Isolation and identification of endophytic bacteria from banana fusarium wilt resistant strains and their inhibitory and growth-promoting effects
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摘要:目的
筛选和鉴定从威廉斯香蕉抗枯萎病株系根、球茎及假茎分离得到的可抑制香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc)内生菌，研究其抑菌促生效果。
方法通过16S rRNA基因序列测定和生理生化试验，对香蕉抗枯萎病株系内生菌进行种类鉴定和系统发育分析；通过平板对峙试验检测各菌株的抑菌能力，探究拮抗菌分泌抑菌相关活性物质的种类；采用盆栽试验对香蕉抗枯萎病株系内生菌进行生防功能和促生功能的分析，筛选出生防性能优良且兼具促生效果的内生菌，并在大田试验中验证。
结果分离获得13株代表菌株，其中8株对枯萎病1号生理小种(Foc 1)具有抑菌活性，7株对枯萎病4号生理小种(Foc 4)具有抑菌活性；综合盆栽试验和大田试验中代表菌株的防治效果及促生能力，筛选出贝莱斯芽孢杆菌XG1028、变栖克雷伯氏菌XQJ0301和暹罗芽孢杆菌XG0103共3株具备高抑菌活性以及促生能力的生防菌株。
结论本研究筛选出的3株菌株丰富了抗香蕉枯萎病微生物种质资源，为防治香蕉枯萎病寻找安全、环保的新型生物防治剂提供参考。
Abstract:ObjectiveTo screen and identify endophytic bacteria that can inhibit Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) isolated from roots, bulbs and pseudostems of wilt-resistant strains of Williams banana, and study their inhibitory and growth-promoting effects.
MethodThrough 16S rRNA gene sequence and physiological and biochemical tests, species identification and phylogenetic analysis of endophytic bacteria in banana fusarium wilt resistant strains were carried out. The plate confrontation test was carried out to detect the antibacterial ability of strain and explore the types of antibacterial related active substances secreted by antagonist. The biocontrol and growth-promoting functions of endophytic bacteria in banana resistant strains to wilt disease were analyzed by pot experiment. The endophytes with good biocontrol and growth promoting effects were selected and verified in field.
ResultThirteen representative strains were isolated, among which, there were 8 strains with antibacterial activity against Foc 1 and 7 strains with antibacterial activity against Foc 4. Three biocontrol strains with high inhibitory activity and growth promotion ability were selected by the comprehensive results of biocontrol and growth promoting effects in pot and field experiments, including Bacillus velezensis XG1028, Klebsiella mutans XQJ0301 and Bacillus siamensis XG0103.
ConclusionThree screened strains can enrich the germplasm resources of microorganisms resistant to banana wilt disease, and provide a reference for finding the new safe and environmentally friendly biological control agents controlling banana wilt disease.
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骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)家族是转化生长因子β(Transforming growth factor-β)超家族成员。1965年，Urist[1]从脱钙骨基质提取物中发现一种能够让间充质细胞定向分化为成骨细胞且能促进骨形成的活性蛋白，并将其命名为BMP。到目前为止，科学家发现的BMP家族成员已超过20种[2]。在BMP家族中，除BMP1外，其他成员均属于TGF-β家族，具有促进骨形成的作用[3]。1990年，Celeste等[4]从人的胎盘cDNA文库中分离得到的hBMP6克隆具有BMP家族成员的特征，从而将该基因命名为BMP6。BMP6基因在多种组织中发挥功能。Arndt等[5]通过比较BMP6−/−和野生型小鼠的肝脏中BMP6基因的表达差异，发现BMP6基因的缺失会导致肝组织或干细胞损伤。Yung等[6]通过定量分析牛主动脉内皮细胞中的BMP6基因及各种配体的表达量发现BMP6基因与氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, oxLDL)基因独立而协同地诱导成骨分化和钙化。BMP6基因在动物的生殖系统中也发挥着重要作用，Ma等[7]研究发现，BMP6基因在雌性卵巢中的表达水平显著高于在雄性睾丸中的表达。Toma等[8]研究发现BMP6基因能够影响卵泡的成熟并进一步影响动物生殖系统。
