Antifungal activity of Mikania micrantha extract against Magnaporthe oxyzae
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摘要:目的
以入侵物种薇甘菊Mikania micrantha为材料，探究其不同提取物及组分对稻瘟病菌Magnaporthe oxyzae的抑菌活性。
方法以稻瘟病菌为供试病原菌，采用生长速率法对采自云南德宏的薇甘菊提取物进行室内抑菌活性测定，并通过柱层析对提取物的抑菌活性组分进行追踪。
结果在初筛质量浓度为1 mg/mL时，薇甘菊乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌有较好的抑菌活性，抑菌率为49.84%。对薇甘菊乙酸乙酯萃取物的14个柱层析组分进行抑菌活性追踪，组分Fr5、Fr6、Fr12、Fr13抑菌效果显著，在接种后第9天的EC50分别为1.691、2.134、0.865、0.818 mg/mL；4个组分均使菌丝质量减轻，MDA含量升高，菌丝形态畸变。
结论本研究发现薇甘菊提取物对稻瘟病菌有较好的抑菌效果，为综合开发利用薇甘菊提供了新思路，也为稻瘟病菌的绿色防控提供了科学依据。
Abstract:ObjectiveMikania micrantha, an invasive species, was used as a material to investigate the antifungal activity of different extracts and components against Magnaporthe oxyzae.
MethodThe antifungal activity of M. micrantha extract from Dehong of Yunnan Province was determined by growth rate method with M. oxyzae as the test pathogen, and the antifungal active components of the extract were traced by column chromatography.
ResultAt the initial screening mass concentration of 1 mg/mL, M. micrantha ethyl acetate extract showed potent antifungal activity against M. oxyzae, with the inhibition ratio of 49.84%. The antifungal activity tracking of 14 column chromatography components of the ethyl acetate extract showed that the antifungal activities of Fr5, Fr6, Fr12 and Fr13 were significant, EC50 values on day 9 after inoculation were 1.691, 2.134, 0.865 and 0.818 mg/mL, respectively. All the four active components resulted in the reduction of mycelial mass, elevation of MDA content, aberration of mycelial morphology.
ConclusionThis study finds that M. micrantha can significantly inhibit M. oxyzae, which provides a new idea for comprehensive development and utilization of M. micrantha, and also provides a scientific basis for green control of M. oxyzae.
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Keywords:
- Plant extract /
- Magnaporthe oxyzae /
- Mikania micrantha /
- Growth rate method /
- Antifungal activity
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柚果Citrus maxima是中国传统水果，营养丰富、食味鲜美，受消费者喜爱[1-2]。对于柚果这类厚皮水果而言，体积大、皮厚、光谱透射难[3-5]，造成内部品质无损检测不准确[6]，是产业实施品质光谱无损快速分级亟需解决的问题。由于检测的光信号在柚果内部组织传输过程复杂，需进、出2次经过果皮油胞层、果皮海绵层、果肉瓣，再被传感器所接收，信噪比较低。国内外鲜有针对柚果透射光谱进行光学特性的测定、分析与优化研究。因此，通过优化柚果光谱无损检测光路实现柚果品质的准确无损检测具有重要意义。
