Simulation and verification for obstacle avoidance path tracking of unmanned agricultural machinery
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摘要:目的
为便于验证无人驾驶农机避障路径跟踪的效果，减少实际无人农机试验次数与消耗，设计一种无人驾驶农机避障路径跟踪仿真验证方法，构建一个仿真验证应用系统。
方法以无人农机为基础，集成真实复杂地形环境仿真、实际作业农机仿真和路径规划算法植入，构建一个一体化仿真验证应用系统。基于三维SLAM技术，采集环境点云数据，实现农田地形环境仿真建模，构建阿克曼转向机械结构的农机仿真建模，提出一种基于农机动力学约束的TEB局部路径规划算法；在仿真验证应用系统中实现路径规划跟踪及避障，并通过多次测试验证该算法的有效性。
结果避障路径跟踪有效性对比测试和避障路径跟踪平顺性验证测试结果表明，无人农机行驶过程中可有效动态避障，最短有效避障距离为4.1 m。路径跟踪控制效果良好，障碍物距离大于5.0 m时，可控平均误差≤0.4305 m，均方根误差≤0.3151 m；障碍物距离在4.5~5.0 m时，可控误差均值≤1.3538 m，均方根误差≤1.6126 m。
结论本文提出的改进TEB算法具有较强的作业能力以及较高的作业精度，满足农业机械导航避障路径跟踪仿真验证的需求，该算法可应用于无人农机在实际农田环境的避障路径跟踪。该应用系统易于扩充，为精准农业中针对各种复杂作业环境的农机运作状态的优化设计研究提供基础。
Abstract:ObjectiveIn order to facilitate the verification of the effectiveness of obstacle avoidance path tracking for unmanned agricultural machinery, reduce the number of actual unmanned agricultural machine tests and consumables, a simulation verification method for obstacle avoidance path tracking for unmanned agricultural machinery was designed, and a simulation verification application system was constructed.
MethodBased on unmanned agricultural machinery, an integrated simulation and verification application system was constructed by integrating real complex terrain environment simulation, actual operation agricultural machinery simulation, and path planning algorithm implantation. Based on three-dimensional SLAM technology, environmental point cloud data was collected to achieve simulation modeling of farmland terrain environment. A simulation modeling of agricultural machinery was completed using unmanned agricultural machinery combined with ackermann steering mechanical structure. A TEB local path planning algorithm based on agricultural machinery dynamics constraints was proposed. Path planning tracking and obstacle avoidance were implemented in the simulation verification application system, and the effectiveness of the algorithm was verified through multiple tests.
ResultThe comparison test of obstacle avoidance path tracking effectiveness and the verification test of obstacle avoidance path tracking smoothness showed that the unmanned agricultural machine could effectively avoid obstacles dynamically during driving, with the shortest effective obstacle avoidance distance of 4.1 m. The path tracking control effect was good. When the distance between obstacles was greater than 5.0 m, the controllable average error was within 0.430 5 m, and the root mean square error was within 0.315 1 m. When the distance between obstacles was 4.5−5.0 m, the controllable average error was within 1.353 8 m, and the root mean square error was within 1.612 6 m.
ConclusionThe improved TEB algorithm proposed in this article has strong operational capability and high operational accuracy, which meets the needs of simulation verification for obstacle avoidance path tracking in agricultural machinery navigation. This algorithm can be applied to obstacle avoidance path tracking of unmanned agricultural machinery in actual farmland environments in the future. This application system is easy to expand and can provide a foundation for the optimization design research of agricultural machinery operation status in precision agriculture for various complex working environments.