鸡BMP6基因(GenBank：NC_052533.1)定位于2号常染色体上，基因全长85848 bp，拥有7个外显子，外显子全长2988 bp。Ye等[9]和Lu等[10]研究发现，BMP6参与了软骨细胞的增殖过程。外源性鸡BMP6蛋白能显著促进鸡颗粒细胞的增殖[11]。此外，Regassa等[12]研究发现，BMP6基因参与了脂肪的形成过程。而鸡BMP6基因多态性研究较少。姚国瑜[13]以金寨黑鸡为研究材料，扩增了BMP6基因的7个外显子后发现外显子4上存在1个A76150G突变位点，且该突变位点与金寨黑鸡的体质量有显著的相关性。目前，关于BMP6基因多态性的研究更多集中在羊品种上。肖朝庭等[14]以不同绵羊品种为试验材料，扩增BMP6基因的外显子5、6和7，结果发现其没有多态性；储明星等[15]以不同山羊品种为试验材料，同样扩增BMP6基因的外显子5、6和7，未发现多态位点，这可能是由于BMP6基因外显子5、6和7序列在羊品种中比较保守。可以看出，在不同物种中，同一基因不同位点的碱基突变所产生的影响也是有差异的。
粤西卷羽鸡别称麒麟鸡，因其羽毛向上翻卷而得名，是产于粤西茂名、湛江一带的广东省地方特色品种，其羽毛、脚和皮均呈黄色，具有典型的三黄鸡特征。该品种具有耐粗饲、抗病性强、体型大、成活率以及屠宰率高的特点[16-17]。目前，关于BMP6基因在广东地方品种粤西卷羽鸡的研究鲜见报道。本研究以粤西卷羽鸡为研究对象，构建DNA混合池，PCR扩增BMP6基因外显子序列，通过直接测序法筛选SNP位点，并对筛选出的SNP位点进行群体遗传学、连锁不平衡分析，旨在筛选出粤西卷羽鸡生长性状以及屠宰性状的分子遗传标记，为今后地方品种粤西卷羽鸡的分子选育和品种改良提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 试验动物的饲养管理及样品采集
以120只粤西卷羽鸡(公母各半)为研究对象，参照肉鸡的饲养标准进行饲喂，试验期间自由采食、饮水，饲喂至90日龄，测定并记录其体质量、体尺(龙骨长、胫长和胫围)。同时选取60只(公母各半)测定屠宰性能(活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量、腹脂质量、胸肌质量、腿肌质量和肝脏质量)，翅静脉真空采血管采血1 mL，EDTA抗凝，−20 ℃保存。
1.2 主要仪器
DNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；分光光度计(型号为ND-LITE)购自基因有限公司；PCR仪(型号为Veriti 96-well)购自广州源起健康科技有限公司；电泳仪(型号为DYCP-31DN+DYY-6C)购自北京市六一仪器厂。
1.3 主要试剂
2×EasyTaq® PCR SuperMix(赛默飞)、琼脂糖(Sangon Biotech)和无毒核酸染料(Sangon Biotech)。
1.4 鸡血液 DNA 的提取和纯度检测
参考血液基因组 DNA 提取试剂盒说明书，完成 DNA 的抽提，凝胶电泳检测其完整性，用分光光度计测定 DNA 纯度。
1.5 引物设计
以NCBI数据库中鸡BMP6基因序列(GenBank登录号： NC_052533.1)为参考序列，利用SnapGene®Viewer 2.3.4软件对外显子设计特异性扩增引物，引物序列见表1，引物由上海生物工程(生工)技术服务有限公司合成。
表 1 BMP6基因的引物序列Table 1. Primer sequences of BMP6 gene引物名称
Primer name正向序列(5′→3′)
Forward sequence反向序列(5′→3′)
Reverse sequence产物长度/bp
Product
length退火温度/℃
Annealing
temperatureBMP6-Exon2 TCTTGAGGGAACAGGTGGCAG GCATCATCCCTCCCTAGG 314 60 BMP6-Exon3 GCATGTGTACGGTGTGGAAGA TGTCACCTTGTGCTCACCTAG 560 59 BMP6-Exon4 GAGCCTCTTGTCTCGGATGGA TTGCGCTGTTCTACCAGCT 769 60 BMP6-Exon5 TTCTAAGCCAGTCACTGTTACGC CATGAGTGACAGAGGATGGCT 502 60 BMP6-Exon6 GACACGAACATCAGTGTCCATGG CTCACTCACAAACTCACCTATGG 358 60 BMP6-Exon7-1 CAGCAAGACCTGTGCTAAAGC GCCAAGCCATCTTACACTTGC 880 60 BMP6-Exon7-2 CCTGTCATGATAGTACGCATCTT CAGTGGAAGCTAAGTGTTGTACT 825 58 1.6 粤西卷羽鸡DNA混池的构建、PCR扩增及SNP位点检测
将不同DNA样品稀释到相同的浓度后，各抽取5 μL到1.5 mL离心管中制成DNA混池。扩增总体积为25 μL，其中，2× EasyTaq® PCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各1 μL (10 μmol·L−1)，混池基因组DNA模板1 μL，加Nuclease-free Water至25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于4 ℃保存并用于后续测序。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带与目的条带大小一致，则将所得PCR产物送公司进行正反向测序。使用DNAMAN Versiong 9.0软件将测序结果与NCBI上参考片段进行比对，同时利用Chromas Versiong 2.3软件观察测序结果中的峰图，进而筛选出突变位点。
1.7 数据统计分析
利用WPS Office软件中的Excel计算等位基因频率、基因型频率、遗传杂合度、有效等位基因数、多态信息含量以及χ2，计算方法参照刘梅等[18]。
采用IBM SPSS Statistics 26.0软件中的单因素方差分析对粤西卷羽鸡BMP6基因SNP位点的不同基因型与生长性状及屠宰性状进行关联分析，结果表示形式为“平均值±标准误”，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。对于方差不齐的性状采用Tamheini法进行多重比较，对于只有2种基因型的性状则采用t检验进行分析。
2. 结果与分析
2.1 基因组DNA的提取及PCR扩增结果
提取的DNA通过分光光度计检测DNA质量，D260 nm:D280 nm皆处于1.8~2.0之间，表明提取的DNA质量达到标准，可用于后续试验。
粤西卷羽鸡BMP6基因不同外显子PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测显示，电泳条带明亮，特异性好，无杂带，符合用PCR产物直接测定核苷酸排列顺序的要求(图1)。
![]()
图 1 鸡BMP6基因不同外显子PCR产物电泳结果Figure 1. Electrophoresis result of PCR products for different exons of chicken BMP6 geneA: Exon 2; B: Exon 3 (1~7), exon 4 (8~14), exon 5 (15~21); C: Exon 6; D: Exon 7-1; E: Exon 7-22.2 粤西卷羽鸡BMP6基因SNP位点检测
