Finite element analysis of mechanical collision damage during precision seeding of cassava seed stems
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摘要:目的
明确木薯种茎在播种过程中的碰撞损伤机制，寻求较小损伤的播种方式。
方法利用三维扫描技术逆向建立木薯种茎的三维模型，通过基于Hyper Mesh和LS-DYNA的种茎碰撞有限元分析，研究播种性能的主要影响因素(跌落高度、振动板安装倾斜角度及振动板振动频率)下种茎碰撞损伤过程，明确不同试验因素水平下种茎种芽−播种部件斜面接触等效应力、种芽−茎秆交接处等效应力、种芽−茎秆交接处应变及种芽−播种部件斜面接触应变变化规律；在单因素试验基础上，通过二次旋转正交组合试验研究，结合非线性多目标优化计算方法，对影响因素进行优化，以验证所建立回归模型的合理性。
结果当跌落高度为167.83 mm、振动板安装倾斜角度为22.18°、振动频率为66.96 Hz时，种芽−播种部件斜面接触等效应力为32.64 MPa、种芽−茎秆交接处等效应力为17.08 MPa、种芽−茎秆交接处应变为0.094、种芽−播种部件斜面接触应变为1.049，模型预测结果与实际仿真结果相近，证明了回归模型的可靠性。
结论本研究结果为揭示木薯种茎碰撞机制及播种装置优化等提供了理论依据。
Abstract:ObjectiveTo clarify the collision damage mechanism of cassava seed stems during the seeding process and seek a seeding method with less damage.
MethodUsing 3D scanning technology to reversely establish a 3D model of cassava seed stem, and through finite element analysis of seed stem collision based on Hyper Mesh and LS-DYNA, the main influencing factors of seeding performance (drop height, installation inclination angle of vibration plate, and vibration frequency of vibration plate) were studied to investigate the process of seed stem collision damage. The variation law of the equivalent stress of the contact between the seed stem bud and the sowing component slope, the equivalent stress at the junction of seed bud and stalk, the strain at the junction of seed bud and stalk, and the strain of seed bud and sowing components slope contact at different experimental factor levels were clarified. On the basis of single factor experiments, a quadratic rotation orthogonal combination experiment was conducted to study the influencing factors, combined with nonlinear multi-objective optimization calculation methods, in order to verify the rationality of the established regression model.
ResultWhen the drop height was 167.83 mm, the installation inclination angle of the vibration plate was 22.18°, and the vibration frequency was 66.96 Hz, the equivalent stress of the oblique contact between the seed bud and the sowing component was 32.64 MPa, the equivalent stress of the intersection between the seed bud and the stalk was 17.08 MPa, the strain of the intersection between the seed bud and the stalk was 0.094, and the oblique contact strain of the seed bud and the sowing component was 1.049. The predicted results of the model were similar to the actual simulation results, proving the reliability of the regression model.
