Bioinformatics analysis and prokaryotic expression of apical membrane antigen protein AMA1 of Isospora suis
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摘要:目的
预测分析猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物学特性、结构及功能，并构建AMA1基因的原核表达载体，表达、纯化AMA1蛋白。
方法本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列，使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行分析。构建原核表达载体pET23a-AMA1，并将其转入至大肠埃希菌表达菌株BL21 (DE3)中，对诱导时间、温度及IPTG浓度进行优化，确定最佳诱导表达条件。采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化，获得AMA1重组蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。
结果生物信息学预测显示，AMA1蛋白由317个氨基酸组成，蛋白分子式为C1512H2310N394O490S14，是不稳定的亲水性蛋白；其二级结构α螺旋占17.74%，β折叠占30.65%，转角占30.65%，无规则卷曲占20.96%；属于无信号肽的跨膜蛋白，具有5个B细胞抗原表位。成功构建pET23a-AMA1重组表达质粒，经诱导表达条件优化后，确定最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG浓度下于28 ℃诱导12 h，主要以可溶性蛋白形式存在，蛋白相对分子质量约为25 800，纯化蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。
结论阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征，通过原核诱导表达获得了重组蛋白，为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础，并为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。
Abstract:ObjectiveTo predict and analyze the biological characteristics, structure and function of the apical membrane antigen 1 (AMA1) in Isospora suis, as well as construct the prokaryotic expression vector of AMA1 gene to express and purify AMA1 protein.
MethodThe AMA1 gene sequence of I. suis was obtained from NCBI database, and the protein encoded by AMA1 gene was analyzed using relevant bioinformatics prediction tools. The recombinant prokaryotic expression vector pET23a-AMA1 was constructed and transferred into the expression strain BL21 (DE3) of Escherichia coli. The induction time, temperature and IPTG concentration were optimized to determine the optimal induction expression conditions. The recombinant AMA1 protein was purified by nickel column affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and Western blot.
ResultBioinformatics prediction showed that AMA1 protein was composed of 317 amino acids, and its molecular formula was C1512H2310N394O490S14, which was an unstable hydrophilic protein. The secondary structure prediction of the AMA1 protein yielded a profile consisting of 17.74% α helix, 30.65% β folding, 30.65% rotation, and 20.96% random coil. It was a transmembrane protein without signal peptide and had five B cell epitopes. At the same time, pET23a-AMA1 recombinant expression plasmid was successfully constructed, and the optimal induction expression condition was 0.2 mmol/L IPTG inducing for 12 h at 28 ℃, which mainly existed in the form of soluble protein. The relative molecular mass of recombinant protein was about 25 800, and the mass concentration of purified protein was 0.25 mg/mL.