将测序结果与NCBI上参考片段进行比对后筛选SNP位点，结果显示，在第3、6和7外显子上共检测到7个SNP位点：分别为第3外显子上的g.64185950 T>C位点，第6外显子上的g.64195411 G>A位点，第7外显子上的g.64195613 C>T、g.64195821 G>A、g.64195833 T>A、g.64196373 T>C和g.64196735 T>C位点。在粤西卷羽鸡BMP6基因的第2、4和5外显子上均未检测到SNP位点。粤西卷羽鸡BMP6基因7个SNP位点信息见表2。SNP位点基因型Sanger测序峰见图2。
表 2 粤西卷羽鸡BMP6基因突变位点信息Table 2. Information of BMP6 gene mutation sites of Yuexi Frizzled Feather chicken外显子
Exon碱基突变
Base mutation染色体位点1)
Chromosome positionmRNA位点
mRNA site编码氨基酸2)
Encoded amino acid突变类型
Mutation type3 T→C g.64185950 T1135C His 同义突变 Synonymous mutation 6 G→A g.64195411 G1441A Tyr 同义突变 Synonymous mutation 7 C→T g.64195613 C1549T Tyr 同义突变 Synonymous mutation G→A g.64195821 G1757A — T→A g.64195833 T1769A — T→C g.64196373 T2309C — T→C g.64196735 T2671C — 1)以NCBI数据库中鸡BMP6基因序列(GenBank：NC_052533.1) 外显子 1的第1个碱基为起始位点；2)“—”表示无氨基酸编码
1) Starting from the first base of exon 1 in the chicken BMP6 gene sequence (GenBank: NC: 052533.1) in the NCBI database; 2) “—” indicates no amino acid coding![]()
图 2 粤西卷羽鸡SNP位点测序检测结果Figure 2. Detection results of SNP sites in Yuexi Frizzled Feather chicken by sequencing2.3 BMP6基因SNP位点遗传特性分析
对粤西卷羽鸡BMP6基因SNP位点进行遗传特性分析，结果见表3。由表3可知：BMP6基因7个SNP位点中优势基因型(基因型频率)分别为CT(0.542)、AG(0.500)、CT(0.517)、GG(0.675)、AT(0.967)、CC(0.525)和CT(0.475)，相对应的优势等位基因(等位基因频率)分别为C(0.604)、A(0.633)、C(0.583)、G(0.829)、A(0.517)、C(0.742)和C(0.621)。PIC计算值表明，7个SNP位点中, g.64195821 G>A位点为低度多态，其余位点均为中度多态。BMP6基因SNP位点Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，g.64195833 T>A在粤西卷羽鸡群体中显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，其余位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。
表 3 BMP6基因SNP位点遗传特性分析结果1)Table 3. Genetic characteristics analysis results of SNP sites in BMP6 geneSNP位点
SNP site基因型
Genotype频率
Frequencyn 等位
基因
Allele等位基
因频率
Allele
frequency杂合度
(He)
Heterozygosity有效等位
基因数(Ne)
Effective
allele
number多态信息
含量(PIC)
Polymorphism
information
contentχ2 g.64185950 T>C CC 0.333 40 C 0.604 0.478 1.917 0.364 2.106 CT 0.542 65 T 0.396 TT 0.125 15 g.64195411 G>A AA 0.383 46 A 0.633 0.465 1.868 0.357 0.703 AG 0.500 60 G 0.367 GG 0.117 14 g.64195613 C>T CC 0.325 39 C 0.583 0.486 1.946 0.368 0.474 CT 0.517 62 T 0.417 TT 0.158 19 g.64195821 G>A AA 0.017 2 A 0.171 0.284 1.396 0.243 0.936 AG 0.308 37 G 0.829 GG 0.675 81 g.64195833 T>A AA 0.033 4 A 0.517 0.499 1.998 0.375 105.025* AT 0.967 116 T 0.483 TT 0 0 g.64196373 T>C CC 0.525 63 C 0.742 0.383 1.620 0.310 2.058 CT 0.433 52 T 0.258 TT 0.042 5 g.64196735 T>C CC 0.383 46 C 0.621 0.471 1.889 0.360 0.010 CT 0.475 57 T 0.379 TT 0.142 17 1) PIC≥0.5为高度多态，0.25≤PIC<0.5为中度多态，PIC<0.25为低度多态；以χ2检验Hardy-Weinberg平衡，df=2，χ$_{0.05}^{2} $=5.99，χ$_{0.01}^{2} $=9.21；“*”表示P<0.05，偏离Hardy-Weinberg平衡
1) PIC≥0.5 is highly polymorphic, 0.25≤PIC<0.5 is moderately polymorphic, PIC<0.25 is lowly polymorphic; Hardy-Weinberg equilibrium is tested by χ2, df=2, χ$_{0.05}^{2} $=5.99, χ$_{0.01}^{2} $=9.21; “*” indicates P<0.05 and deviation from Hardy-Weinberg equilibrium2.4 BMP6基因多态性与生长性状和屠宰性状的关联性分析
基因型个体数低于5的不做关联分析，直接剔除。对粤西卷羽鸡BMP6基因7个SNP位点不同基因型与生长性状和屠宰性状进行关联性分析，由表4可知：在公鸡BMP6基因的7个SNP位点中，g.64195613 C>T的3种基因型在胫长上存在差异，CC基因型显著高于TT基因型，其余位点各基因型间生长性状差异不显著。