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碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)已构成全球公共卫生威胁[1-2] ，其主要耐药机制是携带碳青霉烯酶基因blaKPC，其中，在临床CRKP中，Klebsiella pneumoniae carbapenemase-2 (KPC-2)亚型最为普遍，可以水解所有已知的β−内酰胺类药物，包括碳青霉烯类[3]。blaKPC-2基因通常编码在可转移质粒的转座子结构中，特别是在肠杆菌科细菌中广泛流行的IncFII质粒，这使得blaKPC-2能够从克雷伯菌传播到其他肠杆菌科细菌，包括大肠埃希菌Escherichia coli[4]。
有关研究发现，大多数产KPC-2肺炎克雷伯菌菌株对美罗培南高度耐药(8≤MIC≤256 mg/L)[5-6]。然而，在部分对美罗培南高度耐药的产KPC-2肺炎克雷伯菌中，当携带blaKPC-2的质粒从肺炎克雷伯菌供体菌转移到大肠埃希菌受体中时，获得的携带blaKPC-2质粒的接合子对美罗培南表现出低水平耐药(MIC<1 mg/L)[7-9]。值得注意的是，这些携带blaKPC-2质粒的复制子呈现多样性，包括IncFII、IncFIB和IncHIB等，同时，这些携带blaKPC-2质粒的肺炎克雷伯菌供体菌的多位点序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)类型也呈现多样性，包括ST11、ST76、ST147和ST273等，这暗示了肺炎克雷伯菌中携带blaKPC-2质粒转移至大肠埃希菌后介导美罗培南低水平耐药的现象较为普遍。另外，还发现产KPC大肠埃希菌野生菌对美罗培南具有高度耐药性(MIC≥8 mg/L)，然而，其携带blaKPC-2质粒转移至美罗培南敏感的大肠埃希菌受体菌后，携带blaKPC-2质粒仍然在大肠埃希菌中介导美罗培南低水平耐药(MIC<1 mg/L)[10-12]。此外，还发现产气单胞菌菌株中携带blaKPC-2的IncP-6质粒转移至大肠埃希菌DH10B受体菌后，该质粒介导美罗培南低水平耐药(MIC=0.125 mg/L)[13]。然而，大肠埃希菌质粒携带的blaKPC-2基因介导对美罗培南低水平耐药的潜在机制仍不清楚。
华南农业大学兽医药理与毒理学课题组前期报道了一株分离自青海湖野生候鸟且对美罗培南耐药(MIC=64 mg/L)的ST11 CRKP(21QH43K)，其携带blaKPC-2基因，位于可转移的IncFII质粒(p21QH43K-KPC)上[3]。将该质粒通过接合转移的方式转入大肠埃希菌EC600中，发现接合子EC600/p21QH43K-KPC对美罗培南表现出低水平耐药(MIC=0.25 mg/L)。在临床上这类低水平碳青霉烯耐药大肠埃希菌无法被常规耐药筛查(临床折点通常设定阈值≥2 mg/L)有效识别而易被忽略，其可能通过水平基因转移持续释放blaKPC-2等关键耐药基因。因此，为预防这一重要耐药基因向其他菌种传播，肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶基因调控低水平耐碳青霉烯类抗生素的分子机制亟待进一步研究。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
本研究使用的所有菌株列于表1。CRKP菌株21QH43K分离自2020年青海省青海湖候鸟粪便样品，经二、三代混合测序，获得携带blaKPC-2基因的IncFII质粒p21QH43K-KPC完整序列，通过接合转移获得接合子EC600/p21QH43K-KPC。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922，大肠埃希菌标准菌株：EC600和MG1655，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
表 1 本研究使用的菌株和质粒Table 1. Strains and plasmids used in this study类型 Type 名称 Name 用途 Purpose 菌株 Strain 21QH43K 临床菌 21QH43K ATCC700603 肺炎克雷伯菌工程菌 ∆ompR ompR基因敲除菌 ∆ompC ompC基因敲除菌 ∆ompF ompF基因敲除菌 ∆blaKPC-2 blaKPC-2基因敲除菌 ∆ltrA ltrA基因敲除菌 ∆iron iron基因敲除菌 E. coli DH5α 用于构建质粒的菌株 WM3064 用于基因敲除的工程菌 E. coli 600 用于接合转移的工程菌 MG1655 用于接合转移的工程菌 BL21 用于蛋白表达的菌株 质粒 Plasmid pSGKP-tet 用于基因敲除的工程质粒 pCasKP-APR 用于基因敲除的工程质粒 pSZU-Apr 用于基因敲除的工程质粒 pluxCDABE 用于验证blaKPC基因启动子活性的工程质粒 pGEN-APR 用于克隆blaKPC基因的工程质粒 pET28a (+)-kan 用于OmpR蛋白表达的工程质粒 1.1.2 试剂与药品
