Germplasm resource screening of resistance against bacterial blight and identification of resistance gene in rice
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摘要:目的
筛选抗水稻白叶枯病V和IX型菌的水稻品种。
方法以97个收集自热带亚热带地区的抗褐飞虱水稻品种为待测样品，水稻白叶枯病V、IX型菌为菌种。用剪叶接种法鉴定水稻在苗期和成株期的抗白叶枯病能力并划分抗性等级。对抗性表现优异的品种构建定位群体，并进行基因定位及克隆。
结果筛选出苗期抗V型菌的水稻品种20个，成株期8个，2个时期均表现为中抗及以上的品种4个；苗期抗IX型菌的水稻品种34个，成株期9个，2个时期均表现为中抗及以上的品种1个。其中，供试水稻品种‘BX02’在2个时期对V型菌株抗性表现极佳。‘BX02’与‘9311’杂交构建的F2遗传群体，抗性位点被定位在5号染色体，极大似然函数值达到40.6，该区间包含已克隆的水稻抗白叶枯病V型菌xa5基因，序列扩增分析验证为白叶枯抗性基因xa5。
结论筛选出在2个时期均抗白叶枯病V型菌的水稻品种4个，抗IX型的水稻品种1个，为水稻抗白叶枯种质资源筛选提供了基础材料。
Abstract:ObjectiveThe purpose is to screen rice varieties with resistance to the V and IX pathotypes of Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo).
MethodNinety-seven brown planthopper resistant rice varieties collected from tropical and subtropical areas were surveyed against V and IX types of Xoo. The leaf-cutting inoculation method was used to identify the resistance level of rice varieties to bacterial blight at the seedling and adult stages. A mapping population was developed for a variety with excellent resistance performance, which was applied to map and clone the resistance genes.
ResultTwenty and eight rice varieties were detected to be resistant to V type at the seedling and adult stages respectively, and four varieties showed moderate or high resistance at both stages. Moreover, thirty-four and nine rice varieties were identified to be resistant to IX type at the seedling and adult stages respectively, and one variety showed moderate or high resistant level at both stages. Rice variety ‘BX02’ showed excellent resistance to V type of Xoo at both stages. Therefore, one F2 mapping population was developed by crossing ‘BX02’ with ‘9311’, and the resistance locus was identified on chromosome 5 with the logarithm of adds (LOD) score of 40.6. This mapping interval contained the cloned xa5 gene with resistance to V type of Xoo. Sequence amplification analysis confirmed that it was the bacterial blight resistance gene xa5.