ConclusionThe results provide a theoretical basis for revealing the collision mechanism of cassava seed stems and optimizing the seeding device.
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Keywords:
- Cassava /
- Seed stem /
- Collision damage /
- Finite element analysis /
- Seeder /
- Numerical simulation
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木薯Manihot esculenta Crantz起源于南美洲[1]，是全球第六大粮食作物，具有很高的经济价值和产量潜力[2]；同时也是一种多用途作物，可用于食品加工和工业原料。随着世界人口不断增长，人们对粮食的需求量急剧增加[3]，提高粮食作物产量尤为重要。近年来受多种因素影响，气候变化对作物生产力的影响越来越大[4]。极端温度、干旱和土壤盐碱化是植物经常遇到的不利环境条件[5-6]，对植物分子、生化生理、形态建成等产生严重影响，从而影响作物的生长发育以及产量的形成[7]。为适应诸多逆境，植物必须形成相应的调节机制才能保护自己免受其侵袭，比如调整生命周期、改变细胞代谢、调节信号转导途径等[8]，这些抵抗机制需要复杂的抗逆应答网络[9]。
SAP (Stress-associated proteins，SAPs)是一类含有A20/AN1锌指结构域的蛋白质，是参与多种非生物胁迫的新型E3泛素连接酶之一[10]，可以调节植物中的胁迫信号[11]，减少产量损失，在前人研究中已被证明可以赋予植物对多种非生物胁迫的耐受性，并已成为植物非生物胁迫研究的重要对象之一[12-13]。SAP基因在被子植物中高度保守，OsSAP1首先在植物中分离出来，它们的同系基因已在水稻、拟南芥、胡杨、土豆、棉花和芸苔油菜中鉴定出来[14-21]。迄今为止，来自不同物种的几个具有一个A20结构域和一个AN1结构域的SAP基因已被证实参与对多种非生物胁迫的耐受性。在水稻中，OsSAP1的表达是由不同的胁迫(寒冷、干旱、盐、重金属、ABA和损伤)诱导的，OsSAP1的过表达提高了对干旱、寒冷和盐胁迫的耐受性，并增强了其对转基因植物病原体的免疫力[10]，过表达OsiSAP8的转基因植株也表现出对盐、干旱和寒冷胁迫的高耐受性[19]。在棉花中，AtSAP5的异位表达通过上调内源性胁迫响应基因的表达来提高棉花对干旱和热胁迫的耐受性[20]。过度表达海滨獐毛AlSAP通过维持转基因水稻的光合作用来增强对寒冷、干旱和盐胁迫的耐受性，并在干旱条件下提高水稻籽粒产量[21]。在拟南芥中过表达毛果杨PtSAP13可以显著提高耐盐性，并且转基因植株种子的萌发率比野生型更高[22]。目前，木薯SAP蛋白在非生物胁迫响应中的功能依旧未知。因此，本研究以模式植物拟南芥为参照，采用同源序列法识别木薯SAP同源基因，并对其进行生物信息学及时空表达分析，以期深入挖掘抗逆相关重要基因，为木薯分子设计育种提供重要的基因资源和理论支撑。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本试验材料为木薯栽培品种‘cv. 60444’，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所功能基因组研究实验室提供。选取长势优良的‘cv. 60444’组培苗，对其根、茎、叶、芽、叶柄的组织部位进行收集用于RNA的抽提。再选取生长期和生长势一致的木薯‘cv. 60444’组培苗进行胁迫处理，分别取处理组和对照组的叶片进行液氮速冻后保存于−80 ℃用于RNA的抽提。
RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒(D2639A)和qRT-PCR所用的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit (DRR081A)购自莫奈生物科技有限公司；各种引物合成以及载体测序由北京擎科生物科技股份有限公司完成；2× Taq PCR反应体系(KT201-02)购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR产物回收纯化试剂盒(DR02)、质粒提取试剂盒(PL03)购自艾德莱生物有限公司；大肠埃希菌DH5α、农杆菌LBA4404和酵母Y2HGold感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；Clontech酵母双杂交试剂盒(630489)及酵母培养基购自宝生物有限公司；植物表达载体pGAMBIA1302-35S::GFP由中国热带农业科学院热带生物技术研究所改造保存。
1.2 试验方法
1.2.1 叶片总RNA的提取及cDNA的合成
根据RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，提取木薯总RNA，使用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测总RNA的浓度和纯度，参照Fastking gDNA Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒(TaKaRa)的说明书进行反转录，得到的cDNA用于后续试验。