ConclusionThe results of this study elucidate the structural characteristics of AMA1 protein of I. suis and the recombinant protein is obtained through prokaryotic induction expression, which lays a foundation for the establishment of immunological diagnosis of I. suis and provides a new candidate gene for the development of subsequent vaccines.
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Keywords:
- Isospora suis /
- Apical membrane antigen /
- AMA1 /
- Prokaryotic expression /
- Bioinformatics
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猪等孢球虫Isospora suis属于等孢属球虫，主要寄生于猪的空肠和回肠，是猪球虫中致病力最强的虫种，主要危害7~15日龄仔猪，是哺乳期仔猪患球虫病的主要病原。仔猪感染猪等孢球虫会导致肠黏膜损伤，引起厌食、腹泻、体瘦甚至死亡等严重症状。猪等孢球虫病已经成为生猪养殖行业内一种常见的寄生虫病，在国内外均广泛流行，感染率5%~100%，且呈逐年上升趋势[1-2]。此外，感染球虫的仔猪因肠道黏膜屏障被破坏，而仔猪自身免疫力又尚未完全建立，此时易继发其他细菌性或病毒性的肠道疾病，严重损害猪场的经济效益[3]。
对病原的组学研究将有助于发掘和阐明病原的重要功能基因，并建立相应的诊断方法以及制定疾病防控措施。近年来，随着高通量测序技术的不断发展，研究者开始从生物的基因组、转录组以及蛋白质组寻找更优质的抗原基因。2017年，利用新一代测序技术，获得了猪等孢球虫全基因组序列(≈84 Mb)，同时对11 000多个蛋白质编码基因进行人工修饰注释，并筛选出1 168个疫苗候选基因，其中69%的基因的功能是未知的[4]。2020年，杨守深等[5]运用iTRAQ技术，并结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析比较了猪等孢球虫孢子化卵囊与未孢子化卵囊之间差异表达的蛋白质，为阐明猪等孢球虫孢子化发育机制以及发现新的生物标志物提供了参考。
顶膜抗原(Apical membrane antigen，AMA)是一类由微线体分泌、在顶复门寄生虫中高度保守的跨膜蛋白，其中AMA1是虫体入侵宿主细胞的移动连接(Moving junction，MJ)复合体的重要组成部分。MJ复合体是一种电子致密的环状结构，形成于活动的寄生虫顶端的质膜和目标宿主细胞之间[6]。在早期对疟原虫[7]和刚地弓形虫[8]的研究中，表明了AMA1基因在寄生虫入侵宿主细胞过程中起关键作用，在刚地弓形虫中，其部分敲除导致寄生虫侵入宿主细胞的能力下降了83%，显著降低了寄生虫的侵袭性[9]。在对鸡球虫AMA1蛋白的研究中，发现基于巨型艾美耳球虫AMA1重组蛋白的亚单位疫苗能够提供部分免疫保护力[10]；同样，以柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白构建的2种真核表达质粒对柔嫩艾美耳球虫感染也有一定的免疫保护力[11]。
然而，相比疟原虫、弓形虫和鸡球虫，对猪等孢球虫AMA1的研究非常有限。因此，解析AMA1在猪等孢球虫感染中的作用，对今后研究猪等孢球虫入侵宿主细胞的机制有着重要的意义。本研究从NCBI数据库收录的猪等孢球虫基因组contig_6458重叠群中获得AMA1基因序列，并进一步对AMA1基因编码的蛋白进行生物信息学分析，了解其结构特征和功能，通过原核诱导表达和纯化获得重组AMA1蛋白，为猪等孢球虫病诊断方法的建立和疫苗的研发提供新的候选基因和参考资料。
1. 材料与方法
1.1 菌株和质粒
pET-23a(+)表达质粒由佛山市正典生物技术有限公司保存和提供，大肠埃希菌Escherichia coli DH5α、BL21感受态细胞均购自广州擎科生物技术有限公司。基因序列引物合成、测序均由北京六合华大基因科技有限公司完成。
1.2 主要试剂及仪器
2× Phanta® Flash Master Mix购自诺唯赞生物技术有限公司，DNA限制性内切酶、蛋白marker购自Thermo Fisher公司，氨苄青霉素、IPTG购自广州健阳生物科技有限公司，PAGE凝胶快速制备试剂盒购自广州先度生物科技有限公司，Anti-His Mouse、HRP羊抗鼠IgG二抗购自北京全式金生物技术有限公司，考马斯亮蓝超速染色液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；恒温培养箱购于上海一恒科学仪器有限公司，全温振荡培养箱购于上海知楚仪器有限公司，超声波细胞破碎仪购于宁波新芝生物科技股份有限公司，电泳仪、水平/垂直电泳槽、转印槽均购于Bio-Rad公司，全自动化学发光图像分析系统购于上海天能科技有限公司。
1.3 AMA1蛋白生物信息学分析