细菌DNA提取试剂盒和同源重组酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；LB肉汤/琼脂培养基、水解酪蛋白胨(Mueller Hinton, MH)肉汤/琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，购自广州环凯微生物科技有限公司；DNA marker DL2000和Premix Taq为TaKaRa公司产品；受试药物美罗培南(Meropenem, MEM)、亚胺培南(Imipenem, IMP)、厄他培南(Ertapenem, ERT)、磷霉素(Fosfomycin, FOS)、阿米卡星(Amikacin, AMK)、头孢噻肟(Cefotaxime, CTX)、头孢西丁(Cefoxetine, FOX)、氨苄西林(Ampicillin, AMP)、头孢他啶(Ceftazidime, CAZ)、四环素(Tetracycline, TET)、氨曲南(Aztreonam, ATM)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、链霉素(Streptomycin, STR)、安普霉素(Apramycin, APR)、利福平(Rifampicin, RIF)购自赛默飞科技公司；L−阿拉伯糖购自默克Sigma公司；RNA提取试剂盒购自北京百奥创新科技有限公司；iScript cDNA合成试剂盒购自Bio-Rad公司；试验所用引物列于表2。
表 2 本研究使用的PCR引物Table 2. PCR primers used in this study试验 Test 引物 Primer 引物序列 (5'→3') Primer sequence RT-qPCR KPC-qPCR-F ccactgggcgcgcacctatt KPC-qPCR-R tgttaggcgcccgggtgtag 16S-F cctacgggaggcagcag 16S-R attaccgcggctgctgg 敲除blaKPC-2 KPC-N20-F ttgggcgtcaacgggcagtagttttagagctagaaatagcaagtt Knock out blaKPC-2 KPC-N20-R tactgcccgttgacgcccaaactagtattatacctaggactgagc KPC-500-F1 ttttttgatatcgaattcctgcagcccggattgaaaccatgaccgaac KPC-500-R1 gcattgaccttggcatcttc KPC-500-F2 gaagatgccaaggtcaatgcggtatccatcgcgtacacac KPC-500-R2 ggccgctctagaagtagtggatccccccgtcaagatctacaaccacagc pSGKPtestF tctcgtttggattgcaactg pSGKPtestR tgcttccggctcgtatgttg 敲除ompR ompR-N20-F agtggaccgtatcgtaggccgttttagagctagaaatagcaagtt Knock out ompR ompR-N20-R ggcctacgatacggtccactactagtattatacctaggactgagc ompR-500-F1 atatcgaattcctgcagcccgcattaacataccagctcgc ompR-500-R1 gtgcgcattatcaaacagac ompR-500-F2 gtctgtttgataatgcgcacctcatcgtcaccttgctg ompR-500-R2 ctagaagtagtggatcccccgttcgagatcgaccaacg pSGKPtestF tctcgtttggattgcaactg pSGKPtestR tgcttccggctcgtatgttg ompR基因回补 ompR-F gcggatcccggtaccaagcttgacaccctcgttgattccctttgtct ompR gene complementation ompR-R agctaactcacattaattgcgttgcgccgtacgggcaaatgaacttc pGEN-F ggtgtcaagcttggtacc pGEN-R gcgcaacgcaattaatgtga pGENtestF ggaacgaagccgccttaacc pGENtestR cttggagcgaactgcctacc 1.1.3 主要仪器
HHVE-50高压灭菌锅，日本HIRAYMA公司产品；AE150电子分析天平，瑞士METTLER公司产品；超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；涡旋振荡仪，德国艾卡公司产品；恒温培养箱，上海申贤恒温设备厂产品；离心机、微量移液器和Labcycler PCR扩增仪，德国Eppendorf公司产品；酶标定量测定仪，美国贝克曼公司产品；NanoDrop OneC微量紫外可见分光光度计，赛默飞科技公司产品。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种复苏
从冰箱中取出所需菌株，用移液枪吸取10 μL菌液，将其接种于900 μL新鲜的LB肉汤中，37 ℃、180 r/min振荡培养8 h。将复苏的菌株以四区划线法接种于麦康凯琼脂培养基，于37 ℃恒温箱过夜培养。次日，从麦康凯琼脂培养基上挑取荷包蛋样的单个菌落，并连续传代3次，以保证菌体的活力达到正常水平。
1.2.2 微量肉汤稀释法药敏试验
采用微量肉汤稀释法测定大肠埃希菌对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、磷霉素、阿米卡星、头孢噻肟、头孢西丁、氨苄西林、头孢他啶、四环素、氨曲南和环丙沙星的MIC，按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2023年标准[14]执行。以大肠埃希菌ATCC 25922为质量控制菌株。
1.2.3 接合转移试验