1.2.2 MeSAP基因家族成员鉴定及理化性质分析
利用隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)[23]对其基因组进行搜索并分别通过NCBI-CDD、Pfam和SMART 3个公共数据库鉴定木薯MeSAP基因家族成员。从JGI植物基因组数据库(https://phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html)[24]获得木薯MeSAP家族成员的基因ID、编码区(CDS)序列和氨基酸序列。通过TB-tools的Protein Paramter Calc功能[25]，获得木薯MeSAP家族蛋白的相对分子质量、理论等电点、不稳定系数、蛋白疏水性和脂溶性。
1.2.3 MeSAP基因家族系统进化树分析
从JGI植物基因组数据库下载拟南芥、木薯的SAP家族蛋白序列。以木薯、拟南芥SAP家族蛋白的氨基酸序列为基础，通过MEGA 7.1的NJ (Neighbour-joining)法构建系统发育进化树[26]，使用MEGA 7.1进行1 000次迭代bootstrap测试。
1.2.4 MeSAP家族蛋白保守结构分析和氨基酸序列比对
为进一步分析MeSAP的蛋白结构，使用MEME对SAP家族蛋白进行Motif分析，并利用TB-Tools工具进行绘图。从JGI植物基因组数据库下载木薯SAP蛋白序列。利用DNAMAN7软件对木薯SAP蛋白家族序列进行多序列比对。利用TB-tools软件对木薯SAP蛋白家族结构以及Motif基序进行绘制。
1.2.5 MeSAP基因家族的表达模式分析
为鉴定木薯MeSAP基因家族在木薯不同组织部位以及在木薯不同胁迫处理下的表达情况，以2月龄的木薯‘cv. 60444’组培无菌苗为材料，以MS液体培养基处理作为对照组，同时分别进行低温(4 ℃低温培养1 d)、干旱(200 g/L PEG6000溶液模拟干旱处理6 h)、高盐(200 mmol/L NaCl处理6 h)、缺氮(无氮MS液体培养基处理6 d)、缺钾(无钾MS液体培养基处理6 d)胁迫处理，收集对照组和处理组植株的幼嫩叶片和顶芽抽提RNA进行后续试验。为鉴定MeSAP基因家族成员的组织特异性表达特征，分别选取木薯幼苗的根、茎、顶芽、顶芽下方第1—3叶位的叶片及叶柄作为材料抽提RNA。以各材料的cDNA为模板，利用NCBI设计MeSAP基因家族成员的qRT-PCR引物，先通过半定量PCR确定MeSAP基因家族成员在木薯5个组织部位的表达，再通过qRT-PCR分析MeSAP基因家族成员在不同处理下的表达差异。
qRT-PCR用TIANGEN的Fastking gDNA dispelling RT SuperMix (4992251)；在StepOne Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)上使用TIANGEN的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit (fp202-02)对每个cDNA样本进行3次重复PCR；利用MeActin作为内参基因，MeSAP基因家族成员的表达量以2−△△Ct来计算。为分析MeSAP基因家族在不同组织部位的表达情况，通过GraphPad Prism 8工具绘图。使用SPSS 26.0的t检验功能分析数据间的差异显著性，以P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。
1.2.6 亚细胞定位
将MeSAP11基因cDNA全长片段构建到植物表达载体pGAMBIA1302-35S::GFP上，构建pGAMBIA1302-35S::GFP-MeSAP11植物表达载体，将测序正确的质粒转化至LBA4404农杆菌中，以pGAMBIA1302-35S::GFP载体为对照，经鉴定后的农杆菌按照烟草瞬时转化的方法注射到烟草叶片的下表皮，注射2 d后观察绿色荧光蛋白和mCherry的亚细胞定位。
1.2.7 酵母双杂交筛选MeSAP11互作蛋白
先将MeSAP11基因cDNA全长片段插入酵母表达载体pGBKT7中，将测序正确的质粒和pGADT7共转至酵母Y2H菌株中。分别挑取鉴定后的转化酵母菌株以9 g/L的NaCl溶液重悬，并稀释到10−1~10−4浓度梯度后分别点在SD/DDO和SD/QDO平板上，根据所稀释的菌液是否在SD/QDO培养基上长出菌斑判断MeSAP11是否具有自激活活性。
利用本试验已建好的木薯叶片cDNA文库筛选可能与MeSAP11互作的蛋白，筛选方法按酵母双杂交试剂盒说明书进行。将筛选到的阳性克隆进行菌落PCR测序鉴定。
2. 结果与分析
2.1 MeSAP基因家族成员鉴定及理化性质分析
为了鉴定木薯MeSAP基因家族成员，验证后得到16个木薯SAP基因家族成员，按照MeSAP家族成员染色体编号由小到大进行编序，并分别命名为MeSAP1~16。如表1所示，其编码的SAP家族蛋白由51~293个氨基酸组成，相对分子质量为6 000~32 400，理论等电点除MeSAP2外其余成员均大于7.9，多为碱性蛋白。蛋白不稳定系数小于40表明稳定性好，大于40提示蛋白可能不稳定；本研究发现不稳定蛋白均属于同组成员，其中MeSAP5和MeSAP13稳定性较好。家族成员的疏水指数为38~66，脂溶性系数为−0.8~−0.2，亲水系数大于0，说明16个家族成员均属于疏水性蛋白。