NCBI数据库猪等孢球虫基因组contig_6458重叠群(GenBank：MIGC01006447.1)中，AMA1基因位置为35 814—38 425 bp，编码蛋白的登录号为PHJ16215.1。使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析AMA1蛋白的理化性质，利用NCBI中BLASTP程序对AMA1蛋白进行序列相似性检索；使用SignalP-5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)和TMHMM2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白的信号肽和跨膜结构域；使用DNAstar7.1 protean和Swiss-model (https://swissmodel.expasy.org/)软件预测蛋白的二、三级结构；使用DNAstar7.1 protean和IEDB (http://tools.immuneepitope.org/bcell/)软件对蛋白的优势B细胞抗原表位进行预测分析；使用NetPhos3.1 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)和NetNGlyc1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)对蛋白的磷酸化和N−糖基化位点进行预测分析。
1.4 AMA1基因片段的获得
经生物信息学分析选取主要抗原片段交由无锡傲锐东源生物科技有限公司(OriGene)进行密码子优化及基因合成。根据优化后AMA1基因碱基序列，设计AMA1基因片段引物为AMA1-F：5′-GCCATATGCACCATCATCATCATCACAATGAAG-3′，AMA1-R：5′-CGACGCGTTTAGCCGGTATTGCTGCCG-3′(下划线处分别为Nde I和Mlu I酶切位点)。使用2× Phanta® Flash Master Mix和AMA1-F/AMA1-R引物，以公司合成的AMA1基因克隆质粒为模板，PCR扩增获得AMA1片段，将鉴定正确的扩增产物进行胶回收纯化。
1.5 重组表达质粒的构建及鉴定
AMA1基因和pET-23a(+)质粒经双酶切后，通过T4连接酶进行连接得到重组质粒pET23a-AMA1。将pET23a-AMA1转化至E. coli DH5α感受态细胞，经过含有Amp＋抗性的LB琼脂板筛选后，挑取阳性克隆摇菌并提取质粒，进行PCR鉴定、Nde I和Mlu I双酶切鉴定和Nde I单酶切鉴定，取鉴定正确的重组质粒进行测序。将序列鉴定正确的重组阳性质粒转入E. coli BL21 (DE3)感受态中，并均匀涂至含有Amp＋抗性的LB琼脂板上，37 ℃倒置过夜培养，挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基，并以其为模板，以AMA1-F/AMA1-R为引物进行PCR鉴定，并制作甘油菌保存于−80 ℃。
1.6 重组蛋白的诱导表达及条件优化
分别挑取12个单克隆菌落，分别接种到5 mL含有Amp+抗性的LB液体培养基，37 ℃、220 r/min振摇至D600 nm为0.6~0.8。分为3组，每4管为1组，各管均加入0.5 mmol/L IPTG，第1~3组分别置于18、28和37 ℃条件下，均分别诱导培养4、8、12和16 h。通过SDS-PAGE检测在不同诱导条件下目的蛋白的表达情况，并使用ImageJ软件量化SDS-PAGE条带灰度值，以确定最佳诱导温度和时间。最后，以最佳诱导温度和时间优化诱导剂IPTG的浓度，IPTG浓度分别设为0、0.2、0.5、0.8和1.0 mmol/L。
1.7 重组蛋白的大量表达及纯化
以最佳诱导条件进行1 L菌液的IPTG诱导。诱导结束后，将菌液于4 ℃、6 000 r/min离心15 min，收集菌体，并用20 mL 0 mmol/L咪唑溶液重悬，使用超声波细胞粉碎机裂解菌体。于4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取上清液，用0.45 μm过滤器过滤后，使用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化。通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白质的纯度，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白浓度。
2. 结果与分析
2.1 AMA1生物信息学分析
2.1.1 AMA1蛋白理化性质及相似性分析
一级结构预测结果显示：AMA1蛋白由317个氨基酸组成，其中强碱性(+)氨基酸(K、R)有26个，强酸性(−)氨基酸(D、E)有51个；蛋白分子式为C1512H2310N394O490S14；理论等电点(pI)为4.39；平均亲水系数(GRAVY)为−0.431，属于亲水性蛋白；不稳定指数为50.11，大于40，蛋白不稳定。与犬新孢子虫、刚地弓形虫、贝氏贝诺孢子虫、堆型艾美耳球虫中的AMA1蛋白氨基酸序列分别具有56.29%、55.66%、53.14%、34.58%的相似性。
2.1.2 AMA1蛋白信号肽和跨膜结构域预测分析
采用SignalP-5.0对AMA1蛋白进行信号肽预测，结果显示AMA1蛋白N端无信号肽序列(图1)；TMHMM 2.0预测结果显示，在第231—253位氨基酸位置有1个跨膜结构域(图2)，属于无信号肽的跨膜蛋白。
2.1.3 二、三级结构预测
二级结构预测结果显示：该蛋白共含有11个α螺旋(Alpha)，占17.74%；19个β折叠(Beta)，占30.65%；19个转角(Turn)，占30.65%；13个无规则卷曲(Coil)，占20.96% (图3)。其中，无规则卷曲含量较高，蛋白容易与抗体结合，从而发挥抗原作用。经Swiss-model同源建模法分析其三级结构如图4所示，β折叠和转角含量较高，与二级结构预测相符。
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图 4 同源建模法分析AMA1蛋白三级结构Figure 4. Tertiary structure analysis of AMA1 protein by homologous modeling2.1.4 AMA1蛋白B细胞抗原表位预测