ConclusionFour and one varieties were detected to be resistant to V and IX types of Xoo at both stages respectively, which provides materials for rice resistance breeding against the bacterial blight.
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Keywords:
- Rice germplasm /
- Rice bacterial blight /
- Gene mapping /
- xa5 /
- Resistance gene
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水稻白叶枯病是由水稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae侵染引起的一种严重危害水稻生长的细菌性病害，在我国各大稻区特别是华南双季稻作区严重泛滥[1]。白叶枯病发病一般自水稻叶尖开始，病斑沿叶脉蔓延并呈波纹状向两侧扩展，发病初期病斑呈水渍状，发病中后期侵染部位的叶片由暗绿色变为最后的灰白色，并呈现干枯脱水状，故称白叶枯[2]。白叶枯发病迅速，环境适宜条件下，病斑每日可增长2~6 cm，一片叶子仅2周就会完全干枯。白叶枯病发作会造成水稻产量下降20%，不加管控时则会造成产量损失近半[3]，因此白叶枯病相关研究一直是水稻抗病的热门研究。前人的研究表明，水稻白叶枯病菌分为不同的致病型。方中达等[4]利用具有代表性的水稻品种‘IR26’‘Java14’‘南粳15’‘Tetep’和‘金刚30’鉴定了全国各病区收集到的835个水稻白叶枯病菌菌株，根据5个鉴别水稻寄主成株期的反应模式将中国的水稻白叶枯病分为7个致病型，北方稻区以I、II型水稻白叶枯病菌居多，而在南方稻区泛滥的则大多是IV型。以中国5个鉴别水稻为寄主，研究人员在2001和2005年分别鉴别出侵染能力极强的水稻白叶枯致病型VIII和IX型，其中，VIII型水稻白叶枯病菌在云南省被发现[5]，而IX型白叶枯病菌在广东省被发现，且5个鉴别水稻寄主都表现为感病[6]。2022年，广东省农业科学院利用中国5个经典鉴别水稻寄主、IR24以及15个抗病近等基因系，对954个分离的菌株进行致病型测定，在原有的9个类型基础上发现了4个未被报道的致病型，至此中国境内的水稻白叶枯致病型扩充至13个类型[7]。
水稻白叶枯致病菌极易变异，化学防治效果不佳且严重破坏环境[8]，因此研究和培育水稻抗性品种是最为经济、有效且环保的手段，而抗病基因的发掘是抗病育种成功的基础和关键[9]。截至2023年7月，研究人员已经在栽培稻及野生稻中发现了47个水稻白叶枯病抗性基因[10]，其中，显性基因31个、隐性基因16个，并且有17个基因已完成了克隆[11-12]。水稻白叶枯病抗性基因在水稻12条染色体上的分布不均匀，大部分抗性基因集中在第4和第11号染色体，而在第9和第10号染色体上并未发现水稻白叶枯抗性基因[13]。近些年来，关于水稻抗白叶枯病新基因定位与克隆的报道呈逐年下降的趋势。卢源达等[11]完成了Xa47(t)的克隆及生物信息学分析，这是一个典型的CC-NBS-LRR基因，被定位在第11号染色体27 kb的区段上。2020年，Chen等[12]在突变体品系‘H120’中发现的Xa46(t)，对中国所有致病型病菌均表现为抗性，通过‘H120’/‘CO39’和‘H120’/‘IR24’ 2个F2群体的QTL定位，将Xa46(t)定位在11号染色体侧翼标记RM26981和RM26984之间约65.34 kb的区段，认为LOC_Os11g37540是最有潜力的候选基因，且认为Xa46(t)与相邻区段的Xa23不完全相同。Xa45(t)是一个核苷酸聚比结构域样受体(Nucleotide oligomerization domain-like receptor，NLR)蛋白基因，被发现定位在O. nivara的第4号染色体上[14]。xa44(t)于2018年被韩国的Kim发现[15]，是1个新的具有BB抗性的隐性基因，定位在第11号染色体28.00—28.12 Mb。但由于水稻白叶枯菌繁殖迅速，能在较短时间内产生适应植物抗性基因的变异，病原菌的更新换代始终快人一步，所以寻找新的广谱抗源迫在眉睫。