以大肠埃希菌MG1655作为受体菌，将孵育至对数生长期的供体菌和受体菌在LB肉汤中按体积比1∶4混合均匀，37 ℃孵育4 h后，接种于含美罗培南(0.25 mg/L)和链霉素(
1000 mg/L)的LB琼脂中，37 ℃培养过夜。挑取疑似接合子，通过PCR扩增测序证实接合子是否受到污染和blaKPC-2基因是否存在[15]。1.2.4 EZ-Tn5转座子突变文库的构建
使用EZ-Tn5转座酶系统[16]创建EC600/p21QH43K-KPC染色体突变文库。将携带EZ-Tn5的质粒pCat-APR通过接合转移的方式接合到EC600/p21QH43K-KPC中，获得突变文库，并将所有突变文库涂布于添加50 mg/L安普霉素的LB琼脂板上，37 ℃培养过夜，然后把琼脂板上的单菌接种到2 mg/L美罗培南药板上，37 ℃培养过夜，把琼脂板上的单菌保存于−20 ℃冰箱中备用。
1.2.5 大肠埃希菌缺失株和回补株的构建
所有大肠埃希菌的基因敲除试验都是通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑方法[17]产生的。简单地说，将设计好的sgRNA克隆到pSGKP质粒上，利用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)进行融合PCR扩增目的基因的同源臂；将质粒pSGKP-sgRNA及其匹配的同源臂电转化到含有pCas-kp的大肠埃希菌感受态细胞中，并在添加l −阿拉伯糖质量分数为0.2%的LB中培养；用安普霉素和利福平在30 ℃下选择转化子，并进行DNA测序验证；最后，用质量分数为5%的蔗糖溶液在42 ℃下固化质粒。
以EC600/p21QH43K-KPC为模板，扩增ompR连同其启动子基因片段。以pGEN质粒为载体，在Sal I酶切位点处进行反向扩增，通过同源重组酶将反向扩增的载体和ompR连同其启动子基因片段进行同源重组，提取质粒，进行Sanger测序确认，最终质粒命名为pGEN-ompR，把质粒pGEN-ompR以电转的方式转入大肠埃希菌EC600ΔompR/p21QH43K-KPC，最终获得ompR基因回补株EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC。
1.2.6 生长曲线测定
将培养至对数期(D600 nm=0.50)的目标菌株在LB肉汤中稀释至D600 nm=0.05~0.10，在96孔板中每孔加入200 µL稀释后的菌液，每个目标菌株设置3个重复，在37 ℃下孵育。每1 h测量1次菌液D600 nm，持续12 h。
1.2.7 全基因组测序(WGS)
基因组DNA文库的构建与序列测定使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明，提取各处理组的大肠埃希菌分离株的基因组DNA；通过浓度测定和琼脂糖凝胶电泳，初步质检合格后，构建Illumina(2×250 bp)文库，利用Illumina Hisseq平台进行测序，下机数据经质控和去除接头后运用SPAdesv3.6.2对原始数据进行拼接，拼接后的数据使用Quast软件进行质控。将拼接成功的序列用Mauve、Eazyfig软件进行基因组对比分析。
1.2.8 转录组测序分析
大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC和EC600ΔompR/p21QH43K-KPC通过0.064 mg/L的美罗培南LB肉汤富培养至对数生长期后，使用OMEGA试剂盒提取EC600/p21QH43K-KPC和EC600ΔompR/p21QH43K-KPC菌株中的总RNA。用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的纯度和完整性，并用Qubit 2.0定量RNA浓度。构建转录组测序文库，使用IlluminaHiSeq平台进行测序。将原始测序Reads映射到大肠埃希菌EC600的参考基因组(Accession登录号：PRJNA1051772)上。使用NGS QC Toolkit软件针对fastq格式的高通量测序原始数据(Raw reads)进行质控。使用DESeq R package的estimate Size Factors函数进行数据标准化，并使用nbinomTest函数计算差异比较的P值和差异倍数(Fold change，FC)。针对P<0.05且log2 FC>1.5的差异基因，使用微生信分析平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)比较试验组和对照组的差异表达基因，对每个比较组合的差异基因进行数目统计，制作成火山图，并进行GO、KEGG分析。
1.2.9 RT-qPCR试验
采用紫外可见分光光度计对大肠埃希菌菌株EC600/p21QH43K-KPC、EC600ΔompR/p21QH43K-KPCEC600/p21QH43K-KPC和EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC的总RNA进行定量，并使用iScript cDNA合成试剂盒将1 μg的总RNA进行反转录合成cDNA。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测系统进行cDNA的PCR扩增，并采用特异性引物，以16S rRNA表达为内参进行归一化，计算各基因的相对表达量。
1.2.10 数据分析
利用 GraphPad Prism 8.0 软件中的Student’s t-test统计学方法分析数据并作图。
2. 结果与分析
2.1 基于转座子突变文库筛选获得目标基因ompR