表 4 粤西卷羽公鸡BMP6基因SNP位点各基因型的生长性状1)Table 4. Growth traits of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather cockSNP位点
SNP site基因型
Genotypen 体质量/g
Body weight胫长/cm
Tibia length龙骨长/cm
Keel length胫围/cm
Tibia girthg.64185950 T>C CC 17 1740.16±35.00a 9.06±0.08a 10.14±0.10a 5.02±0.05a CT 33 1716.82±30.55a 8.93±0.09a 10.16±0.10a 5.02±0.04a TT 10 1706.39±71.64a 8.71±0.10a 10.09±0.14a 4.92±0.13a g.64195411 G>A AA 20 1699.59±37.49a 8.78±0.08a 10.16±0.10a 5.01±0.06a AG 33 1715.61±31.84a 8.99±0.09a 10.16±0.09a 4.98±0.04a GG 7 1813.54±52.25a 9.06±0.14a 10.00±0.22a 5.09±0.08a g.64195613 C>T CC 16 1786.34±30.94a 9.06±0.10a 10.09±0.12a 5.09±0.05a CT 35 1709.30±30.93a 8.94±0.08ab 10.15±0.09a 4.96±0.04a TT 9 1654.97±65.51a 8.65±0.10b 10.22±0.17a 5.02±0.12a g.64195821 G>A AG 18 1765.67±33.84a 8.96±0.11a 10.27±0.12a 4.99±0.05a GG 42 1702.85±28.41a 8.92±0.07a 10.09±0.08a 5.01±0.04a g.64195833 T>A AT 57 1718.29±23.52a 8.92±0.06a 10.13±0.07a 5.00±0.03a g.64196373 T>C CC 34 1720.02±30.76a 8.88±0.08a 10.26±0.08a 4.97±0.05a CT 23 1716.21±37.06a 9.00±0.10a 9.96±0.11a 5.04±0.04a g.64196735 T>C CC 21 1774.43±27.32a 9.07±0.08a 10.06±0.10a 5.05±0.05a CT 28 1687.00±39.45a 8.87±0.11a 10.10±0.10a 4.96±0.05a TT 11 1709.33±43.23a 8.82±0.06a 10.40±0.13a 5.01±0.08a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)由表5可知：在母鸡BMP6基因的7个SNP位点中，g.64195411 G>A的3种基因型在龙骨长上存在差异，AA基因型显著高于AG基因型；g.64196373 T>C的2种基因型在胫长上存在差异，CC基因型的胫长极显著高于CT基因型(P<0.01)；g.64196735 T>C的3种基因型在胫长上存在差异，CT基因型显著高于TT基因型；其余位点各基因型间生长性状差异不显著。
表 5 粤西卷羽母鸡BMP6基因SNP位点各基因型的生长性状1)Table 5. Growth traits of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather henSNP位点
SNP site基因型
Genotypen 体质量/g
Body weight胫长/cm
Tibia length龙骨长/cm
Keel length胫围/cm
Tibia girthg.64185950 T>C CC 23 1425.72±27.56a 7.99±0.07a 9.47±0.08a 4.60±0.04a CT 32 1467.16±24.99a 8.10±0.07a 9.44±0.08a 4.60±0.03a TT 5 1378.20±103.47a 8.19±0.33a 9.33±0.24a 4.59±0.13a g.64195411 G>A AA 26 1437.28±29.46a 8.13±0.10a 9.55±0.10a 4.58±0.03a AG 27 1443.81±29.07a 8.04±0.06a 9.31±0.08b 4.60±0.04a GG 7 1468.47±49.26a 7.94±0.07a 9.51±0.09ab 4.63±0.05a g.64195613 C>T CC 23 1440.44±30.21a 8.10±0.06a 9.37±0.08a 4.63±0..04a CT 27 1446.68±25.40a 8.08±0.09a 9.43±0.09a 4.56±0.04a TT 10 1444.10±62.31a 7.96±0.15a 9.64±0.15a 4.61±0.07a g.64195821 G>A AG 19 1418.37±28.84a 8.26±0.10a 9.46±0.11a 4.57±0.03a GG 39 1453.69±25.32a 7.96±0.06a 9.43±0.07a 4.61±0.03a g.64195833 T>A AT 59 1444.87±19.20a 8.06±0.05a 9.44±0.06a 4.59±0.03a g.64196373 T>C CC 29 1456.64±26.20a 8.17±0.09a 9.59±0.08a 4.62±0.04a CT 29 1425.49±28.87a 7.97±0.05b 9.29±0.07a 4.57±0.04a g.64196735 T>C CC 24 1427.00±29.48a 8.03±0.07ab 9.40±0.08a 4.61±0.04a CT 29 1491.68±19.47a 8.17±0.08a 9.50±0.09a 4.61±0.04a TT 7 1303.53±79.57a 7.74±0.06b 9.35±0.20a 4.47±0.09a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)由表6可知：在公鸡BMP6基因的7个SNP位点中，g.64196735 T>C的3种基因型在活质量上存在差异，CC基因型显著高于CT基因型，其余位点各基因型间屠宰性能差异不显著。
表 6 粤西卷羽公鸡BMP6基因SNP位点各基因型的屠宰性能1)Table 6. Slaughter performance of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather cockSNP位点
SNP site基因型
Genotypen 活质量/g
Live
weight屠宰率/%
Dressing
percentage半净膛率/%
Half-bore
weight rate全净膛率/%
Full-bore
weight rate腹脂率/%
Abdominal fat
weight rate胸肌率/%