本研究以华南双季稻作区常见的水稻白叶枯致病型V和IX型为供试菌株，从热带、亚热带地区收集的栽培稻种资源中筛选出高抗或中抗褐飞虱的97个材料为待测样品，分别测定它们在苗期、成株期对致病V型和IX型的抗性，并选择抗病表现好的品种进行抗性基因定位，以期发现水稻抗白叶枯病新基因并丰富水稻抗病种质资源。
1. 材料与方法
1.1 水稻材料
97份供试材料分别来自广西农业科学院和玉林农业科学院，收集自热带、亚热带地区的栽培种水稻。它们对褐飞虱具有高抗或中抗特性，分别是从约4000份栽培稻种资源中经抗虫鉴定获得。本研究使用的2种水稻白叶枯菌种采集自华南稻区水稻白叶枯病泛滥的稻田，经分离鉴定为水稻白叶枯致病V型和IX型。本研究使用的对照品种为粳稻品种‘日本晴’和籼稻品种‘9311’，试验中它们对V型菌的抗性分别为中抗、感；对IX型菌的抗性则分别为苗期中抗，成株期中感、感。
1.2 水稻白叶枯病菌种的培养
将水稻白叶枯病菌从−80 ℃超低温冰箱取出，在固体N培养基(牛肉膏 0.3 g、酵母膏 0.1 g、多聚蛋白胨 0.5 g、蔗糖 0.5 g、琼脂 1.5 g，加水定容至100 mL，高压灭菌)上活化复壮，然后将平板放置在28~30 ℃恒温培养箱再培养48 h，最后用无菌水洗脱菌株，将菌液调节为D600 nm=0.5，即可用于接种试验。
1.3 水稻白叶枯病接种与鉴定
本研究的水稻白叶枯病接种方式为剪叶法。接种前将剪刀高压灭菌，蘸取水稻白叶枯病菌悬浮液，选择长短均一的水稻叶片，剪去参试品种叶片叶尖2 cm，每株植株接种3片叶，每个品种接种5株，重复3次，以‘日本晴’为对照。接种20 d左右当参试品种的病情趋于稳定时，量取病斑长度，鉴定参试品种的抗病水平。水稻品种抗性评级参照蔡跃等[16]的方法分为7级：病斑长度≤0.20 cm，抗性等级为免疫；病斑长度为0.21~1.50 cm，抗性等级为高抗(HR)；病斑长度为1.51~3.00 cm，抗性等级为抗(R)；病斑长度为3.01~6.00 cm，抗性等级为中抗(MR)；病斑长度为6.01~9.00 cm，抗性等级为中感(MS)；病斑长度为9.01~20.00 cm，抗性等级为感(S)；病斑长度≥20.01 cm，抗性等级为高感(HS)。
水稻白叶枯病苗期鉴定在广西大学农学院作物学实验室进行，用营养基质填充满育苗杯(直径10 cm×高8 cm)，每个育苗杯中播种5粒发芽的水稻种子，将育苗杯放置在带水的托盘中并放入人工气候箱进行育苗(人工气候箱程序设置为光照16 h、黑暗8 h，每24 h为1个循环，温度设置为32 ℃，相对湿度为85%)。当水稻植株生长至4叶1心时进行接种，每株接种3片叶片，再放入人工气候箱至病情趋于稳定(人工气候箱程序设置为光照16 h、黑暗8 h，每24 h为1个循环，温度设置为28 ℃，相对湿度为90%)。
成株期鉴定用分蘖盛期的植株进行试验，当水稻生长至3叶1心后移栽至广西大学农场试验田，各品种分行种植，每行10株，株行距15 cm×25 cm，与早稻统一进行大田管理，及时施肥和防治病虫害。当全部待测水稻进入分蘖期(5月)时进行水稻白叶枯病菌接种，每个品种挑选长势均一的5株苗，每株挑选叶长接近的3片叶片进行接种。
1.4 褐飞虱抗虫鉴定与农艺性状考察
褐飞虱采集自广西南宁水稻大田的自然种群，并于温室种植的感虫品种‘9311’上繁殖。在塑料桶(直径29 cm×高20 cm)中播种已发芽的种子10粒，3叶期时剔除弱苗留至3株，待水稻长至分蘖期(约45 d)以150头/株的比例进行褐飞虱接虫，使用纱网袋罩住以防褐飞虱逃出，接虫20 d后进行统计和拍照。参照Qiu等[17]采用的评价标准统计参试品系的褐飞虱平均抗性等级，分1~9级，级别越低，抗性越强。
在广西大学农场试验田种植水稻品种‘BX02’和‘9311’，小区内植株排列为10行×10株，株行距15 cm×25 cm。待水稻成熟后，随机选取小区中间的8株进行农艺性状考察。株高为植株最高穗顶到地面的距离。收获成熟的植株充分晒干后在室内脱粒考种，考察千粒质量、粒宽、粒长和长宽比指标。
1.5 QTL定位