表 1 木薯MeSAP家族蛋白的理化性质Table 1. Physical and chemical properties of MeSAP family protein in cassava名称
Name氨基酸数量
Number of
amino acid相对分子质量
Relative molecular
weight理论等电点
Theoretical
PI不稳定系数
Instability
index蛋白疏水性
Aliphatic
index脂溶性系数
Coefficient of fat
solubilityMeSAP1 136 15 101.02 8.02 46.82 57.50 −0.744 MeSAP2 51 6 004.96 5.40 49.63 65.10 −0.698 MeSAP3 135 14 950.05 8.93 52.51 61.48 −0.583 MeSAP4 179 18 922.35 7.99 34.34 58.94 −0.380 MeSAP5 173 18 308.73 8.68 25.06 58.21 −0.387 MeSAP6 171 18 467.02 8.44 30.59 61.11 −0.480 MeSAP7 179 19 204.52 9.01 44.22 52.91 −0.618 MeSAP8 170 17 892.20 8.48 32.07 60.88 −0.284 MeSAP9 156 17 325.93 8.90 49.73 58.21 −0.440 MeSAP10 188 20 393.91 8.90 40.45 55.59 −0.545 MeSAP11 176 18 929.37 9.13 54.33 60.40 −0.431 MeSAP12 192 21 446.91 9.37 44.90 38.70 −0.782 MeSAP13 173 18 534.17 8.44 26.36 66.53 −0.349 MeSAP14 160 17 700.14 8.75 43.69 57.31 −0.589 MeSAP15 293 32 420.86 8.65 46.82 62.56 −0.597 MeSAP16 192 21 220.33 8.98 37.91 57.97 −0.588 2.2 MeSAP蛋白家族进化树分析
为了更好地了解MeSAP基因家族的起源和演化历程，利用MEGA7.0软件对木薯、拟南芥的SAP蛋白构建系统发育进化树。2个物种的SAP蛋白系统发育树分为6组(图1)，A组分别为AtSAP3、AtSAP4、AtSAP6、MeSAP9、MeSAP11、MeSAP14，其中6个成员均包含AN1和A20结构域，从进化树中可以看出木薯MeSAP11与拟南芥当中的AtSAP3亲缘关系最近，在功能上可能存在相似。B组主要有5个蛋白，分别为AtSAP1、AtSAP7、AtSAP9、MeSAP4、MeSAP5，其中MeSAP4和MeSAP5的序列相似性为99%。C组多为MeSAP蛋白，有5种木薯蛋白MeSAP6、MeSAP7、MeSAP8、MeSAP10、MeSAP13和2种拟南芥蛋白AtSAP2、AtSAP5，其中MeSAP6和MeSAP13序列相似性为99%，MeSAP7和MeSAP10序列相似性为100%并聚类到AtSAP5，预示MeSAP7和MeSAP10与AtSAP5的功能可能相似。D组主要有AtSAP10、MeSAP1、MeSAP2、MeSAP3、MeSAP12，MeSAP3与组中其他成员序列相似性均较高。此外E组中仅有1个拟南芥蛋白AtSAP8，表明AtSAP8与其他成员关系较远。F组仅分布2种木薯蛋白MeSAP15和MeSAP16，且都不具有A20和AN1结构域，表明两者功能与其他成员存在一定差异。系统发育关系比较结果表明，聚集在一起或与其他物种聚集在一起的SAP成员可能具有相似的抗胁迫生物学功能。
2.3 MeSAP家族蛋白分析和氨基酸序列比对
Motif分析结果表明，16个MeSAP存在10个保守基序，基序长度位于0~200个氨基酸之间(图2A)。15个家族成员中均存在保守基序Motif 3，其中，除MeSAP2、MeSAP15、MeSAP16外其余家族成员均具有Motif 1和Motif 2保守基序，Motif 1为AN1锌指结构域，Motif 2为A20锌指结构域，可作为转录调控因子参与许多生理过程，并参与基因表达调控(图2B)。与其他蛋白相比，SAP11、SAP9和SAP14在起始位置独特保有Motif 6基序，在木薯中可能具有重要功能。从基因结构来看，在木薯SAP家族的16个基因中，外显子与内含子分布差异较大，SAP2、SAP3和SAP10无内含子(图2C)，表明MeSAP家族在功能上可能存在差异。
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图 2 MeSAP蛋白结构与氨基酸序列分析A：保守结构域；B：A20/AN1保守基序序列；C：基因结构分析；D：MeSAP家族的氨基酸多序列比对Figure 2. Structure and amino acid sequence analysis of MeSAP proteinA: Conserved structural domain; B: A20/AN1 conserved motif sequence; C: Gene structure analysis; D: Amino acid multiple sequence alignment of MeSAP family通对16个MeSAP蛋白序列进行多序列比对(图2D)，发现MeSAP家族大部分成员蛋白序列都在N端含有1个由22个氨基酸LCXNX2CGX2GX4MNLCSKC组成的A20结构域，在C端均含有1个由36个氨基酸CX2CX4GLTGXFXCX2CGX2FCX2HRX4HXCX组成的AN1保守结构域，MeSAP2、MeSAP15、MeSAP16蛋白序列不含有A20结构域和AN1保守结构域。多序列比对结果和Motif分析表明MeSAP基因家族成员序列高度保守。