Breast muscle
weight rate腿肌率/%
Leg muscle
weight rateg.64185950 T>C CC 5 1 658.54a 0.90a 0.82a 0.71a 0.013a 0.11a 0.18a CT 22 1 637.76a 0.89a 0.81a 0.70a 0.012a 0.11a 0.20a g.64195411 G>A AA 13 1 635.90a 0.91a 0.83a 0.71a 0.015a 0.11a 0.19a AG 13 1 621.65a 0.89a 0.81a 0.70a 0.013a 0.11a 0.20a g.64195613 C>T CC 9 1 711.99a 0.89a 0.81a 0.71a 0.010a 0.11a 0.19a CT 17 1 610.45a 0.89a 0.82a 0.70a 0.012a 0.11a 0.20a g.64195821 G>A AG 13 1 643.43a 0.89a 0.82a 0.71a 0.015a 0.11a 0.19a GG 17 1 648.28a 0.90a 0.82a 0.70a 0.010a 0.11a 0.20a g.64195833 T>A AT 29 1 645.82a 0.89a 0.82a 0.70a 0.012a 0.11a 0.20a g.64196373 T>C CC 19 1 625.11a 0.90a 0.82a 0.71a 0.015a 0.11a 0.20a CT 11 1 682.57a 0.89a 0.81a 0.70a 0.007a 0.11a 0.19a g.64196735 T>C CC 11 1 718.33a 0.89a 0.81a 0.71a 0.010a 0.11a 0.18a CT 14 1 601.74b 0.90a 0.82a 0.70a 0.013a 0.11a 0.20a TT 5 1 611.86ab 0.89a 0.82a 0.70a 0.014a 0.11a 0.20a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)由表7可知：在母鸡BMP6基因的7个SNP位点中，g.64195613 C>T的3种基因型在腹脂率上存在差异，CC基因型显著高于CT基因型；g.64196373 T>C的2种基因型在半净膛率上存在差异，CC基因型显著高于CT基因型；其余位点各基因型间屠宰性能差异不显著。
表 7 粤西卷羽母鸡BMP6基因SNP位点各基因型的屠宰性能1)Table 7. Slaughter performance of each genotype at SNP sites of BMP6 gene in Yuexi Frizzled Feather henSNP位点
SNP site基因型
Genotypen 活质量/g
Live
weight屠宰率/%
Dressing
percentage半净膛率/%
Half-bore
weight rate全净膛率/%
Full-bore
weight rate腹脂率/%
Abdominal fat
weight rate胸肌率/%
Breast muscle
weight rate腿肌率/%
Leg muscle
weight rateg.64185950 T>C CC 10 1 318.85a 0.87a 0.78a 0.68a 0.030a 0.12a 0.19a CT 18 1 380.92a 0.87a 0.80a 0.71a 0.027a 0.14a 0.23a g.64195411 G>A AA 13 1 345.03a 0.88a 0.80a 0.71a 0.024a 0.13a 0.25a AG 12 1 349.35a 0.87a 0.78a 0.69a 0.029a 0.12a 0.18a GG 5 1 417.44a 0.88a 0.81a 0.71a 0.029a 0.15a 0.19a g.64195613 C>T CC 11 1 368.40a 0.87a 0.79a 0.70a 0.034a 0.13a 0.18a CT 14 1 353.41a 0.88a 0.80a 0.70a 0.022b 0.13a 0.25a TT 5 1 352.92a 0.88a 0.80a 0.69a 0.024ab 0.13a 0.19a g.64195821 G>A AG 8 1 342.86a 0.86a 0.79a 0.70a 0.025a 0.12a 0.18a GG 21 1 359.04a 0.88a 0.80a 0.69a 0.029a 0.14a 0.23a g.64195833 T>A AT 30 1 358.83a 0.87a 0.79a 0.70a 0.027a 0.13a 0.21a g.64196373 T>C CC 13 1 369.73a 0.87a 0.80a 0.69a 0.027a 0.12a 0.18a CT 15 1 340.58a 0.87a 0.78b 0.70a 0.025a 0.14a 0.24a g.64196735 T>C CC 11 1 345.33a 0.87a 0.79a 0.70a 0.032a 0.13a 0.18a CT 15 1 366.59a 0.88a 0.80a 0.70a 0.021a 0.13a 0.25a 1) 相同位点同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Tamheini法或t检验)
1) Different lowercase letters of the same column for the same site indicate significant differences (P<0.05, Tamheini method or t test)3. 讨论
粤西卷羽鸡是广东省地方特色品种资源，本研究以粤西卷羽鸡为试验材料，对BMP6基因外显子SNP位点与生长性状及屠宰性状进行关联分析，深入挖掘对粤西卷羽鸡标记辅助选择具有一定的参考价值的鸡BMP6基因SNP位点。
本研究在粤西卷羽鸡BMP6基因的外显子上共检测到7个SNP位点，其中g.64185950 T>C、g.64195411 G>A和g.64195613 C>T位点位于外显子编码区，且均为同义突变。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，g.64195833 T>A在粤西卷羽鸡群体中显著偏离Hardy-Weinber平衡，说明该基因多态性丰富[19]。基因在配子中的随机分离以及在合子里的随机重组都会导致一定的误差，从而引起基因频率的变化[20]，提示BMP6基因SNP位点g.64195833 T>A显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态可能与遗传漂变、突变、样本数量或群体育种措施有关[21]。