从97份材料中挑选出对水稻白叶枯致病V型抗性表现最好的品种‘BX02’，以其为父本，将其与‘9311’杂交，F1自交后构建F2作图群体，从133个F2植株中挑选极抗和极感各10个单株，提取基因组DNA后等量混合制备成抗、感DNA池。利用野生稻资源保护利用课题组保存的1560对SSR和InDel分子标记筛选亲本多态性标记，将筛选出来的标记进行抗、感DNA池的多态性标记筛选，获得与目标性状紧密连锁的引物。进而利用目标区段内抗、感DNA池和亲本间多态性的分子标记对133个F2单株的基因型进行检测，获得对应单株的基因型。使用软件QTL IciMapping对获得的F2群体表型和基因型的数据进行抗性位点检测，以阈值≥3.0 来判断群体是否存在抗性位点。
1.6 cDNA的获取和xa5的CDS序列扩增
以接种水稻白叶枯病菌14 d并显示抗性的亲本‘BX02’为材料，利用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒(诺唯赞)提取水稻叶片的总RNA，接着使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)试剂盒(诺唯赞)将mRNA反转录为cDNA。整个试验过程在无酶条件下进行，将制备的cDNA保存于−80 ℃条件下。
根据已报道的xa5序列信息设计CDS扩增引物(上游引物5′-ATGGCCACCTTCGAGCTCTA-3′，下游引物5′-TTATTGGCTGAGTAGTTTGGAATCAC-3′)，以‘BX02’的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR 在 ABI PRISM 7300 real-time PCR系统(Applied Biosystems)进行。PCR反应体系：上、下游引物各0.5 µL，2× Phanta Max Master Mix (诺唯赞)5 µL, cDNA 1 µL，ddH2O补至10 µL体系。反应程序为95 ℃预变性；33次循环(95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃延伸5 min。然后用2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞)在PCR产物的3′末端添加A，反应体系为5 µL PCR产物，5 µL Mix。PCR程序为72 ℃延伸20 min。利用pMDTM18-T Vector Cloning Kit 试剂盒(TaKaRa)与添加了A的PCR产物进行TA克隆，反应体系为pMDTM18-T Vector 1 µL、DNA 1 µL、Solution I 5 µL，ddH2O补至10 µL。16 ℃反应30 min后转化大肠埃希菌感受态细胞，用载体引物(M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)检测出阳性单菌落后送华大基因公司测序，测序引物为M13F和M13R。
1.7 数据处理
使用Microsoft Excel 2010软件进行数据记录及处理，使用SPSS 22 软件进行显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 水稻品种苗期、成株期白叶枯病抗性鉴定及抗性分布
对供试材料的病斑长度进行数据统计发现，不同水稻品种的不同时期2种菌株间抗性水平差异较大。本次试验成功接种V型菌的品种分别为苗期78个、成株期73个；成功接种IX型菌的品种分别为苗期77个、成株期73个。以‘日本晴’‘9311’作为对照品种，‘日本晴’抗性较好，接种V型菌后苗期和成株期的病斑长度分别为5.54和5.63 cm，IX型分别为5.56和7.29 cm；而‘9311’较感病，接种V型菌后病斑长度分别为10.25和18.03 cm，IX型分别为12.97和12.22 cm。对97个待测水稻品种进行白叶枯病抗性评级(图1)，发现2个时期接种V型菌后表现为中抗(MR)及以上的品种有4个，分别为‘BX02’‘BX12’‘BX44’和‘BX48’，病斑长度为0.99~5.38 cm，其中，‘BX02’和‘BX12’的成株期对IX型菌的抗性也在中抗以上，它们对2种致病型的抗性都较高，但‘BX44’和‘BX48’对IX型菌较感病。苗期和成株期接种IX型菌后均表现为中抗及以上的品种只有1个，为‘BX24’，病斑长度分别为4.40和5.43 cm，其对V型菌的抗性则为苗期感，成株期中感。苗期时，接种V和IX型菌均没有发现抗性评价达到高抗(HR)的品种，抗性评价为中抗及以上的品种分别为V型20个、IX型34个，分别占总数的25.6%和44.2%，病斑长度分别为2.26~5.90和1.95~5.95 cm；接种V型菌后，评价为感(S)的品种占抗性评级在中感(MS)及以下的品种的69%，IX菌则为44.2%。