2.4 MeSAP基因家族在木薯不同组织部位中特异性表达
采用qRT-PCR技术检测16个MeSAP基因在木薯根、茎、叶、芽、叶柄5个组织的表达谱，结果表明，MeSAP家族成员在茎中的表达水平均较低，与根组织表达量相比差异显著；部分基因在芽中的表达水平也不明显，如MeSAP3、MeSAP8、MeSAP9、MeSAP12、MeSAP14、MeSAP16；家族成员在根、叶和叶柄中表达较高，说明其可能在木薯营养生长期发挥重要作用；此外，MeSAP3在叶柄中几乎不表达，在芽中的表达也处于较低水平，可能不参与木薯顶部组织生长(图3)。
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图 3 木薯MeSAP基因家族表达的组织特异性分析“*”“**”分别表示其他组织与根在P < 0.05和P< 0.01水平差异显著(t检验)Figure 3. Relative expression pattern of MeSAP in different tissues“*” and “**” indicate significant differences between other tissues and root at P < 0.05 and P < 0.01 levels, respectively (t test)2.5 胁迫诱导下MeSAP基因家族表达模式
为更好地了解MeSAP基因家族对胁迫的响应，木薯分别经低温4 ℃、PEG模拟干旱、盐、氮饥饿、钾饥饿处理，采用qRT-PCR技术对MeSAP进行表达分析。结果表明，MeSAP1、MeSAP2、MeSAP3、MeSAP4、MeSAP11、MeSAP12在冷害和盐胁迫下显著上调，相反在干旱、钾饥饿或氮饥饿下表现出显著下调，MeSAP16在冷害和盐胁迫下也极显著响应。此外，部分成员MeSAP5、MeSAP8和MeSAP13在各处理条件下具有相对一致的表达模式，而MeSAP14、MeSAP15对氮饥饿响应较为显著(图4)。
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图 4 木薯MeSAP基因家族对不同胁迫的响应分析“*”“**”分别表示处理与对照在P<0.05和P<0.01水平差异显著(t检验)Figure 4. Response analysis of MeSAP gene family to different stresses“*” and “**” indicate significant differences between control and treatment at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively (t test)2.6 MeSAP11蛋白亚细胞定位
为了进一步研究MeSAP基因家族成员的功能，本文选用受不同非生物逆境显著调控的MeSAP11作为候选基因，构建pGAMBIA1302-35S::GFP-MeSAP11载体，通过瞬时转化烟草叶片的方法对于MeSAP11蛋白的亚细胞定位进行研究。结果（图5）表明，对照组烟草叶片表皮细胞中均分布较强的绿色荧光，而35S::GFP-MeSAP11融合蛋白表达绿色荧光，和35S::H2B-mCherry蛋白共同定位在细胞核内。
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图 5 MeSAP11-GFP融合蛋白的亚细胞定位Figure 5. Subcellular localization of MeSAP11-GFP fusion proteins2.7 MeSAP11互作蛋白的筛选
为深入解析MeSAP11蛋白的生物学功能，利用酵母双杂交筛库技术，对MeSAP11的互作蛋白进行筛选与鉴定。转录自激活试验表明，MeSAP11蛋白对酵母细胞没有毒性且无转录激活功能(图6)。进一步以pGBKT7-MeSAP11为诱饵，通过酵母双杂交系统从木薯逆境cDNA文库中筛选与MeSAP11互作的蛋白，将生长在四缺培养基上的酵母菌斑进行NGS测序，获得256个潜在的互作蛋白，表2列出了测序丰度较高的17个基因。点对点验证结果表明MeSAP11与HSF24、NAC47、SPL9存在蛋白互作(图6)。
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图 6 MeSAP11转录自激活分析及点对点验证互作蛋白Figure 6. Transcriptional activation analysis and point-to-point verification of interacting proteins of MeSAP11表 2 MeSAP11酵母在cDNA文库的筛选结果Table 2. Screening of MeSAP11 yeast in cDNA library基因编号
Gene number注释
