农药在靶标上的沉积率远高于其在非目标物或区域中的沉积率。这也是最大程度地提高农药有效利用率，同时消除农药对操作人员的危害以及降低环境污染的一个重要途径[1-3]。然而，我国在农业生产中对农药的有效利用率只有30%左右，流失量较高[4-5]。
农药雾化是农药以雾滴的形式分散到大气中，形成雾状分散体系的过程，其实质是喷雾液滴在外力的作用下实现比表面积的大幅度扩增[6-8]。将农药药液雾化为雾滴的过程依靠喷头来实现[9]。农药雾化程度直接影响农药漂移距离及沉积有效利用率。喷雾雾滴粒径分布是农药雾化程度的主要检测指标[10-11]。较大雾滴能够在较长时间内保持动量，到达靶标时间短，漂移较小，但雾滴过大又容易造成药液覆盖率降低、靶标附着性差和药液流失[12-14]。较小的雾滴由于其质量小，受到空气阻力影响大，通常会由于动量不足而无法到达靶标[15]，但小雾滴有助于增大药液覆盖率、提升雾滴覆盖的均匀性和增大药液在作物冠层的穿透性[16]。
无论采用何种喷雾方式，植保机械的作业质量与雾滴直径大小都有直接关系[17]。如果选择的雾滴大小合适，可以用最小的药量，以最小的环境污染达到最大控制病虫害的目的。如果实际的雾滴比需要的雾滴大，所浪费的农药就会以雾滴直径三次方的速率增长[18]。张瑞瑞等[19]利用不同类型及浓度助剂分析比较空气诱导喷头IDK120-025和多量程平面喷头LU120-015的雾滴体积中径(Volume median diameter, VMD)及雾滴粒径相对分布跨度，结果表明不同类型及浓度的助剂对不同喷头效果不同，应根据所用喷头选择合适的助剂及配比浓度，降低农药雾滴漂移。王潇楠等[20]利用不同浓度抗蒸发助剂Agrospred 730、防漂移助剂Break-thru Vibrant、Silwet DRS-60、Greenwet 360分析比较了不同喷头雾滴漂移潜在指数，结果表明添加助剂浓度不同，雾滴体积中径不同，喷头潜在漂移指数不同。何玲等[21]利用不同表面张力的溶液分析了喷雾助剂对水稻冠层有效沉积率的影响。唐青等[22]利用不同气流条件对比分析了标准扇形喷头和空气诱导喷头的雾化特性。赵辉等[23]研究了不同喷雾液动态表面张力下，雾滴粒径的变化，结果表明动态表面张力改变对雾滴粒径的影响增大。
液体黏度影响喷头雾化性能[24]，本文配制不同黏度的喷雾液，研究喷雾液黏度对农用喷头的喷雾雾滴粒径的影响，以期为农药喷施技术及机械性能的提高提供理论支撑与试验依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本文选择乳油、可湿性粉剂、悬浮剂和水分散粒剂4种常见剂型的农药作为研究对象，具体为：体积分数为15%的哒螨灵乳油、质量分数为10%的吡虫啉可湿性粉剂、质量浓度为240 g/L的螺螨酯悬浮剂和质量分数为70%的啶虫脒水分散粒剂。按照农药剂型的使用说明把4种农药分别配制成溶液，利用黏度计测试4种药液的黏度，获得不同剂型农药在使用配比下药液的黏度范围。据此，用水与甘油配制喷雾液代替农药进行大量的喷雾试验研究，避免用农药进行试验造成环境污染。同时利用甘油与水配制出不同黏度的喷雾液进行对比试验。
试验喷头为东莞市沙鸥喷雾系统有限公司生产的实心锥喷头，喷嘴直径为0.8 mm。
1.2 试验仪器
试验所用的主要仪器有：丹麦DANTEC公司生产的多普勒动态粒子分析仪(Phase Doppler anemometry，简称PDA)，粒子测量范围为1~10 000 μm，测量误差为1%；上海方瑞仪器有限公司生产的NDJ-8T数字旋转黏度计，测量范围为1~2 000 cp，测量误差为±1%，重复误差为±0.5%，仪器均满足相关参数测量要求。
试验环境温度对液体黏度的测试有一定程度的影响，在液体黏度测试过程中，环境温度是动态变化的。为此，本文在每次试验前，均多次测量环境温度，并使用NDJ-8T型数字旋转黏度计多次对同一个样品进行黏度测试，保证测量结果的稳定性和可信性。
1.3 雾滴参数定义
本文主要对雾滴的3个指标参数进行了测量和分析，它们分别是：
算术平均直径(Arithmetic mean diameter，D10)：指取样雾滴群的直径之和与雾滴群个数之和的比值，
$${D_{10}} = \frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^{{N_i}} {{n_i}{D_i}}; $$ (1) 体积平均直径(Volume mean diameter，D30)：指取样雾滴群平均体积所对应的直径，
$${D_{{\rm{30}}}}{\rm{ = }}{\left[ {\frac{{\rm{1}}}{N}\sum\limits_{i = 1}^{{N_i}} {{n_i}D_i^3} } \right]^{\frac{1}{3}}};$$ (2) 索尔特平均直径(Sauter mean diameter，D32)：表明雾滴粒径对表面积的加权平均，