柚果内部品质无损检测方法目前主要有高光谱成像技术、X射线成像技术、近红外光谱成像技术等，其检测光路在不同的无损检测方法上不尽相同。吴爽[7]提出基于高光谱漫透射成像的光路系统，光源从箱体两侧射入柚果后从顶部的检测孔射出，光谱信息被顶部的光谱仪接收，该方式采用12盏卤素灯构成环形光源，可以有效提升光强。张雨辰[8]利用X射线成像方法对蜜柚可食率进行无损检测的光路，预测模型准确率高，为厚皮水果内部品质无损检测提供了新思路。由于X射线成像技术成本高，主要用于获取内部结构信息，无法对重要的风味品质进行识别，无法满足产业化需要。孙潇鹏等[9]提出半透射可见/近红外光谱无损检测光路平台，光源从检测室侧上方射出光线，穿透柚果后被光谱仪接收，半透射光谱只携带了柚果部分位置的特征信息，获取的信息不如全透射全面，检测结果不够精准。总体而言，现有技术中可见/近红光谱在柚果品质无损检测中具有更好的应用前景。就光谱检测方法上而言，采用全透射光谱检测法对水果品质检测是最理想的[10-11]。
柚果品质全透射光谱无损检测在获取更丰富的内部特征信息的同时，也面临更大的信号衰减，寻找较优光路参数是解决问题的关键[12]。Fraser等[13]采用光纤探头得出柑橘内部不同组织结构对光的传播有不同的影响效果。Sun等[14]发现水果透射光谱信号强度随着光源与探测器间距减小而增大。Qin等[15]采用不同光源对苹果内部的光分布进行蒙特卡洛仿真分析，模拟光在内部组织传输过程，实现更有效的测量配置；Sun等[16]研究了2种光学几何形状，使用近红外光谱对苹果中血管褐变进行检测，发现增加光程长度可改善光空间分布小的缺陷。Gobrecht等[17]发现偏振光谱可以有效降低样本散射的影响。因此，对柚果全透射光谱无损检测光路进行全面寻优、保障内部品质无损检测精度具有重要意义。
本研究在吴爽[7]研究的基础上，通过灯珠的集成将光源中心与信号接收器中心保持在同一直线上，进而提高光能量，通过对柚果可见/近红外全透射光谱进行光路设计与光学仿真，实现光谱能量的最大化收集，提升检测信噪比与检测精度。前期试验与已有研究确定了灯珠数量、柚果与光源间距、探测器与柚果的间距会对透射光谱信息采集产生较大影响[18]。因此，以柚果为研究对象，针对上述参数进行光学特性仿真与设备搭建试验，得出一套适合于柚果内部品质可见/近红外全透射光谱无损检测的参数，并在该参数下对柚果可溶性固形物含量进行无损检测验证。
1. 柚果品质无损检测光路仿真
1.1 ZEMAX光学仿真平台搭建
ZEMAX是一款专业的光学设计软件，具有丰富的设计、分析等功能，广泛应用在光学系统参数优化领域[19]。仿真设计的柚果内部品质无损检测光路模型主要由光源间和信号采集间组成。其中光源间主要包括反光杯、卤素灯和调距台，信号采集间包括托盘、升降台、信号接收器和调距台，7颗灯珠安装在同一灯杯内，卤素灯呈圆形排布，箱体内部安装散热风扇防止温度过高损耗各个器件。其三维结构如图1a所示。工作原理为：在暗箱环境下内卤素灯发出光线穿过挡板上50 mm直径的圆孔直射柚果中部，该圆孔直径是反复调试后得到的光利用率最大且避免漏光的较优值，光线穿透柚果后由接收器将光信号采集，然后通过光纤传输至光谱仪进行分析。光线仿真传输效果如图1b所示。非序列光线追迹功能允许光线以任何次序通过光学元件，并允许光线被分裂、散射并返回已经经过的物体，所以本文光路的光学仿真在ZEMAX的非序列模式[20]下进行，选择常用的150 W灯珠(实际应用中，大于该功率使用寿命会大大衰减)及其参数(标准光通量5000 lm、灯丝长度6 mm、灯丝直径3.2 mm、灯芯高度32 mm)，灯杯采用铝杯材质并在每个面镀反光膜，灯罩采用石英玻璃材质，挡板设置为不透光材质，确保光线只能从直径50 mm圆孔中通过，接收器设置为直径13.6 mm的圆形探测器，并紧贴柚果，根据灯珠数量和光源与柚果的间距在ZEMAX导入所需要的装配体模型，使光源中心、挡板圆孔中心和柚果中心在同一直线上。在ZEMAX软件中按实际尺寸建立包含果皮油胞层、果皮海绵层、果肉瓣的柚果模型，柚果光学性能参数按照实际测量结果输入，设置波长范围400~1100 nm，非序列性光线追迹算法主要用于对各种能量传输、接收光线系统的仿真设计[21]，通过ZEMAX软件非序列光线追迹功能进行追迹，追迹108条光线，分析获得非相干照明度图(图2)。
1.2 柚果光学仿真关键参数测定
2022年9月15日从广东省梅州市梅县顺兴果园摘取25个红肉蜜柚，立即运送至广东省农业科学院开展试验，将25个柚果分离为果皮油胞层、果皮海绵层、果肉瓣。通过显微透光率检测仪(BSMT-400，百思光电，广东东莞)测出在400~1100 nm波长下各组织2层厚度(模拟光进、出2次)的透射率。由折射仪(WAY-2S，仪电物光，上海)测量各组织2层厚度的折射率。通过电子秤(HZ-C50002C，优科维特电子科技，江苏昆山)测量各组织的质量，排水法测量体积，由密度公式计算得出各组织的密度。以25个样本的平均值代表柚果各组织的光学参数。
1.3 柚果内部品质无损检测平台建模试验
将仿真设计的柚果光学检测平台(图1a)加工成型。将设备开机预热15 min。采用光谱仪(QEpro，海洋光学，美国)采集样本光谱，在采集前，采集暗电流和参考板进行光谱仪校正。柚果平躺置于托盘上，光源中心、挡板圆孔中心和柚果中心在同一直线上，设置积分时间2000 ms、每个波长测量1次、在波长400~1100 nm获取和存储光谱数据。