AnnotationManes.13G013400.1 小热休克蛋白HSP20 Manes.11G058600.1 聚泛素3 Polyubiquitin 3 Manes.17G035300.1 泛素样蛋白 Ubiquitin-like proteins Manes.16G032100.1 DNAJ同源家族C成员 DNAJ member C Manes.04G165900.1 GTPase激活蛋白 AGD11 Manes.01G042200.1/
Manes.13G124500.1热休克蛋白热应激转录因子
Heat shock protein HSF24Manes.07G019300.1 聚泛素4 Polyubiquitin 4 Manes.09G144100.1 转录因子 NAC47 Manes.09G032800.1 转录因子 SPL9 Manes.14G148600.1 I 类热休克蛋白
Class I heat shock proteinManes.09G042800.1 未知蛋白 Uncharacterized protein Manes.12G078200.1 WD重复蛋白 WD protein Manes.15G054800.1 转换因子 Translation factor Manes.05G204500.1 一种配子表达的跨膜蛋白HAP8 Manes.13G087500.1 蛋白激酶家族蛋白
Protein kinase family proteinsManes.09G036800.1 泛素样蛋白 Ubiquitin-like proteins 对测序获得的256个互作蛋白进行聚类分析，GO富集分析发现，叶绿体、细胞质、蛋白质结合以及对盐胁迫、热激、光敏和缺水响应相关通路蛋白显著富集(图7A)。KEGG结果发现蛋白泛素化降解、内质网蛋白质加工通路相关基因被显著富集(图7B)。综上，说明MeSAP11可能通过参与蛋白降解途径或与热激蛋白、转录因子协同参与调节蛋白质的合成或降解，以介导植物逆境响应的相关进程。
3. 讨论与结论
SAP蛋白在植物响应非生物胁迫中起着重要作用。水稻中的SAP蛋白OsSAP1已被证明通过调节内源性胁迫相关基因的表达，在过量表达时赋予植物非生物胁迫耐受性[10]。OsiSAP8通过A20和AN1锌指结构域的相互作用，在烟草和水稻中过表达后，使其在种子萌发及幼苗阶段对盐、干旱和冷胁迫的耐受性显著提高[19]。OsiSAP7通过充当泛素连接酶作为ABA和缺水应激信号的负调节因子[27]。在拟南芥中，AtSAP5与转录协同调节因子MBF1C共同作用建立拟南芥热应激的耐受性[11]。AtSAP5在棉花的异位表达通过上调内源性响应基因的表达来提高棉花对干旱和热胁迫的耐受性[21]。AtSAP10在拟南芥中过表达后，拟南芥对镍、锰、锌等重金属和高温胁迫具有很强的耐受性，与野生型相比，生长更加健康，生物量增加数倍，根更长[28]。毛果杨中的PtSAP13在拟南芥中过表达后，在盐胁迫处理下植株表现出比野生型更高的种子萌发率和更好的生长[22]。
通过对木薯SAP基因家族编码的蛋白结构及特点进行生物信息学分析发现，MeSAP蛋白家族也具有A20和AN1锌指结构域，另外SAP基因家族中不含或含有少量的内含子是这一类蛋白的一个重要特点[29]。通过亚细胞定位预测及验证发现本研究中的MeSAP11定位于细胞核，与其他物种中的SAPs相像，绝大部分均定位于细胞核。通过对文库筛选的互作蛋白进行分析发现多数为热休克蛋白、泛素酶以及转录因子等，其中热休克蛋白HSP20基因家族在马铃薯中表现为在热、盐胁迫和干旱胁迫等多种非生物胁迫中均显著上调表达[30]。在植物非生物胁迫响应调控中的功能机制研究中，转录因子一直备受关注，在酵母文库筛选中发现SPL和NAC是植物特有的一类转录因子，在植物抵抗非生物胁迫具有重要的功能，前人研究发现木薯MeSPL9通过负调控茉莉酸、脯氨酸和花青素等干旱逆境响应相关的代谢物关键合成酶基因的表达来影响木薯的抗旱性[31]；过表达水稻NAC基因家族成员SNAC1基因能够提高转基因棉花的抗旱和抗盐的能力[32]。
目前，关于MeSAP参与木薯逆境胁迫抵御方面的研究尚不清楚，对木薯SAP家族基因的功能仍未知，本研究利用木薯基因组信息对木薯MeSAP家族进行分析鉴定，并利用生物信息学的方法对其系统进化、理化性质以及结构特征进行深入分析。同时结合qRT-PCR分析了MeSAP在木薯组织中的时空表达以及在逆境胁迫下的表达模式。此外，在木薯MeSAP中确定了1个在木薯根和叶片中优势表达的具有A20和AN1保守结构域的候选基因MeSAP11，通过亚细胞定位发现其主要定位于细胞核。并通过酵母双杂交系统从木薯叶片cDNA文库中筛选到部分可能与MeSAP11互作的候选蛋白，并初步验证了MeSAP11与其中的热激蛋白和胁迫应激方面的转录因子的互作关系。研究结果为进一步探究MeSAP11的功能及分子机制奠定了一定基础。
干旱和热胁迫会显著降低作物产量和质量，基因表达的调节是植物适应胁迫的关键因素[19]，提高植物对干旱和热激耐受性的分子策略可以集中在增加特定酶和保护蛋白数量或操纵某些信号的转导途径[33]，特定调节蛋白(如转录因子、蛋白激酶或泛素连接酶)的表达改变可用于调节下游基因的表达，以影响对应激的代谢反应[12]。通过前期的试验结果，对于是否确定MeSAP11与互作蛋白共同参与调控木薯的抗旱功能，还需要制备相应的转基因木薯来进一步验证其功能。
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图 1 木薯种茎结构图
1：种芽，2：韧皮层，3：表皮，4：木质层，5：髓体
Figure 1. Structure diagram of cassava seed stem