为了验证p21QH43K-KPC在其他大肠埃希菌中是否有相同的耐药表型趋势，我们通过接合转移把质粒p21QH43K-KPC转移到大肠埃希菌MG1655，发现接合子MG1655/p21QH43K-KPC对美罗培南同样表现出低水平耐药(MIC=0.250 mg/L) (表3)。然而，前期研究[3]发现，通过接合转移把质粒p21QH43K-KPC转移到肺炎克雷伯菌ATCC 700603中，ATCC 700603/p21QH43K-KPC对美罗培南表现出中等水平耐药(MIC=4.000 mg/L)，与大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC相比，质粒p21QH43K-KPC对美罗培南的耐药性增加了31倍。
表 3 携带blaKPC-2的质粒p21QH43K-KPC在不同遗传背景菌株中介导对碳青霉烯类药物的耐药表型Table 3. Carbapenems resistance conferred by blaKPC-2-carrrying plasmid p21QH43K-KPC in strains with different genetic backgrounds菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration 美罗培南 Meropenem 亚胺培南 Imipenem 厄他培南 Ertapenem 21QH43K 64.000 16.000 >64.000 ATCC 700603 0.064 0.032 0.064 ATCC 700603/p21QH43K-KPC 4.000 4.000 8.000 EC600 0.016 0.125 0.008 EC600/p21QH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 MG1655 0.016 0.125 0.002 MG1655/p21QH43K 0.125 0.500 0.250 EC600/p21QH43K-KPC-130 8.000 4.000 4.000 为了探究质粒p21QH43K-KPC携带的blaKPC-2在大肠埃希菌中介导美罗培南低水平耐药的调控机制，我们利用EZ-Tn5转座子系统构建了EC600/p21QH43K-KPC突变文库(图1)。随机选取
5000 个突变体，在添加2 mg/L美罗培南的LB琼脂板上筛选对美罗培南耐药表型增加的突变子。最终仅获得1株对美罗培南耐药性增强的突变体EC600/p21QH43K-KPC-130(MIC=8.000 mg/L) (表3)，突变子对碳青霉烯类药物美罗培南、亚胺培南和厄他培南均呈现中等强度的耐药水平，且与EC600/p21QH43K-KPC相比，对美罗培南、亚胺培南和厄他培南的MIC分别增加了63、7和15倍。通过对EC600/p21QH43K-KPC-130和EC600/p21QH43K-KPC进行WGS和序列比对分析发现，突变子的染色体基因ompR(全局转录调控因子)中存在EZ-Tn5转座子插入，同时还发现染色体基因iron[编码Fe(III)指示转运系统渗透酶蛋白]和质粒基因ltrA(编码逆转录型RNA定向DNA聚合酶，即细菌逆转录酶)存在非同义的单核苷酸突变。![图 1 基于转座子突变文库筛选目标基因]()
图 1 基于转座子突变文库筛选目标基因Figure 1. Screening of the target gene based on transposon mutation library2.2 ompR基因缺失增加blaKPC-2介导的碳青霉烯类药物耐药水平
为了确定ompR、ltrA和iron基因是否影响大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的耐药水平，我们在EC600/p21QH43K-KPC和EC600中构建了ltrA、ompR和iron基因缺失菌株。如表4所示，发现ompR缺失菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物美罗培南、亚胺培南和厄他培南均呈现中/高等强度的耐药水平，与菌株EC600/p21QH43K-KPC相比，即使ompR基因缺失轻微抑制了EC600ΔompR/p21QH43K-KPC的生长(数据未展示)，对美罗培南、亚胺培南和厄他培南的MIC分别增加63、31和127倍。通过回补试验发现，ompR基因缺失的回补菌株EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC可以部分恢复对碳青霉烯类药物的耐药水平。值得注意的是，在大肠埃希菌菌株EC600中，ompR缺失对美罗培南和厄他培南的MIC呈现轻微增加，分别增加3和7倍。我们进一步检测了EC600ΔompR/p21QH43K-KPC对其他种类抗菌药的耐药表型，与EC600/p21QH43K-KPC相比，ompR缺失导致对环丙沙星、头孢西丁和头孢他啶的MIC增加3倍(表5)。其次，相比之下，ltrA和iron基因敲除菌均未改变菌株EC600/p21QH43K和EC600对美罗培南、亚胺培南和厄他培南的MIC。这些数据表明，ompR基因缺失导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物耐药水平大幅度增加，达到中高等水平耐药。