$${D_{32}} = \frac{{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{{N_i}} {{n_i}D_i^3} }}{{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{{N_i}} {{n_i}D_i^2} }};$$ (3) 在上述雾滴参数描述中，Di是指雾滴尺寸等级i的直径，Ni是指选择的雾滴尺寸等级i的个数，ni是指每个尺寸等级中的雾滴数，N是雾滴总数。
1.4 试验设计
液体的黏度和温度有极密切的关系，通常温度升高，黏度降低。本文测试液体黏度是在环境温度为(25±0.5) ℃的前提下进行的。
1.4.1 4种常用于防治木虱的农药黏度范围测试
为了揭示农药黏度对喷头雾滴参数的影响，根据农药使用说明的配比要求，配制了4种柑橘病虫害防治中常用的农药溶液，利用黏度计分别测量其黏度值，每隔2 min读取1次黏度值，共读取3次，取平均值作为最终黏度值，结果如表1所示。4种农药溶液黏度的平均最小值为1.25 cp，平均最大值为1.80 cp。
表 1 4种常见农药的黏度Table 1. Viscosities of four common pesticides农药类型
Pesticide type配比
Proportion测试黏度/cp Test viscosity 第1次 The 1st time 第2次 The 2nd time 第3次 The 3rd time 平均值 Average 螺螨酯 Spirodiclofen 1∶4 000 1.69 1.61 1.62 1.64 哒螨灵 Pyridaben 1∶2 200 1.81 1.80 1.80 1.80 啶虫脒 Acetamiprid 1∶25 000 1.26 1.24 1.24 1.25 吡虫啉 Imidacloprid 1∶3 400 1.49 1.50 1.51 1.50 1.4.2 替代试剂不同黏度甘油的配置
由于甘油与水能够以任意比例互溶，且纯甘油黏度较大，本文采用纯甘油与水以一定的比例混合，配制4种不同质量分数的甘油溶液，结果如表2所示。随着甘油质量分数的增大，溶液的黏度也逐渐变大，黏度范围能够涵盖常用的农药溶液黏度。
表 2 不同质量分数甘油溶液的黏度Table 2. Viscosities of different mass fractions of glycerin solution序号
Numberw(甘油)/%
Glycerin mass fraction测试黏度/cp Test viscosity 第1次 The 1st time 第2次 The 2nd time 第3次 The 3rd time 平均值 Average 1 0 1.10 1.11 1.11 1.10 2 12.5 1.29 1.31 1.30 1.30 3 22.5 1.62 1.63 1.63 1.63 4 32.5 2.18 2.20 2.19 2.19 5 42.5 2.99 2.98 3.00 2.99 1.4.3 雾滴参数的采样点设定
喷雾液黏度对喷头雾化性能的影响试验包括：不同喷雾液黏度下对喷头轴心线方向上雾滴参数的测定，以及不同喷雾液黏度下对喷头径向(轴心方向高度一定时)雾滴参数的测定。喷雾试验时，喷头轴心方向垂直地面，喷雾压力为0.9 MPa。
前期试验中，为了能够设置合适的喷头喷雾区域采样点，在喷雾压力为1.0 MPa条件下，测量了喷头的雾锥角，结果为44.14°，由此，利用预试验测得的雾锥角正切值的结果，可以确定喷雾区域的边界位置，从而确定雾滴采样点的范围。
轴心方向上雾滴采样点设定：为研究不同黏度对喷头轴心方向上雾滴粒径的影响，建立以喷头处为原点、水平向左方向为x、垂直向里方向为y、垂直向下方向为z的笛卡尔坐标系，在喷头雾化区域轴心方向上，从喷头z=0 cm处开始，每隔2 cm利用PDA分别测量轴心方向上雾滴参数。
径向雾滴采样点设定：为研究黏度对喷头径向雾滴粒径的影响，在轴心方向上分别选取z=30 cm，z=40 cm处的水平面，测量所对应径向上的雾滴粒径；在z=30 cm处x选取−8~8 cm之间；在z=40 cm处，x选取−10~10 cm之间，其中径向(x方向)采样点间隔均为1 cm，利用PDA分别测量每个采样点上的雾滴参数。
1.4.4 数据处理
运用统计分析软件SPSS16.0对轴心距离、液体黏度以及雾滴粒径的相关性进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 轴心方向上雾滴粒径分布特性
从喷头开始，每隔2 cm，测量喷头轴心方向上的雾滴参数，结果如表3所示。
表 3 不同黏度下轴心方向上雾滴参数1)Table 3. Droplet parameters in the axis direction under different viscositiesμm 轴心距离/cm