1: Bud, 2: Bast, 3: Epidermis, 4: Xylem, 5: Medulla
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图 2 木薯种茎三维实体模型逆向建模过程
Figure 2. Reverse modeling process of cassava seed stem 3D solid model
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图 3 种茎主茎秆(A)和种芽(B)几何结构参数
Figure 3. Parameters of the geometrical structure of the main culm (A) and the bud (B) of the seed stem
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图 4 木薯种茎实物凸起种芽分布(A)及其建模(B)
Figure 4. Distribution of raised buds in physical cassava seed stem (A) and modeling (B)
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图 6 物体接触面定义
A和B为两物体，$ {V_{\text{A}}} $和$ {V_{\text{B}}} $为构形，$ {\varOmega _{\text{A}}} $和$ {\varOmega _{\text{B}}} $为边界面，$ {\varOmega _{\text{C}}} $为接触面
Figure 6. Definition of object contact surface
A and B are two objects, with conformations of $ {V_{\text{A}}} $ and $ {V_{\text{B}}} $, boundary surfaces of $ {\varOmega _{\text{A}}} $ and $ {\varOmega _{\text{B}}} $, contact surface of $ {\varOmega _{\text{C}}} $
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图 8 预切种振动供种式木薯播种器示意图
1：喂种箱，2：种量控制提升板，3：阶梯式振动散种机构，4：振动散种板，5：振动系统，6：阶梯式调姿板，7：充种箱，8：充种板，9：输送链，10：捞种勺，11：护种部件，12：刮种部件，13：机架，14：木薯种茎群，15：电动机，16：种层挡板
Figure 8. Diagram of the whole machine structure of the pre-cut seed vibrating cassava seeder
1: Seed feeding box, 2: Seed volume control lifting plate, 3: Stepped vibration seed dispersal mechanism, 4: Vibration seed dispersal plate, 5: Vibration system, 6: Stepped posturing plate, 7: Seed charging box, 8: Seed charging plate, 9: Conveyor chain, 10: Seed scooping spoon, 11: Seed guarding part, 12: Seed scraping part, 13: Rack, 14: Cassava seed stem cluster, 15: Electric motor, 16: Seed layer baffle plate
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图 9 种茎撞击全过程应力变化分析
Figure 9. Analysis of stress changes during the whole process of seed stem impaction
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图 10 木薯茎秆与振动板接触冲击的过程中种芽处的应力云图
Figure 10. Stress cloud at seed sprouts during impact of cassava stalks in contact with vibration plate
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图 11 木薯茎秆与振动板接触冲击过程中整体单元结果位移云图
Figure 11. Overall unit resultant displacement cloud during impact of cassava stalks in contact with vibration plate
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图 13 各因素对种茎种芽−播种部件斜面接触的等效应力的影响