BMP6基因SNP位点在不同品种中均具有不同的功能。本研究将BMP6基因的7个SNP位点与生长性状及屠宰性状进行关联分析后发现：在公鸡中，g.64195613 C>T位点与胫长存在显著相关性；在母鸡中，g.64195411 G>A位点与龙骨长存在显著相关性，g.64196373 T>C位点与胫长存在极显著相关性，g.64196735 T>C位点与胫长存在显著相关性。Cui等[22]以艾维茵鸡和矮脚黄鸡为试验材料，通过DNA库构建筛选BMP6基因的内含子区和外显子区，之后扩增DNA片段并测序，发现9个SNP位点，并将这些位点与胴体和骨骼性状进行关联分析，结果表明，BMP6基因与艾维茵鸡的股骨质量、胫骨质量和股骨长度存在显著相关性，与胫骨长度存在极显著差异，而与矮脚黄鸡的所有屠宰性能均无显著相关性。肖朝庭等[14]以不同绵羊品种为试验材料，扩增BMP6基因的外显子5、6和7，结果发现其没有多态性。储明星等[15]以不同山羊品种为试验材料，同样扩增BMP6基因的外显子5、6和7，未发现多态位点，可能是由于BMP6基因外显子5、6和7序列在羊品种中比较保守。El-Halawany等[23]扩增埃及绵羊BMP6基因的部分片段，测序后发现，在BMP6基因的3'UTR区检测到3个SNP位点，且BMP6-1位点与埃及绵羊的产仔数存在相关性。我们的研究结果与肖朝庭等[14]、储明星等[15]以及El-Halawany等[23]的研究结果存在差异，而与姚国瑜[13]、Cui等[22]的研究结果相似，即BMP6基因外显子上的部分位点突变与鸡的体质量或体尺存在显著相关性，可能是由于所选物种不同而造成的结果。关于屠宰性状的关联分析发现：在公鸡中，g.64196735 T>C位点与活质量存在显著相关性，其余位点各基因型间屠宰性能差异不显著；在母鸡中，g.64195613 C>T位点与腹脂率存在显著相关性，g.64196373 T>C位点与半净膛率存在显著相关性。因此，可以将BMP6基因g.64195411 G>A、g.64195613 C>T、g.64196373 T>C和g.64196735 T>C这4个位点作为粤西卷羽鸡部分生长性状的分子育种标记，将g.64195613 C>T、g.64196373 T>C和g.64196735 T>C这3个位点作为粤西卷羽鸡部分屠宰性状的分子育种标记。
4. 结论
BMP6基因在粤西卷羽鸡中的多态性丰富，本研究共得到7个粤西卷羽鸡BMP6基因SNP位点。结合生长性状与屠宰性状数据进行关联分析发现，g.64195411 G>A、g.64195613 C>T、g.64196373 T>C和g.64196735 T>C与粤西卷羽鸡生长性状存在显著关联，g.64195613 C>T、g.64196373 T>C和g.64196735 T>C与粤西卷羽鸡屠宰性状存在显著关联，以上位点可以作为粤西卷羽鸡生长性状及屠宰性状的分子育种标记。
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图 1 基于16S rDNA序列构建的菌株系统发育树
Figure 1. Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA sequence
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图 2 香蕉抗枯萎病株系内生菌对病原菌Foc 1的拮抗效果
Figure 2. Antagonistic effect of endophyte of banana fusarium resistant strain against pathogen Foc 1
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图 3 香蕉抗枯萎病株系内生菌对病原菌Foc4的拮抗效果
Figure 3. Antagonistic effect of endophyte of banana fusarium resistant strain against pathogen Foc 4
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图 4 香蕉抗枯萎病株系内生菌产铁载体能力(A)和产酯酶功能(B)
Figure 4. The iron-producing capacity (A) and esterase function(B) of endophyte of banana fusarium resistant strain
1: XQJ0209, 2: XQJ0201, 3: XG0108, 4: XG0103, 5: XG0302, 6: XJJ0205, 7: XQJ0301, 8: XJJ0204, 9: CK
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图 5 香蕉抗枯萎病株系内生菌溶磷效果
Figure 5. The effect of phosphorus solubilization of endophyte of banana fusarium resistant strain
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图 6 香蕉抗枯萎病株系内生菌解钾效果
Figure 6. The effect of potassium hydrolysis of endophyte of banana fusarium resistant strain
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图 7 盆栽试验验证拮抗菌对香蕉枯萎病防效
A：CK1为只施加病原菌的阳性对照组；B：CK2为只施加清水的阴性对照组；C：施加XG1028以及病原菌处理组；D：施加XQJ0301及病原菌处理组；E：施加XG1028和XQJ0301以及病原菌处理组；F：施加XG0302以及病原菌处理组；G：施加XG0103以及病原菌处理组；H：施加XJJ0205以及病原菌处理组；I：施加XG0103和XJJ0205以及病原菌处理组
Figure 7. Verification of control effect of antagonistic bacteria on banana wilt in pot experiment
A: CK1 was a positive control group treated with pathogenic bacteria only; B: CK2 was treated with water only; C: Treated with XG1028 and pathogen; D: Treated with XQJ0301 and pathogen; E: Treated with XG1028，XQJ0301 and pathogen; F: Treated with XG0302 and pathogen; G: Treated with XG0103 and pathogen; H: Treated with XJJ0205 and pathogen; I: Treated with XG0103， XJJ0205 and pathogen
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图 8 拮抗菌处理对感染香蕉枯萎病植株球茎和假茎的影响
A、C分别为施用拮抗菌的球茎和假茎横、纵切面；B、D分别为施用清水的球茎和假茎横、纵切面