Axis distance1.10 cp 1.30 cp 1.63 cp 2.19 cp 2.99 cp D10 D30 D32 D10 D30 D32 D10 D30 D32 D10 D30 D32 D10 D30 D32 2 147.5 173.3 193.9 91.3 117.8 141.5 96.2 123.7 152.1 41.7 68.4 43.6 54.6 88.5 143.7 4 34.0 71.7 141.0 30.6 46.3 74.0 36.1 68.2 121.1 39.5 41.5 47.8 45.5 49.7 52.9 6 27.6 28.3 29.9 29.7 36.2 47.7 30.7 47.5 80.0 43.3 45.6 51.8 53.0 58.3 63.1 8 31.5 33.6 35.8 33.2 35.8 38.0 30.8 35.2 39.1 47.9 50.0 54.3 55.1 61.3 67.2 10 33.7 35.6 38.2 34.9 38.0 41.1 35.7 38.2 43.1 49.6 52.1 59.1 62.4 68.3 75.7 12 34.2 37.2 40.8 36.7 40.2 43.9 37.7 40.8 46.2 54.2 56.2 62.4 65.8 72.6 80.2 14 35.1 38.4 42.3 37.9 42.4 46.3 38.4 41.1 46.4 55.5 58.4 66.6 68.3 75.5 82.1 16 36.7 40.1 44.5 39.1 43.9 48.6 39.8 43.6 51.2 58.8 63.0 70.8 70.6 76.8 84.5 18 37.5 42.6 46.2 40.5 45.7 51.1 40.4 45.6 52.8 62.0 65.9 76.4 73.4 82.2 91.3 20 38.4 43.9 48.7 41.5 46.7 53.6 42.1 48.2 56.0 64.7 69.6 80.7 74.3 82.2 90.3 22 40.0 45.1 52.0 43.5 49.1 55.9 43.6 51.8 60.2 66.6 73.8 81.0 79.3 88.1 96.9 24 40.1 46.7 53.2 44.2 50.8 59.0 45.0 52.1 60.5 66.1 73.0 88.7 81.3 90.0 98.9 26 41.6 47.6 55.2 45.4 53.6 61.9 46.9 55.0 65.8 70.8 79.8 102.4 84.6 94.7 105.5 28 42.3 49.5 57.4 47.5 55.6 65.0 47.8 57.0 68.5 78.8 90.3 99.4 86.3 96.6 107.4 30 43.3 51.5 61.2 47.5 56.6 65.5 47.8 59.4 72.4 74.9 85.9 101.1 86.9 98.8 113.2 32 44.9 52.5 61.5 48.6 58.0 68.7 49.8 62.4 76.1 75.8 87.1 112.6 82.6 97.7 114.5 34 44.5 53.2 63.6 49.8 60.6 72.0 50.9 64.3 79.0 82.5 97.0 112.9 87.5 100.4 115.3 36 46.2 55.4 65.8 51.7 63.1 75 52.9 67.3 83.3 75.9 88.4 103.1 90.6 104.3 120.7 38 47.2 57.8 69.6 53.7 65.6 80.1 54.6 69.1 86.6 79.7 93.8 111.2 91.8 106.5 123.7 40 49.7 61.2 75.2 54.8 66.9 81.3 54.9 70.8 87.7 84.3 97.8 114.4 92.0 107.6 118.6 1) D10：算术平均直径；D30：体积平均直径；D32：索尔特平均直径
1) D10: Arithmetic mean diameter; D30: Volume mean diameter; D32: Sauter mean diameter从表3可以看出，在轴心方向上距离喷头1~6 cm的区间内，雾滴粒径变小趋势明显，分析原因可能是：在一定的压力下，射流以连续液体的形式从喷头高速流出，受到外界气体的扰动作用，液体表面会产生不稳定的波动，当液体流速较大时，液体表面的波幅将快速变大，最终波峰被撕裂下来，形成较大雾滴。随着射出距离变大，这种表面波的波幅将逐渐扩大，使液体分裂成大颗粒液滴，液滴直径超过了一定的阈值，在周围空气切应力的作用下，它们将进一步碎裂成更细小的液滴，故在距离喷头1~6 cm的区间内呈现出变小的趋势。