Figure 13. Effects of various factors on the equivalent stress of the contact between the seed stem bud and sowing part on the slope
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图 14 各因素对种芽−茎秆交接处的等效应力的影响
Figure 14. Effects of various factors on the equivalent stress at the junction of seed bud and stalk
表 1 木薯种茎各部位材料参数
Table 1 Material parameters of cassava seed stem
部位
Part密度($ \rho $)/
(×10−10 t·mm−3)
Density径向弹性
模量($ {E_a} $)/MPa
Radial elasticity
modulus轴向弹性
模量($ {E_c} $)/MPa
Axial elasticity
modulus同性平面
泊松比($ {\mu _{ab}} $)
Homogeneous plane
Poisson’s ratio异性平面
泊松比($ {\mu _{ac}} $)
Anisotropic plane
Poisson’s ratio轴向剪切模
量($ {G_{ab}} $)/MPa
Axial shear
modulus径向剪切模量
($ {G_{bc}} $)/MPa
Radial shear
modulus木质部
Xylem8.3 50.01 25.04 0.42 0.35 17.60 92.75 韧皮部
Phloem5.1 1.78 12.24 0.38 0.31 0.68 4.67 种芽
Seed bud7.5 45.00 45.00 0.35 0.35 2.50 2.50 
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表 2 试验因素与水平
Table 2 Test factor and level
水平
Level种茎跌落高度(X1)/mm
Seed stem drop height振动板安装倾斜角度(X2)/(°)
Vibration plate mounting tilt angle振动板振动频率(X3)/Hz
Vibration plate vibration frequency−1.682 120.00 15.00 55.00 −1 132.16 16.82 58.04 0 150.00 19.50 62.50 1 167.84 22.18 66.96 1.682 180.00 24.00 70.00
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表 3 试验方案与结果
Table 3 Test plan and result
序号 X1/mm X2/(°) X3/Hz Y1/MPa Y2/MPa Y3 Y4 1 132.16 16.82 58.04 24.31 8.21 0.045 0.776 2 167.84 16.82 58.04 24.43 8.31 0.046 0.787 3 132.16 22.18 58.04 28.21 11.42 0.063 0.912 4 167.84 22.18 58.04 29.71 12.61 0.069 0.957 5 132.16 16.82 66.96 26.44 10.12 0.056 0.891 6 167.84 16.82 66.96 29.22 16.22 0.091 0.943 7 132.16 22.18 66.96 24.91 9.42 0.052 0.813 8 167.84 22.18 66.96 32.21 17.23 0.095 1.044 9 120.00 19.50 62.50 25.72 8.74 0.048 0.831 10 180.00 19.50 62.50 32.43 16.12 0.087 1.052 11 150.00 15.00 62.50 27.63 10.32 0.057 0.891 12 150.00 24.00 62.50 30.14 11.41 0.063 0.973 13 150.00 19.50 55.00 26.62 8.24 0.045 0.861 14 150.00 19.50 70.00 31.16 14.42 0.081 1.011 15 150.00 19.50 62.50 28.63 10.23 0.056 0.923 16 150.00 19.50 62.50 29.42 11.24 0.062 0.947 17 150.00 19.50 62.50 29.14 10.04 0.055 0.883 18 150.00 19.50 62.50 29.14 10.82 0.061 0.94 19 150.00 19.50 62.50 28.74 10.42 0.057 0.934 20 150.00 19.50 62.50 28.82 10.72 0.059 0.933 21 150.00 19.50 62.50 29.42 11.11 0.061 0.951 22 150.00 19.50 62.50 29.26 10.61 0.058 0.937 23 150.00 19.50 62.50 29.42 11.24 0.062 0.947
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