表 4 ompR、iron和ltrA基因缺失后大肠埃希菌对受试抗菌药的耐药性Table 4. Resistance of Escherichia coli to the tested drugs after the deletion of the ompR, iron and ltrA genes菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration 美罗培南 Meropenem 亚胺培南 Imipenem 厄他培南 Ertapenem EC600/p21QH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 EC600ΔompR/p21QH43K-KPC 8.000 16.000 32.000 EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC 1.000 0.250 0.500 EC600 0.016 0.125 0.008 EC600ΔompR 0.064 0.125 0.064 EC600Δiron/p21QH43K-KPC 0.250 0.500 0.250 EC600ΔltrA/p21QH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 表 5 ompR基因缺失后大肠埃希菌对受试抗菌药的耐药性1)Table 5. Resistance of Escherichia coli to the tested drugs after the deletion of the ompR gene菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration FOS AMK CTX FOX AMP CAZ TET ATM CIP EC600/p21QH43K-KPC 256 >256 16 16 >256 64 1 16 0.032 EC600ΔompR/p21QH43K-KPC 8 >256 16 64 >256 256 1 32 0.125 EC600ΔompR::ompR/p21QH43K-KPC >256 >256 32 64 >256 128 1 64 0.125 1) FOS：磷霉素，AMK：阿米卡星，CTX：头孢噻肟，FOX：头孢西丁，AMP：氨苄西林，CAZ：头孢他啶，TET：四环素，ATM：氨曲南，CIP：环丙沙星。
1) FOS: Fosfomycin, AMK: Amikacin, CTX: Cefotaxime, FOX: Cefoxetine, AMP: Ampicillin, CAZ: Ceftazidime, TET: Tetracycline, ATM: Aztreonam, CIP: Ciprofloxacin.2.3 ompR缺失影响大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱
考虑ompR基因是全局转录调控因子，我们进而探究了ompR缺失对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱的影响。转录组测序结果分析显示，与大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC相比，EC600ΔompR/p21QH43K-KPC在转录水平上存在明显差异，有526个基因存在显著差异表达，其中231个基因显著上调，295个基因显著下调，说明敲除ompR基因对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱产生了影响(图2a)。通过对差异表达基因进行GO分类分析，各类均分析排名前十的生物学过程，在生物学过程(Biological process, BP)部分，主要参与跨膜运输、呼吸电子传递链、电子传递链、氢离子跨膜运输、有/无氧呼吸等。在细胞组成(Cellular component, CC)部分，主要分布在细胞膜及胞内细胞器。在分子功能(Molecular function, MF)部分，基因主要富集在蛋白结合、氧化还原酶、跨膜转运蛋白、铁离子结合蛋白、血红素结合蛋白、NADH脱氢酶活性等通路。将差异显著基因进一步进行KEGG分析，差异基因主要富集在不同环境中的氧化磷酸化、TCA循环、ABC转运、群体感应及铁载体群非核糖体肽的生物合成相关通路。此外，氨基酸代谢相关基因(nspD、nirC、dppC、dppB、livJ和bhsA)和呼吸链相关基因(bioF、lldD、bioB和sucC)的mRNA水平上调较为明显，为6.50~12.40倍，而调控因子(csgD、gadA、gadB和gadC)、膜蛋白相关基因(yhiM、ompC、ompF、asr)、糖酵解基因(hyi)和生物胺合成基因(cadA) mRNA水平下降较为明显，为26.20~62.52倍(图2b)，其中ompC和ompF基因的转录表达水平分别下调62.52和54.38倍。然而值得注意的是，转录组测序结果显示ompR基因缺失对blaKPC-2基因的mRNA水平无明显影响，这一结果也进一步通过RT-qPCR得到验证(图2c)。
![图 2 ompR缺失对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱的影响]()