通过IEDB软件预测，AMA1蛋白具有6个B细胞抗原表位(阈值设定为0.5，>0.5表示具有潜在的B细胞抗原表位)，分别位于第12—26、28、42—82、91—132、136—225、256—307位氨基酸之间(图5)。经DNAStar Protean软件预测分析，AMA1蛋白有多个蛋白骨架柔韧性较高的区域，且在蛋白骨架两侧有多个亲水性区域，氨基酸最可能呈现在蛋白表面的区域也主要富集在蛋白两侧，同时含有多个抗原指数较高的区域，通过对柔韧性、亲水性、表面可及性以及α螺旋和β折叠结构较少、转角和无规则卷曲较多等因素综合分析，预测B细胞抗原表位可能在12—15、73—75、136—139、171—173、263—264位氨基酸上(图6)，并且这5个抗原表位均在IEDB预测结果内，可能是AMA1蛋白的优势B细胞抗原表位。
2.1.5 AMA1蛋白磷酸化和糖基化位点预测分析
分别使用NetPhos3.1和NetNGlyc1.0在线软件预测AMA1蛋白的磷酸化和N−糖基化位点，预测结果显示，AMA1蛋白含有20个丝氨酸、4个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点(图7)，无糖基化位点。
综合AMA1蛋白生物信息学分析结果，去跨膜区后选取Met1—Gly230，此部分包含4个主要的B细胞抗原表位，在N端加6× His标签，采用大肠埃希菌表达系统进行重组表达。
2.2 AMA1基因片段的扩增及重组表达质粒的鉴定
经过PCR扩增出1条723 bp左右的单一条带，与预期片段大小一致(图8)。重组质粒pET23a-AMA1经Nde I和Mlu I双酶切后，得到1条3 599 bp的载体条带和1条723 bp的目的条带，经Nde I单酶切后得到4 322 bp的条带(图9)。使用AMA1-F/AMA1-R引物对阳性克隆菌落进行PCR鉴定，结果显示，在约700 bp处得到特异性目的条带(图10)。通过单酶切、双酶切和菌落PCR鉴定，表明重组质粒构建成功。
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图 8 AMA1基因PCR产物电泳图M：DNA marker DL2000；1、2为AMA1基因扩增产物Figure 8. Electrophoresis of PCR product of AMA1 geneM: DNA marker DL2000; 1 and 2 were amplified products of AMA1 gene![]()
图 9 重组质粒pET23a-AMA1酶切鉴定M：DNA marker DL5000；1：Nde I和Mlu I双酶切pET23a-AMA1，2：Nde I单酶切pET23a-AMA1Figure 9. Digestion identification of recombinant plasmid pET23a-AMA1M: DNA marker DL5000; 1: pET23a-AMA1 was digested by Nde I and Mlu I, 2: pET23a-AMA1 was digested by Nde I![]()
图 10 重组质粒pET23a-AMA1阳性菌PCR鉴定M：DNA marker DL2000；1~10均为Amp＋抗性平板上单克隆菌落Figure 10. PCR identification of positive bacterium of recombinant plasmid pET23a-AMA1M: DNA marker DL2000; 1−10 were monoclonal colonies on Amp+ resistant plates2.3 重组蛋白诱导表达条件的优化
不同诱导条件下，AMA1重组蛋白表达产物的SDS-PAGE结果如图11~12所示。3个诱导温度对比来看，在37 ℃诱导条件下，目的蛋白表达量更高，且可溶性蛋白较多；4个诱导时间对比来看，随着诱导时间的延长，目的蛋白表达量并不是一直在升高。在3个诱导温度中，均显示在诱导时间为12 h时，蛋白表达量更高，且在上清液中表达。在18、28和37 ℃诱导培养12 h上清液中，使用ImageJ软件测定目的蛋白灰度值与总灰度值占比，分别为35.17%、46.03%和45.14%，由此确定AMA1重组蛋白最佳可溶性表达条件为28 ℃诱导12 h。在此条件下，对IPTG浓度进行了优化，结果显示，当IPTG浓度为0.2 mmol/L时目的蛋白条带灰度值最高，因此最佳IPTG浓度为0.2 mmol/L。
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图 11 18、28、37 ℃诱导不同时间结果各小图中，Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1、3、5、7分别为诱导4、8、12、16 h上清液，2、4、6、8分别为诱导4、8、12、16 h沉淀Figure 11. Result of different induction time under 18, 28, 37 ℃In each figure, Mr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1, 3, 5, 7 were induced supernatant, and 2, 4, 6, 8 were induced precipitation respectively for 4, 8, 12, 16 h![]()
图 12 不同IPTG浓度诱导结果Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1~5分别为0、0.2、0.5、0.8和1.0 mmol/L IPTG诱导上清液，6~10分别为诱导沉淀Figure 12. Induction result of different IPTG concentrationsMr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1−5 were induced supernatant and 6−10 were induced precipitation respectively by 0, 0.2, 0.5, 0.8 and 1.0 mmol/L IPTG2.4 重组蛋白的大量表达及纯化