Rayleigh理论导出了形成黏性射流最大不稳定性的比值，即有一个最小的扰动波长
$({\rm{\lambda }}_{\rm{min}})$ 和最有可能导致射流破裂成为液滴的扰动波长$({\lambda _{\rm{opt}}})$ ，喷头出口附近的初始扰动波长小于$ {\rm{\lambda }}_{\rm{min}} $ 时，受表面张力作用，射流的扰动渐缓；当初始扰动波长大于$ {\rm{\lambda }}_{\rm{min}} $ 时，扰动波振幅增大，并最终导致射流破裂，对于非黏性流体[25]$${\lambda _{\min }} = {\text{π}} d,$$ (4) $${\lambda _{{\rm{opt}}}} = \sqrt 2{\text{π}} d,$$ (5) 对于黏性流体
$${\lambda _{\min }} = {\text{π}} d,$$ (6) $${\lambda _{{\rm{opt}}}} = \sqrt 2 {\text{π}} d{\left( {1 + \frac{{3{u_{_{\rm{l}}}}}}{{\sqrt {{\rho _{_{\rm{l}}}}{\sigma _{_{\rm{l}}}}d} }}} \right)^{{1 / 2}}},$$ (7) 式中：
${u_{_{\rm{l}}}}$ 为液体的黏度，${\rho _{_{\rm{l}}}}$ 为液体的密度，${\sigma _{_{\rm{l}}}}$ 为液体的表面张力，$d$ 为射流直径。由此可见，黏性流体的${\lambda _{\min }}$ 与非黏性流体相同，但其${\lambda _{{\rm{opt}}}}$ 却比非黏性流体大得多。试验表明，在相同的喷雾条件下，对于不同黏度的喷雾液，液体密度
${\rho _{_{\rm{l}}}}$ 、液体表面张力${\sigma _{_{\rm{l}}}}$ 、射流直径$d$ 变化不大，影响扰动波长${\lambda _{{\rm{opt}}}}$ 变化的主要因素在于喷雾液的黏度，即喷雾液黏度越大，越有可能导致射流破裂成为液滴的扰动波长${\lambda _{{\rm{opt}}}}$ 也越大，亦需要更多的能量才能完成从射流破碎成雾滴的过程。由表3可以发现，喷雾液黏度越大，相同位置处雾滴粒径随着喷雾液黏度的增加而变大，其原因可能是：喷雾液黏度越大，喷雾液越难以发生雾化，相同喷射压力下，雾化黏度大的喷雾液需要更多的能量，因此导致黏度较大的喷雾液，雾滴碎裂不够细小，最终形成颗粒较大的液滴。在轴心方向上距离喷头8~40 cm的区间内，不同轴心距离下的雾滴粒径呈现出从近喷头处到远喷头处逐渐变大的规律，其原因可能是：在喷头的轴心方向上，作用于雾滴的力主要是重力和空气阻力，当雾滴受到重力影响时，会加速下降，雾滴发生聚合碰撞，使雾滴粒径逐渐变大，形成了大雾滴。
2.2 轴心雾滴粒径的统计分析
为了明确轴心距离、液体黏度与雾滴粒径之间的内在联系，更好地揭示影响雾滴粒径分布规律的主要原因，本文运用统计分析软件SPSS对轴心距离、液体黏度以及雾滴粒径进行相关性统计分析。
通过判断2个数据集是否在一条直线上来推断2个数据集的线性相关性，其计算公式为：
$$r = \frac{{N\displaystyle\sum {{x_i}{y_i}} - \displaystyle\sum {{x_i}\displaystyle\sum {{y_i}} } }}{{\sqrt {N\displaystyle\sum {x_i^2 - {{\left(\displaystyle\sum {{x_i}} \right)}^2}} } \sqrt {N\displaystyle\sum {y_i^2 - {{\left(\displaystyle\sum {{y_i}} \right)}^2}} } }},$$ (8) 式中，N为2个数据集样本个数，xi表示x数据集中某一样本(i)的样本值，yi表示y数据集中样本i的样本值，r值反映了2个变量线性相关性的强弱程度，r值越大说明两者相关性越强，据此，利用软件做出了液体黏度、轴心距离与雾滴粒径三者之间的Pearson相关系数(表4)。
表 4 轴心雾滴粒径的Pearson相关分析Table 4. Pearson correlation analysis of axial droplet size控制变量
Control
variable参数
Parameter项目
Item轴心距离为4~40 cm
Axis distance of 4−40 cm轴心距离为0~40 cm
Axis distance of 0−40 cm轴心距离
Axis
distance液体黏度
Liquid
viscosity雾滴粒径
Droplet
size轴心距离
Axis
distance液体黏度
Liquid
viscosity雾滴粒径
Droplet
size无
None轴心距离
Axis