图 2 ompR缺失对大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱的影响a：差异表达基因火山图，由t检验确定相对于EC600/p21QH43K菌株的差异显著性； b：上调和下调的Top 10显著差异表达基因；c：采用RT-qPCR检测blaKPC-2的转录本水平，该基因在EC600/p21QH43K菌株中的转录水平设为1, 误差条表示3个独立试验的标准差。Figure 2. Effect of ompR deletion on the transcriptome profile in stain EC600/p21QH43K-KPCa: Volcano map of differentially expressed genes, the significance of the difference relative to the EC600/p21QH43K strain was determined by t-test; b: Top 10 up- and down-regulated significantly differentially expressed genes; c: The transcript levels of blaKPC-2 determined by RT-qPCR, the transcriptional level of this gene in the EC600/p21QH43K strain was set as 1, and the error bars represent the standard deviation of three independent experiments.考虑到外膜孔蛋白(OMPs)是革兰阴性菌的独特结构，它形成亲水性开放通道，允许小分子量的亲水性抗生素扩散到细胞中[18-19]。ompR缺失导致下调的OMP相关的基因ompC和ompF可能是导致细菌耐药性异常的原因之一。因此，我们进一步研究了ompC和ompF基因的缺失是否影响大肠埃希菌EC600/ p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的耐药水平。结果发现与EC600/p21QH43K-KPC相比，ompC/ompF基因缺失菌株EC600ΔompC/p21QH43K-KPC和EC600ΔompF/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的MIC升高1~3倍(表6)，但仍低于ompR基因缺失菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物的MIC。ompC和ompF基因缺失导致大肠埃希菌EC600菌株对碳青霉烯类药物的MIC几乎无明显影响。这些结果表明尽管ompR基因缺失导致ompC和ompF转录表达水平大幅度上调，但其对ompR基因缺失引起菌株EC600/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物呈现的中高水平耐药贡献较低。这暗示了ompR基因缺失导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物耐药水平大幅度增加的调控机制仍有待进一步研究。
表 6 ompC/ompF基因缺失后大肠埃希菌对碳青霉烯类药物的耐药性Table 6. Carbapenems resistance of Escherichia coli after the deletion of the ompC/ompF gene菌株 Strain 最小抑菌浓度/(mg·L−1) Minimal inhibitory concentration 美罗培南 Meropenem 亚胺培南 Imipenem 厄他培南 Ertapenem EC600/pQH43K-KPC 0.125 0.500 0.250 EC600ΔompC/p21QH43K-KPC 0.500 1.000 0.500 EC600ΔompF/p21QH43K-KPC 0.500 1.000 0.500 EC600 0.016 0.125 0.008 EC600ΔompC 0.016 0.064 0.008 EC600ΔompF 0.016 0.250 0.008 3. 讨论与结论
耐碳青霉烯类肠杆菌科的出现和传播对公众健康构成严重威胁[20]。尽管产碳青霉烯酶是导致菌株对碳青霉烯类药物耐药的重要机制，但携带同一种碳青霉烯酶基因在不同菌种、甚至同一菌种不同菌株中介导的碳青霉烯类药物耐药水平往往存在差异。因而，肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶基因调控的分子机制有待进一步研究。本研究中，我们发现大肠埃希菌染色体中全局调控因子OmpR参与调控IncFII质粒p21QH43K-KPC编码的blaKPC-2基因介导碳青霉烯类药物低水平耐药。这一结果一定程度上解释了携带blaKPC-2质粒转移至大肠埃希菌后介导碳青霉烯类药物低水平耐药的原因。
我们通过构建大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC突变文库并结合基因敲除技术，将染色体基因ompR与质粒编码基因blaKPC-2介导的碳青霉烯类药物低水平耐药相联系。OmpR是一种DNA结合蛋白，可被激酶EnvZ磷酸化，EnvZ-OmpR双组分系统参与协调细菌对环境因素刺激的转录反应，包括渗透压应激、对生长条件的反应[21]、运动性[22]、细胞内存活能力[23]、毒力[24]以及抗生素耐药性[25]。先前的研究表明，OmpR通过调节ompC和ompF的外膜孔蛋白基因影响对抗生素耐药性，其作用于胞膜通透性以限制细胞内抗生素的进入[26]。事实上，我们也发现ompC/ompF基因缺失导致菌株EC600/p21QH43K-KPC对碳青霉烯类药物耐药水平略有增加，尽管在转录水平上ompR基因的缺失显著降低了ompC和ompF的表达量。这暗示ompR基因缺失导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物的中高等耐药水平，似乎与ompR对ompC和ompF的调节关系较小。鉴于OmpR为转录调控因子，我们进一步探究了ompR是否会调控blaKPC-2基因的转录表达。然而，转录组测序以及RT-qPCR检测均表明ompR基因缺失对blaKPC-2基因的mRNA水平无明显影响。考虑到ompR缺失影响了大肠埃希菌EC600/p21QH43K-KPC转录组谱，ompR参与blaKPC-2基因的调控机制较为复杂。ompR缺失是如何导致blaKPC-2基因在菌株EC600ΔompR/p21QH43K-KPC中介导对碳青霉烯类药物的耐药水平大幅度增加仍有待进一步探究。