按照最佳可溶性表达条件进行重组蛋白的大量表达，采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白AMA1，收集不同浓度梯度的咪唑洗脱液并进行SDS-PAGE鉴定，结果显示：该蛋白主要在200 mmol/L咪唑浓度下被大量洗脱下来，且无其他杂蛋白(图13)。通过对200 mmol/L咪唑洗脱液中的目的蛋白进行Wstern blot鉴定，结果显示，AMA1蛋白与抗His标签的单克隆抗体发生特异性反应(图14)，表明AMA1重组蛋白纯化成功。
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图 13 不同浓度梯度的咪唑洗脱液的SDS-PAGE鉴定Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1~6分别为20、50、100、150、200和250 mmol/L咪唑洗脱液Figure 13. Identification of imidazole eluents with different concentration gradients by SDS-PAGEMr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1−6 were 20, 50, 100, 150, 200 and 250 mmol/L imidazole eluents, respectively![]()
图 14 纯化重组AMA1蛋白的Western blot鉴定分析Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1：全菌蛋白；2：200 mmol/L咪唑洗脱液Figure 14. Identification of purified recombinant AMA1 protein by Western blotMr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1: Whole bacterial protein; 2: 200 mmol/L imidazole eluent根据BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明，绘制蛋白标准曲线：y = 0.654 7x + 0.115 5，测定AMA1重组蛋白D562 nm，代入公式中y值，得到AMA1蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。BSA-BCA法测定的蛋白标准曲线见图15。
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图 15 BSA-BCA法蛋白浓度标准曲线Figure 15. Standard curve of protein concentration by BSA-BCA method3. 讨论与结论
目前，仍未开发出针对猪等孢球虫病免疫学上的检测方法和疫苗，不利于猪等孢球虫病的防控。而筛选出结构稳定、免疫原性强的抗原蛋白，是建立免疫学检测方法及疫苗研发的关键。在对疟原虫[7]、弓形虫[9]和巴贝斯虫[12]等顶复门原虫的研究中，发现AMA1蛋白具有作为诊断标识、药物靶点和疫苗候选抗原的潜力。
猪等孢球虫AMA1蛋白生物信息学显示，AMA1蛋白属于亲水性蛋白，但不稳定系数为50.11(>40)，属于不稳定蛋白，与犬新孢子虫、刚地弓形虫、贝氏贝诺孢子虫亲缘性较近，与艾美耳球虫亲缘关系较远。AMA1蛋白二级结构具有较多易发生扭曲、盘旋及折叠的转角和无规则卷曲，这些结构常位于蛋白表面，这些区域极有可能作为一种抗原表位发挥抗原作用。此外，IEDB软件预测AMA1蛋白具有5个B细胞抗原表位，结合蛋白质二级结构特点，我们认为猪等孢球虫AMA1蛋白的B细胞抗原表位可能在12—15、73—75、136—139、171—173、263—264位氨基酸，这些肽段具有较高的柔韧性、亲水性及表面可及性，更利于蛋白与抗体嵌合[13]，表明AMA1蛋白可能具有较强的免疫原性，有望成为猪等孢球虫疫苗的靶点。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制，AMA1蛋白预测到多个磷酸化位点，可能介导宿主细胞间的信号转导通路过程，调节其磷酸化状态[14]。
此外，本研究对AMA1基因进行原核表达，成功构建了重组阳性质粒，为提高AMA1重组蛋白的表达量，对诱导温度、时间及诱导剂浓度进行了优化，结果发现：在诱导温度为37 ℃时，AMA1可溶性蛋白和包涵体蛋白均较多，可能是由于在大肠埃希菌最适生长温度下，产生的菌量较高；在一定范围内，AMA1蛋白表达量随诱导时间的延长而升高，在12 h诱导时间下，3个温度下的可溶性蛋白均表达较高，在16 h时呈下降趋势。通过对比灰度值，发现在28 ℃诱导12 h的条件下，蛋白可溶性较高，在此条件下，对IPTG浓度进行优化发现，最佳IPTG浓度为0.2 mmol/L，在最佳诱导条件下纯化获得AMA1重组蛋白，可作为建立免疫学诊断方法和疫苗研制的潜在抗原[15]。目前，对其他顶复门原虫AMA1蛋白的研究较多，发现其与虫体入侵宿主细胞有关，但对于AMA1在猪等孢球虫感染过程中发挥的作用尚不明确，仍需进一步研究。本研究结果阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征以及通过原核诱导表达获得了重组蛋白，为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础，为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。