Figure 8. Effect of antagonistic treatment on bulb and pseudostem of banana blight infected plant
A and C were the cross and longitudinal sections of bulb and pseudostem applied with antagonist，respectively；B and D were the transverse and longitudinal sections of bulb and pseudostem applied with water，respectively
表 1 香蕉抗枯萎病株系内生菌生理生化指标1)
Table 1 Physiological and biochemical indices of endophytic bacteria of banana fusarium wilt resistant strains
菌株
编号
No. of
strain菌株
名称
Strain
name革兰
染色
Gram
faerbung过氧化
氢酶
Cata-
lase甲基红试验
Methyl
red test硝酸
还原
Nitrate
reductase明胶
液化
Gelatin
liquefactionV.P.
试验
V.P.
test柠檬
酸盐
Citrate蔗糖利用
Sucrose
utilizationXG0103 Bacillus siamensis + − + + + + − + XJJ0204 Kosakonia oryzae − + − + − + + + XQJ0301 Klebsiella quasivariicola − + − + − − + + XJJ0205 Kosakonia arachidis − + − + − + + + XG0302 B. tequilensis + − − + + + − + XG1011 Priestia megaterium + + − + + − + − XQJ1012 B. subtilis + + − + + + + − XG1028 B. velezensis + + − − + + − + XG1161 B. amyloliquefaciens + + − + + + + + XG0108 Stenotrophomonas pavanii − + − + + + + + XQJ0209 Kosakonia radicincitans − + − + − + − + XQJ0201 Klebsiella varicola subsp. tropica − + − + − − + + XG1093 Paenibacillus silvae − + + − + − + − 1) “+”阳性反应；“−”阴性反应
1) “+” Positive reaction；“−” Negative reaction
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表 2 香蕉抗枯萎病株系内生菌对病原菌的抑菌效果
Table 2 Bacteriostatic effect of endophyte of banana fusarium resistant strain on pathogenic bacteria
病原菌
Pathogenic
bacteria菌株编号
No. of
strain菌落直径/mm
Colony diameter抑菌率1)/%
Bacteriostasis
rate对照
Control处理1)
TreatmentFoc 1 XJJ0204 90.00 36.61±0.59c 66.74±0.74a XQJ0301 90.00 35.16±1.07c 68.55±1.34a XG0302 90.00 43.03±0.49b 58.71±0.61b XG0103 90.00 35.56±0.89b 68.05±1.12a XG0108 90.00 47.40±0.34a 53.25±0.42c XG1028 90.00 35.48±0.49c 68.15±0.61a XJJ0205 90.00 35.95±0.16c 67.56±0.20a XQJ0201 90.00 41.35±0.31a 60.81±0.39c Foc 4 XQJ0301 90.00 30.03±0.73f 74.96±0.91a XG0302 90.00 44.40±1.89b 57.00±2.36e XG0103 90.00 41.25±0.17c 60.94±0.21d XG0108 90.00 53.57±0.86a 45.54±1.07f XG1028 90.00 38.30±0.44d 64.63±0.54c XJJ0205 90.00 35.28±0.74e 68.40±0.93b XQJ0201 90.00 38.19±0.72d 64.76±0.90c 1)表中数据为3次重复的平均值±标准误，相同病原菌同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)The data in the table was mean ± standard error for three repetitions , and the different letters after data at the same column for the same pathogenic bacteria indicated significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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表 3 香蕉抗枯萎病株系内生菌产β−1, 3−葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶能力的测定结果1)
Table 3 Results of β-1, 3-glucanase，cellulase and protease produced by endophyte of banana fusarium resistant strain
酶
Enzyme菌株编号
No. of strain溶解圈直径(D)/ mm
Dissolving ring diameter菌落直径(d)/ mm