采集132个柚果光谱数据，并采用数字光学折射仪测定其可溶性固形物含量。其中100个柚果作为训练集，32个柚果作为测试集验证训练模型效果。光谱数据通过Savitzky-Golay(SG)平滑和标准正态变换(Standard normal variate，SNV)预处理[22]，竞争自适应重加权采样(Competitive adaptive reweighted sampling，CARS)提取特征关键波段变量，偏最小二乘回归(Partial least squares regression，PLSR)建立柚果可溶性固形物含量预测模型[23]。
2. 结果与分析
2.1 柚果关键光学仿真参数测量
由测量结果可知，果皮油胞层、果皮海绵层和果肉瓣的单边平均透射率分别为0.14、0.12和0.09，平均折射率分别为1.80、1.65和1.40，平均密度分别为1.08、0.39和0.93 g/cm3，平均厚度分别为1.00、12.00和90.00 mm。已有研究表明，柚果属于混浊介质，各层内部组织结构和成分大不相同[24]，光线穿透柚果的过程较为复杂，会发生折射、透射、散射等多种现象，柚果关键光学仿真参数包括折射率、透射率、密度和厚度[25]。
2.2 不同灯珠数量、柚果与光源间距光学仿真结果
由图3仿真结果可知，同一间距下，虽然8颗灯珠的光通量大于7、6、5、4颗灯珠的光通量，但光通量提升较少。通常相同检测环境下，光通量越强，信噪比越高[26]，因此，增加1颗灯珠不能显著增强信号强度与信噪比，灯杯内包含7颗灯珠为较优灯珠数。7颗灯珠下，柚果与光源间距1 cm时，光通量最大。由于光在传输路径中透射率逐渐减小，散射率逐渐增大[27]，导致光通量逐渐减小。本研究不考虑间距0 cm，是因为光源过热可能会烫伤水果，且难以散热存在安全隐患。因此，光源仿真的最优灯珠数量为7，柚果与光源最优间距为1 cm。
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图 3 不同灯珠数量和不同柚果与光源间距光学仿真结果Figure 3. Optical simulation results with different number of lamp beads and distance between pomelo fruit and light source2.3 不同探测器与柚果间距光学仿真结果
在波长范围400~1100 nm、7颗灯珠数量、柚果与光源间距为1 cm条件下，对探测器与柚果间距为0.5、1.5、2.5和3.5 cm柚果内部品质光谱检测光路进行光学仿真，光通量分别为142.7、82.8、48.5和30.6 lm。随着探测器与柚果间距增大，光通量减小，间距0.5 cm时，光通量最大。由于不同柚果的结构和组成特征差异导致检测位置出射光子所携带的有效信息含量不同[28]，柚果检测光强随着探测器与柚果的间距减小而增大，但需预留间距余量使得不同果形、大小的柚果都能适应该检测空间。
2.4 不同灯珠数量、柚果与光源间距试验结果
取波长范围400~1100 nm下非曝光稳定点光强的平均值，由图4试验结果可知，在柚果与光源间距1 cm时，随着灯珠数量的增加，柚果检测光强逐渐增大，8颗灯珠光强大于7、6、5、4颗灯珠光强，但是当灯珠数量从7颗增加到8颗时，光强提升相对较少。在柚果与光源间距分别为2、5、7和10 cm时灯杯内设置不同灯珠数量，试验结果与柚果与光源间距1 cm时灯杯内设置不同灯珠数量的试验结果一致。增加1颗灯珠提升的光能量不大，但是设备的发热量增高、损耗增大、经济成本增加[29]。由此试验结果可以判断7颗灯珠光源为最优选择，与仿真结果一致。在7颗灯珠条件下，随着柚果与光源间距减小，柚果检测光强增大，柚果与光源间距1 cm时光强最大，但在试验过程中，卤钨灯进行发热试验必须考虑是否会烫伤柚果[30]。根据柚果检测设备流水线通常在1 s内完成1个柚果检测，为避免样本差异，采用7灯珠光源在1 s内对同一柚果不同面进行照射试验，柚果与光源间距分别为0、1和2 cm。如图5a、5b所示，0、1 cm情况下果皮均出现损伤，0 cm果皮油胞层损伤较1 cm更严重。如图5c所示，2 cm情况下，果皮未出现损伤。如图5d所示，2 cm间距下果皮海绵层也未出现损伤，综上所述，柚果与光源间距实际应用2 cm为最优选择。由于采样时间短，为保证检测稳定性，大尺寸果在流水线上传送速度设置通常较慢，因此动态与静态检测果皮油胞层和果皮海绵层损伤结果差异较小。
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图 4 不同灯珠数量和不同柚果与光源间距试验结果Figure 4. Test results with different number of lamp beads and distance between pomelo fruit and light source![]()
图 5 柚果与光源间距试验下柚果损伤情况Figure 5. Damage of pomelo fruit under the test of distance between pomelo fruit and light source2.5 不同探测器与柚果间距试验结果