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图 4 同源建模法分析AMA1蛋白三级结构
Figure 4. Tertiary structure analysis of AMA1 protein by homologous modeling
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图 8 AMA1基因PCR产物电泳图
M：DNA marker DL2000；1、2为AMA1基因扩增产物
Figure 8. Electrophoresis of PCR product of AMA1 gene
M: DNA marker DL2000; 1 and 2 were amplified products of AMA1 gene
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图 9 重组质粒pET23a-AMA1酶切鉴定
M：DNA marker DL5000；1：Nde I和Mlu I双酶切pET23a-AMA1，2：Nde I单酶切pET23a-AMA1
Figure 9. Digestion identification of recombinant plasmid pET23a-AMA1
M: DNA marker DL5000; 1: pET23a-AMA1 was digested by Nde I and Mlu I, 2: pET23a-AMA1 was digested by Nde I
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图 10 重组质粒pET23a-AMA1阳性菌PCR鉴定
M：DNA marker DL2000；1~10均为Amp＋抗性平板上单克隆菌落
Figure 10. PCR identification of positive bacterium of recombinant plasmid pET23a-AMA1
M: DNA marker DL2000; 1−10 were monoclonal colonies on Amp+ resistant plates
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图 11 18、28、37 ℃诱导不同时间结果
各小图中，Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1、3、5、7分别为诱导4、8、12、16 h上清液，2、4、6、8分别为诱导4、8、12、16 h沉淀
Figure 11. Result of different induction time under 18, 28, 37 ℃
In each figure, Mr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1, 3, 5, 7 were induced supernatant, and 2, 4, 6, 8 were induced precipitation respectively for 4, 8, 12, 16 h
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图 12 不同IPTG浓度诱导结果
Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1~5分别为0、0.2、0.5、0.8和1.0 mmol/L IPTG诱导上清液，6~10分别为诱导沉淀
Figure 12. Induction result of different IPTG concentrations
Mr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1−5 were induced supernatant and 6−10 were induced precipitation respectively by 0, 0.2, 0.5, 0.8 and 1.0 mmol/L IPTG
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图 13 不同浓度梯度的咪唑洗脱液的SDS-PAGE鉴定
Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1~6分别为20、50、100、150、200和250 mmol/L咪唑洗脱液
Figure 13. Identification of imidazole eluents with different concentration gradients by SDS-PAGE
Mr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1−6 were 20, 50, 100, 150, 200 and 250 mmol/L imidazole eluents, respectively
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图 14 纯化重组AMA1蛋白的Western blot鉴定分析
Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1：全菌蛋白；2：200 mmol/L咪唑洗脱液
Figure 14. Identification of purified recombinant AMA1 protein by Western blot
Mr: Relative molecular mass; M: Protein marker; 1: Whole bacterial protein; 2: 200 mmol/L imidazole eluent
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