distance相关系数(r)1)
Correlation coefficient1.000 0.000 0.531 1.000 0.000 0.287 显著性(双侧)
Significance (bilateral)1.000 0.000 1.000 0.004 df 0 93 93 0 98 98 液体黏度
Liquid
viscosity相关系数(r)1)
Correlation coefficient0.000 1.000 0.795 0.000 1.000 0.586 显著性(双侧)
Significance (bilateral)1.000 0.000 1.000 0.000 df 93 0 93 98 0 98 雾滴粒径
Droplet
size相关系数(r)1)
Correlation coefficient0.531 0.795 1.000 0.287 0.586 1.000 显著性(双侧)
Significance (bilateral)0.000 0.000 0.004 0.000 df 93 93 0 98 98 0 雾滴粒径
Droplet
size轴心距离
Axis
distance相关系数(r)1)
Correlation coefficient1.000 −0.821 1.000 −0.217 显著性(双侧)
Significance (bilateral)0.000 0.031 df 0 93 0 97 液体黏度
Liquid
viscosity相关系数(r)1)
Correlation coefficient−0.821 1.000 −0.217 1.000 显著性(双侧)
Significance (bilateral)0.000 0.031 df 92 0 97 0 1)1.0≥r>0.8表示极强相关，0.8≥r>0.6表示强相关，0.6≥r>0.4表示中等程度相关，0.4≥r>0.2表示弱相关，0.2≥r≥0表示无相关
1)1.0≥r>0.8 indicates very strong correlation, 0.8≥r>0.6 indicates strong correlation, 0.6≥r>0.4 indicates moderate correlation, 0.4≥r>0.2 indicates weak correlation, 0.2≥r≥0 indicates no correlation从表4可以看出，当轴心距离为4~40 cm时，也就是采用样本为4~40 cm区间内雾滴粒径数据，其轴心距离、液体黏度与雾滴粒径的Pearson相关系数(r)分别为0.531、0.795，可见液体黏度与雾滴粒径之间的相关性更强，接近于极强相关，显著性值较高(当显著性值小于0.05时认为显著)，据此可得出，在距离喷嘴4~40 cm区间内，雾滴粒径的大小受到液体黏度的影响较大，同时轴心距离也是影响雾滴粒径变化的主要因素；当轴心距离为0~40 cm时，其轴心距离、液体黏度与雾滴粒径的Pearson相关系数分别为0.287、0.586，可见当计算范围包含0~4 cm区间时，液体黏度与雾滴粒径大小的相关性为中等程度相关，而轴心距离与雾滴粒径大小的相关性为弱相关，这说明雾滴粒径在区间0~4 cm与区间4~40 cm内变化趋势不统一，故而三者之间的相关性有所降低，结合表3不难发现，在雾滴粒径为0~4 cm区间内，喷雾液由喷嘴喷出后，在切应力的作用下撕裂成液膜，大雾滴变为小雾滴，这刚好与雾滴在4~40 cm区间内的变化相反，因此相关性有所降低。
综合考虑可以发现，雾滴从喷嘴喷出后液体黏度对雾滴粒径的影响大于轴心距离对雾滴粒径的影响。
2.3 径向雾滴粒径分布
为了了解不同喷雾液黏度对喷头径向雾滴参数的影响(为便于分析，取z=30 cm处分析)，绘制出如图1所示的雾滴体积平均直径D30随径向距离变化三维图。
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图 1 z=30 cm处径向雾滴体积平均直径(D30)变化Figure 1. Change of radial droplet D30 at${\textit{z}}{\bf{= 30 \;cm}}$ 由图1可以看出，在相同喷雾液黏度下，雾滴粒径随着径向距离增大而增大，轴心位置始终保持着最小的雾滴粒径，径向左右两边雾滴粒径近似于对称分布；不同喷雾液黏度下，液体黏度越大，相同位置雾滴体积平均直径越大。
奥内佐格的研究表明，射流破碎后的液滴尺寸主要取决于喷口直径、液体的密度、黏性力和表面张力，并且整理出了无因次准数Z来进行描述，Z为射流破碎后的雾滴大小的无因次准数，它与液体的密度、黏性力和表面张力间存在一定的关系[25]，如下式所示：
$$Z = \frac{{{u_{_{\rm{l}}}}}}{{\sqrt {{\rho _{\rm l}}{\sigma _{\rm l}}{d_0}} }},$$ (9) 式中：