在7颗灯珠光源、柚果与光源间距为2 cm条件下，对探测器与柚果间距为0.5、1.5、2.5和3.5 cm柚果内部品质无损检测光路进行试验，波长范围400~1100 nm下检测非曝光稳定点光强的平均值，光强分别为1664.1、1353.2、971.2和417.3 cd。柚果检测光强随着探测器与柚果的间距减小而增大，间距0.5 cm时光强最大。
2.6 最优参数下柚果糖度无损检测效果
在400~1100 nm光谱较优光路参数下对柚果糖度进行无损检测与建模。柚果光谱数据采用SG平滑消除光谱信号中的随机噪声，提高信噪比[31]，SNV去除柚果内部固体颗粒大小和分布不一产生的散射影响[32]，CARS筛出关键变量，减少无关变量[33]，PLSR建立柚果糖度模型，结果如图6所示。经过反复的模型训练，PLSR主成分因子为22，训练集R2和RMSE为0.81和0.85，测试集R2和RMSE为0.81和0.89，拟合程度高，能较好地无损识别柚果糖度。
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图 6 CARS-PLSR模型下柚果糖度测试值和预测值的散点图Figure 6. Scatterplot of measured and predicted fructose contents in pomelo fruit under CARS-PLSR model3. 结论
1)明确了果皮油胞层、果皮海绵层、果肉瓣的单边平均透射率分别为0.14、0.12和0.09，平均折射率分别为1.80、1.65和1.40，平均密度分别为1.08、0.39和0.93 g/cm3，平均厚度分别为1.00、12.00和90.00 mm。
2) 在ZEMAX软件下建立了柚果内部组织光学特性对光路的影响的仿真模型，并通过实物装置搭建进行测试与验证，结果表明该光路最优灯珠数量为7、最优柚果与光源间距为2 cm，最优探测器与柚果间距为0.5 cm。
3)通过采集132个柚果光谱数据与可溶性固形物含量，进行训练建模和测试验证，训练集R2和RMSE分别为0.81和0.85，测试集R2和RMSE分别为0.81和0.89。结果表明该柚果内部品质光谱无损检测光路具有较好的效果。
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图 1 培养第9天薇甘菊不同萃取物对稻瘟病菌的抑菌效果
Figure 1. Antifungal effect of different Mikania micrantha extracts against Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture
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图 2 不同培养天数时不同质量浓度Fr5、Fr6、Fr12、Fr13对稻瘟病菌的抑菌活性
各小图中相同质量浓度柱子上方的不同小写字母表示不同培养天数间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。
Figure 2. Antifungal activity of different mass concentrations of Fr5, Fr6, Fr12 and Fr13 against Magnaporthe oxyzae on different cultivation days
Different lowercase letters on the columns of the same mass concentration in each graph indicate significant differences among different cultivation days at P<0.05 (Duncan’s method).
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图 3 培养第9天不同质量浓度Fr5、Fr6、Fr12、Fr13对稻瘟病菌的抑菌效果
Figure 3. Antifungal effect of different mass concentrations of Fr5, Fr6, Fr12, Fr13 aganist Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture
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图 4 4个组分对稻瘟病菌菌丝MDA含量的影响
柱子上方的不同小写字母表示不同组分间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。
Figure 4. Effect of four components on MDA content of Magnaporthe oxyzae mycelia
Different lowercase letters on the columns indicate significant differences among different components at P<0.05 (Duncan’s method).