Colony diameterD/d β−1, 3−葡聚糖酶 XG0302 18.83±0.92b 13.84±0.46b 1.36±0.04a β-1,3-glucanase XG0103 29.30±1.24a 27.05±1.16a 1.08±0.01c XQJ0201 10.11±0.74c 8.45±0.58c 1.20±0.04b 纤维素酶 XG0302 14.89±0.30a 2.40±0.40a 6.57±1.08a Cellulase XG0103 7.24±0.27b 2.78±0.35a 2.69±0.37b XQJ0301 6.59±0.61b 2.93±0.30a 2.29±0.26b 蛋白酶 XG0302 16.99±0.49b 3.79±0.32b 4.55±0.39a Protease XG0103 17.96±0.85b 7.39±0.58a 2.46±0.19c XQJ1012 12.34±0.20c 7.38±0.37a 1.68±0.10d XG1161 17.38±0.65b 7.40±0.68a 2.37±0.15cd XG1011 9.00±0.41d 4.48±0.33b 2.05±0.26cd XG1028 23.57±0.52a 6.92±0.74a 3.47±0.29b 1)表中数据为3次重复的平均值±标准误，相同酶同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)The data in the table was mean±standard error for three repetitions, and the different letters after data at the same column for the same enzyme indicated significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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表 4 香蕉抗枯萎病株系内生菌产生长素能力1)
Table 4 The auxin production ability of endophyte of banana fusarium resistant strain
菌株编号
No. of strainρ(IAA)/(mg·L−1)
IAA content分离部位
Separation siteXQJ0301 7.99±0.17b 球茎 Bulb XQJ0201 4.71±0.30d 球茎 Bulb XJJ0205 6.13±0.34c 假茎 Pseudostem XG0108 16.81±0.60a 根 Stem XJJ0209 7.39±0.12b 假茎 Pseudostem XJJ0204 5.01±0.22d 假茎 Pseudostem 1 ) 表中数据为3次重复的平均值±标准误，不同字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)The data in the table was mean ± standard error for three repetitions, and the different letters indicated significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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表 5 香蕉抗枯萎病株系内生菌盆栽试验拮抗和促生效果
Table 5 Antagonist and growth promotion effects of endophyte of banana fusarium resistant strain in pot experiment
处理
Treatment根长1)/cm
Root length株高1)/cm
Plant height根体积1)/cm3
Root volume假茎周长1)/mm
Pseudostem circumference病情指数
Disease index防治效果/%
Control effectCK1 12.52±2.24d 22.98±1.55a 10.22±0.89b 3.97±0.48b 100 0 CK2 13.01±1.54d 23.52±1.69a 8.53±0.96b 4.83±0.50ab 0 XG1028 22.87±0.52a 28.43±1.90a 16.69±0.47a 4.94±0.47ab 25.00 75.00 XQJ0301 13.66±2.63d 26.06±0.55a 14.78±2.39a 5.99±0.45a 16.67 83.33 XG1028+XQJ0301 11.39±1.42d 22.35±2.17a 9.68±1.98b 4.77±0.45ab 16.67 83.33 XG0302 15.09±1.75cd 22.55±2.72a 9.56±0.89b 3.85±0.57b 33.33 66.67 XG0103 11.31±1.05d 25.17±1.28a 9.05±0.69b 5.47±0.5ab 16.67 83.33 XJJ0205 17.74±1.40abc 25.08±1.64a 9.23±0.90b 5.43±0.35ab 41.67 58.33 XG0103+XJJ0205 16.70±1.82bcd 22.82±2.48a 8.68±1.08b 4.35±0.73ab 25.00 75.00 1)表中数据为3次重复的平均值±标准误，同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)The data in the table was mean ± standard error for three repetitions, and the different letters at the same column indicated significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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表 6 香蕉抗枯萎病株系内生菌大田试验抗病及促生效果
Table 6 Antagonist and growth promotion effects of endophyte of banana fusarium resistant strain in field experiment
处理
Treatment株高1)/m
Plant height假茎周长1)/mm
Pseudostem circumference病情指数
Disease index防治效果/%
Control effectCK 2.47±0.02b 67.55±0.26c 74.44 25.56 XG1028 2.64±0.02a 70.00±0.41a 25.58 74.42 XQJ0301 2.59±0.03a 69.11±0.46ab 24.86 75.14 XG0103 2.64±0.02a 68.19±0.46bc 28.36 71.64 1)表中数据为3次重复的平均值±标准误，同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1)The data in the table was mean ± standard error for three repetitions, and the different letters at the same column indicated significant differences (P<0.05，Duncan’s method)
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