${u}_{_{{\rm{l}}}}$ 表示液体黏度，${\rho }_{_{{\rm{l}}}}$ 表示液体密度，${\sigma }_{_{{\rm{l}}}}$ 表示表面张力，$ {d}_{0} $ 表示射流起始直径。在相同试验条件下，对于不同黏度的喷雾液，其液体密度、表面张力、射流直径变化不大，故液体的黏度是雾化过程中液体破碎的主要因素，黏性在射流表面扰动波增长的过程中起阻尼作用，黏性越小阻力越小，Z越小，故雾滴粒径越小。
2.4 径向雾滴粒径的统计分析
为了更好地阐释雾滴粒径在径向上的分布规律，明确雾滴粒径在径向上与径向距离、液体黏度之间的内在制约因素，对径向距离、雾滴粒径以及液体黏度之间进行了Pearson相关分析，结果如表5所示。
表 5 径向雾滴粒径的Pearson相关分析1)Table 5. Pearson correlation analysis of radial droplet size控制变量
Control variable参数
Parameter项目
Item径向距离
Radial distance液体黏度
Liquid viscosity雾滴粒径
Droplet size无
None径向距离
Radial distance相关系数(r)1) Correlation coefficient 1.000 0.000 0.932 显著性(双侧) Significance (bilateral) 1.000 0.000 df 0 53 53 液体黏度
Liquid viscosity相关系数(r)1) Correlation coefficient 0.000 1.000 0.328 显著性(双侧) Significance (bilateral) 1.000 0.014 df 53 0 53 雾滴粒径
Droplet size相关系数(r)1) Correlation coefficient 0.932 0.328 1.000 显著性(双侧) Significance (bilateral) 0.000 0.014 df 53 53 0 雾滴粒径
Droplet size径向距离
Radial distance相关系数(r)1) Correlation coefficient 1.000 −0.893 显著性(双侧) Significance (bilateral) 0.000 df 0 52 液体黏度
Liquid viscosity相关系数(r)1) Correlation coefficient −0.893 1.000 显著性(双侧) Significance (bilateral) 0.000 df 52 0 1)1.0≥r>0.8表示极强相关，0.8≥r>0.6表示强相关，0.6≥r>0.4表示中等程度相关，0.4≥r>0.2表示弱相关，0.2≥r≥0表示无相关
1)1.0≥r>0.8 indicates very strong correlation, 0.8≥r>0.6 indicates strong correlation, 0.6≥r>0.4 indicates moderate correlation, 0.4≥r>0.2 indicates weak correlation, 0.2≥r≥0 indicates no correlation由表5可以看出，在径向上，雾滴粒径与径向距离的相关系数为0.932，具有极强相关性，且显著性值为0.000，小于0.05，故认为雾滴粒径与径向距离之间显著性高；雾滴粒径与液体黏度的相关系数为0.328，表现为弱相关，且显著性值为0.014，小于0.05，则认为雾滴粒径与液体黏度之间联系较径向距离弱。
由表4和表5可以发现，在喷头喷雾区域中，在轴心方向上雾滴粒径分布受液体黏度影响较大，二者相关系数为0.795，同时，在轴心方向上，雾滴粒径也会受到轴心距离的影响，相关系数为0.531，较液体黏度影响相对较弱；在喷头径向上，雾滴粒径与径向距离相关系数为0.932，表现出极强相关性，意味着径向位置不同时，雾滴粒径变化明显，由图1可以看出，当径向位置变大时，雾滴粒径增加明显；在径向上，雾滴粒径与液体黏度相关系数为0.328，表现为弱相关性。
3. 结论
本文研究了不同喷雾液黏度下，喷头的喷雾区域中垂直(轴心)与水平(径向)方向上喷雾雾滴粒径变化规律，得出以下结论：
1)喷雾液黏度越大，喷头所喷出雾滴的粒径也越大。随着黏度的增大，轴心方向上的雾滴粒径先变大后变小，喷雾液黏度越大，雾滴越难以雾化；在径向上，喷雾区域的边界处雾滴粒径大于内部雾滴粒径；
2)根据Pearson相关分析得出，轴心方向上，雾滴粒径的大小分布受液体黏度影响较大，相关系数为0.795；而在径向上，雾滴粒径大小分布受到径向距离影响较大，相关系数为0.932；
3)试验分析得出添加不同浓度的甘油溶液均可对雾滴粒径产生较大影响，因此应根据喷施的实际情况选择合适的浓度配比，适当提高喷雾液黏度，有助于达到降低农药雾滴漂移、增加雾滴穿透性的目的。