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图 5 4个组分对稻瘟病菌菌丝形态的影响
Figure 5. Effect of four components on morphology of Magnaporthe oxyzae mycelia
表 1 培养第9天薇甘菊不同萃取物对稻瘟病菌的抑菌活性
Table 1 Antifungal activity of different Mikania micrantha extracts against Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture
萃取物
Extract抑菌率1)/%
Inhibition ratio95%置信区间
95% Confidence interval阳性对照 Positive control 55.24±0.55a 52.88~57.60 乙酸乙酯 Ethyl acetate 49.84±0.21b 48.93~50.75 正丁醇 l-Butanol 35.95±0.27c 34.77~37.13 石油醚 Petroleum ether 17.54±0.21d 16.63~18.45 1)抑菌率数据后的不同小写字母表示不同萃取物间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。
1) Different lowercase letters after the inhibition ratio data indicate significant differences among different extracts at P<0.05 (Duncan’s method).
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表 2 培养第9天薇甘菊乙酸乙酯萃取物14个组分对稻瘟病菌的抑菌活性1)
Table 2 Antifungal activity of 14 components of Mikania micrantha ethyl acetate extract against Magnaporthe oxyzae at the 9th day of culture
组分
Component菌落直径/mm
Colony diameter抑菌率/%
Inhibition ratio组分
Component菌落直径/mm
Colony diameter抑菌率/%
Inhibition ratio空白对照 Blank control 50.00±0.00a 0.00±0.00n Fr8 36.30±0.12fg 13.57±0.27j Fr1 39.63±0.09c 5.63±0.21l Fr9 34.67±0.26i 17.45±0.62f Fr2 38.87±0.03d 7.46±0.08k Fr10 27.17±0.18j 35.31±0.42e Fr3 40.30±0.12b 4.05±0.27m Fr11 35.57±0.24h 15.32±0.57h Fr4 37.37±0.22e 15.48±0.27g Fr12 24.73±0.12k 41.11±0.29d Fr5 21.27±0.15m 49.37±0.35b Fr13 20.77±0.18n 50.55±0.42a Fr6 23.80±0.17l 43.33±0.41c Fr14 36.23±0.09g 13.73±0.21i Fr7 36.73±0.12f 12.54±0.29i 1)同列数据后的不同小写字母表示不同组分间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。
1) Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different components at P<0.05 (Duncan’s method).
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表 3 不同培养天数4个组分对稻瘟病菌的抑菌毒力
Table 3 Antifungal virulence of four components against Magnaporthe oxyzae on different cultivation days
组分
Componentt培养/d
Cultivation days毒力回归方程1)
Toxicity regression equationR2 EC50/(mg·mL−1) Fr5 3 y=3.397x−0.912 0.999 1.856 5 y=5.055x−0.782 0.982 1.428 7 y=4.136x−0.661 0.985 1.445 9 y=6.339x−1.446 0.990 1.691 Fr6 3 y=4.587x−0.889 0.974 1.563 5 y=5.565x−1.483 0.978 1.847 7 y=6.351x−1.691 0.991 1.846 9 y=7.652x−2.519 0.990 2.134 Fr12 3 y=2.064x+0.994 0.963 0.330 5 y=2.338x+0.582 0.965 0.564 7 y=3.272x+0.647 0.983 0.634 9 y=3.031x+0.191 0.964 0.865 Fr13 3 y=3.461x+1.858 0.992 0.290 5 y=2.182x+1.135 0.968 0.302 7 y=2.137x+0.774 0.966 0.434 9 y=2.683x+0.234 0.981 0.818 1) x：质量浓度对数，y：抑菌率对应的几率。
1) x: Logarithm of mass concentration, y: Corresponding odds of the inhibition ratio.
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表 4 4种组分处理后稻瘟病菌菌丝干质量
Table 4 Dry mass of Magnaporthe oxyzae mycelia after treatment of four components
组分
Component干质量1)/g
Dry mass95%置信区间
95% Confidence interval空白对照 Blank control 0.209 4±0.003 9a 0.192 8~0.226 1 Fr5 0.040 0±0.000 6b 0.037 2~0.042 8 Fr6 0.037 7±0.000 4b 0.035 9~0.039 4 Fr12 0.027 7±0.000 9c 0.023 9~0.031 4 Fr13 0.018 9±0.000 4d 0.017 4~0.020 5 1)干质量数据后的不同小写字母表示不同组分间在P<0.05水平差异显著(Duncan’s法)。
1) Different lowercase letters after the dry mass data indicate significant differences among different components at P<0.05 (Duncan’s method).
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