前期细菌耐药性调查研究表明，blaKPC-2基因具有较强的细菌宿主偏好性，其主要的宿主菌为ST11 CRKP，而在大肠埃希菌中该基因的流行率较低[27]。最近的一项全国性碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌监测研究也发现，76.5%的CRKP携带blaKPC-2，而大肠埃希菌中携带blaKPC-2的比例仅为3.2%[28]。相关报道还显示产KPC-2的肺炎克雷伯菌菌株常常对美罗培南呈现高水平耐药，然而，携带blaKPC-2的质粒从肺炎克雷伯菌转移至大肠埃希菌后，常常介导美罗培南低水平耐药[7-9]。考虑到在碳青霉烯耐药性调查中，研究者常用添加1 或2 mg/L美罗培南的麦康凯琼脂板筛选碳青霉烯耐药菌[29] ，进而筛选碳青霉烯耐药基因，包括blaKPC-2。这暗示blaKPC-2在大肠埃希菌中的真实流行率可能被低估了。另一方面，这也表明转录调控因子OmpR可能在碳青霉烯药物选择压力下，抵御blaKPC-2在大肠埃希菌中的传播，而ompR的基因缺失或突变可能是逃避这种作用的关键因素。
综上所述，我们发现耐美罗培南肺炎克雷伯菌IncFII质粒p21QH43K-KPC编码的blaKPC-2基因在大肠埃希菌中介导碳青霉烯类药物的低水平耐药，这与转录调控因子OmpR对blaKPC-2基因的调控有关。我们的结果为解析大肠埃希菌染色体转录调控因子OmpR参与调控质粒编码的碳青霉烯酶基因提供了重要的见解。
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图 1 3D激光雷达测量目标示意图
P为测量点的坐标； OZ为雷达信号接收端坐标原点； $\alpha $为方位角； $\theta $为仰角
Figure 1. Schematic diagram of 3D LiDAR measurement target
P is the coordinate of the measurement point; OZ is the coordinate origin of the radar signal receiving end; $\alpha $ is the azimuth angle; $\theta $ is the elevation angle
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图 3 阿克曼结构转向示意图
α为左前轮转向角；β为右前轮转向角；K为后轮两轮距； L为前后轮旋转轴轴距；R为转弯半径；vl为左后轮线速度；vr为右后轮线速度
Figure 3. Schematic diagram of ackermann structure turning
α is the left front wheel steering angle; β is the right front wheel steering angle; K is the wheelbase of the two rear wheels; L is the wheelbase of rotation axis for front and rear wheel; R is the turning radius; vl is the linear speed of the left rear wheel; vr is the linear speed of the right rear wheel
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图 6 导航过程示意图
全局路径以紫色曲线表示，局部路径规划以农机行驶时沿实际运动方向的绿色短线表示
Figure 6. Navigation process diagram
The global path is represented by a purple curve, while the local path planning is represented by a green short line along the actual movement direction of theagricultural machinery during operation
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图 8 避障路径规划
图中紫色曲线为农机自起点至终点的全局路径；绿色曲线为局部路径修正的全局路径
Figure 8. Path planning of obstacle avoidance
The purple curve in the figure is the global path planned from the starting point to the end point of the agricultural maehinery; The green curve is the global path corrected by the local path
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