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图 1 转基因阳性植株SlJAZ7相对表达量
WT：野生型；OE1、5、6、7、12、14：过表达株系；“*”“**”分别表示过表达株系与野生型在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 1. Relative expression level of SlJAZ7 in transgenic positive plants
WT: Wild type; OE1, 5, 6, 7, 12, 14: Overexpressed lines; “*” and “**” indicate signidicant differences between overexpressed lines and wild type at P < 0.05 and P < 0.01 levels (t test)
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图 2 Pst DC3000病原菌侵染野生型(WT)和过表达株系(OE)后的表型(A)及DAB染色结果(B)
Figure 2. Phenotype (A) and DAB staining results (B) after Pst DC3000 pathogens infection on wild type (WT) and overexpressed line (OE)
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图 3 Pst DC3000、MeJA和SA处理下SlTGA7 (A、B、C)和SlJAZ7 (D、E、F)的表达模式
“*”“**”分别表示其他时间点与0 h在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 3. Expression patterns of SlTGA7 (A, B, C) and SlJAZ7 (D, E, F) under Pst DC3000, MeJA and SA treatments
“*” and “**” indicate significant differences between other time points and 0 h at P < 0.05 and P < 0.01 respectively (t test)
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图 4 SlTGA7和SlJAZ7在不同器官中的表达模式
1：青熟期果实，2：绿熟期果实，3：破色期果实，4：成熟红果，5：根，6：茎，7：幼叶，8：成熟叶，9：老叶，10：未完全展开的花；“*”“**”分别表示其他器官与青熟期果实在P < 0.05、P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 4. Tissue specific expression profile of SlTGA7 and SlJAZ7
1: Fruit at cyan ripening stage, 2: Fruit at green ripening stage, 3: Fruit at green colour breaking stage, 4: Mature red fruit, 5: Root, 6: Stem, 7: Young leaf, 8: Mature leaf, 9: Old leaf, 10: Not fully unfolded flower; “*” and “**” indicate significant differences between other organs and fruits at cyan ripening stage at P < 0.05 and P < 0.01 levels respectively (t test)
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图 5 SlJAZ7过表达株系叶片中SlTGA7的表达模式
WT：野生型，OE1、5、6、7、12、14：过表达株系；“*”“**”分别表示过表达株系与野生型在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著(t检验)
Figure 5. Expression pattern of SlTGA7 in the leaves of SlJAZ7 overexpressed strains
WT: Wild type, OE1, 5, 6, 7, 12, 14: Overexpressed lines; “*” and “**” indicate signidicant differences between overexpressed lines and wild type at P < 0.05 and P < 0.01 levels (t test)
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图 6 番茄SlJAZ7和SlTGA7的亚细胞定位
Figure 6. Subcellular localization of SlJAZ7 and SlTGA7 in tomato
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图 7 Y2H试验验证番茄SlJAZ7和SlTGA7蛋白的互作关系
pGADT7-T/pGBKT7-Lam为阴性对照；pGADT7-T/pGBKT7-53为阳性对照；0、10−1、10−2、10−3表示菌液的稀释梯度
Figure 7. Interaction between SlJAZ7 and SlTGA7 proteins verified by Y2H
pGADT7-T/pGBKT7-Lam is negative control; pGADT7-T/pGBKT7-53 is positive control; 0, 10−1, 10−2, 10−3 represent the dilution gradients of bacterial solution
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图 8 BiFC验证SlJAZ7和SlTGA7蛋白的互作关系(标尺：20 μm)
Figure 8. Interaction between SlJAZ7 and SlTGA7 verified by BiFC (scale: 20 μm)
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图 9 考马斯亮蓝染色检测SlJAZ7与SlTGA7蛋白的分子量
Figure 9. Relative molecular masses of SlJAZ7 and SlTGA7 determined by Kaumas bright blue staining
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图 10 Pull down试验验证SlJAZ7与SlTGA7的互作关系
Figure 10. Interaction between SlJAZ7与SlTGA7 verified by pull down experiment
表 1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name引物序列1) (5′→3′)
Primer sequence目的
PurposeSlJAZ7-NC-F agtggtctctgtccagtcctATGGATTCAAGAATGGAGATAGATT 基因克隆 SlJAZ7-NC-R ggtctcagcagaccacaagtGTTTTCCCAATGAACGCTTGAC 基因克隆 SlJAZ7-EcoRI-F ccggaattcATGGATTCAAGAATGGAGATAGATT 互作关系验证 SlJAZ7-BamHI-R cgggatccGTTTTCCCAATGAACGCTTGAC 互作关系验证 SlTGA7-EcoRI-F ccggaattcATGAACATGAGTTCTACATCAACTC 互作关系验证 SlTGA7-BamHI-R cgggatccGGTAGGTTCACGAGGACGAG 互作关系验证 SlJAZ7-SalI-F acgcgtcgacATGGATTCAAGAATGGAGATAGATT BiFC试验 SlTGA7-SalI-F acgcgtcgacATGAACATGAGTTCTACATCAACTC BiFC试验 SlJAZ7-Q-F ATTATGCTAAAGGAGCACTTGCTAT RT-qPCR SlJAZ7-Q-R CGCTTGACGACGCCG RT-qPCR Sltublin-Q-F TTGGTTTTGCACCACTGACTTC RT-qPCR Sltublin-Q-R AAGCTCTGGCACTCTCAAAGC RT-qPCR 1)带下划线的碱基代表酶切位点序列
1) The underlined bases represent the sequences of enzyme cleavage site
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