成株期时，接种V和IX型菌分别出现了1、2个抗性表现为高抗(HR)的品种，‘BX02’对2种病菌都达到高抗，病斑长度分别为0.99和1.45 cm；‘BX09’病斑长度为1.39 cm。抗性评价为中抗及以上的品种分别为V型8个、IX型9个，分别占总数的9.6%和12.3%，病斑长度分别为0.99~5.38和1.45~5.43 cm；接种V型菌后，评价为感的品种占抗性评级在中感及以下的品种的76.9%，IX菌则为84.3%。上述结果表明同一水稻品种的不同时期病斑长度差异较大，而苗期不如成株期稳定，其重复间差异也较大；同一品种对2种病菌的抗性差异也较大，没有发现在不同时期对2种病菌兼抗的品种。其中，我们重点关注‘BX02’，其在苗期和成株期对白叶枯病V型菌抗性评价分别为抗和高抗，抗病效果好。
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图 1 97个水稻品种的白叶枯病抗性评价A为苗期V型菌；B为成株期V型菌；C为苗期IX型菌；D为成株期IX型菌Figure 1. Evaluation of bacterial blight resistance in 97 rice varietiesA is bacterial blight of V type at seedling stage; B is bacterial blight of V type at adult stage; C is bacterial blight of IX type at seedling stage; D is bacterial blight of IX type at adult stage2.2 BX02抗褐飞虱鉴定与农艺性状考察
水稻分蘖期植株(约45 d)接虫20 d后进行抗性等级评级(图2)，水稻品种‘9311’和‘BX02’的平均抗虫等级分别为9.20和2.47，达到极显著差异。由此可知，分蘖期水稻品种‘BX02’对广西南宁水稻大田的褐飞虱自然种群表现出高抗性。
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图 2 ‘BX02’和‘9311’成株期抗褐飞虱鉴定Figure 2. Identification of resistance to BPH in adult stage of ‘BX02’ and ‘9311’对‘BX02’与‘9311’的农艺性状考察发现，‘BX02’的综合性状较好。‘BX02’的株高均值达119.11 cm，较‘9311’高，且差异极显著；分蘖数均值为17.00，较‘9311’多，且差异显著；粒宽均值比‘9311’小，粒长均值比‘9311’稍大，因此长宽比大于‘9311’ ，达到3.99；但其千粒质量均值为19.94 g，相对‘9311’较低，且差异达极显著水平(表1)。
表 1 ‘BX02’和‘9311’ 农艺性状考察1)Table 1. Investigation of agronomic traits of ‘BX02’ and ‘9311’品种
Variety株高/cm
Plant height分蘖数
Tiller number粒宽/mm
Grain width粒长/mm
Grain length长宽比
Length-width ratio千粒质量/g
1000-grain weightBX02 119.11±3.44 17.00±4.72 2.46±0.27 9.70±0.45 3.99±0.39 19.94±0.51 9311 104.08±2.78 12.13±1.81 2.50±0.21 9.50±0.30 3.82±0.29 28.01±0.59 P <0.0001**** 0.0191* 0.7688 0.2978 0.5004 <0.0001**** 1)“*”和“****”分别表示在0.05和0.0001水平差异显著(单因素方差分析)
1)“*” and “****” indicate significant differences at the levels of 0.05 and 0.0001, respectively (One-way ANOVA)2.3 ‘BX02’定位群体的白叶枯病抗性鉴定
在前面的研究中，‘BX02’在苗期和成株期对白叶枯病V型菌抗性评价分别为抗和高抗，抗性效果好，且在褐飞虱抗性鉴定中表现为高抗性，故选择其作为后续的研究对象。利用‘9311’/ ‘BX02’杂交得到F2分离群体，该群体共含有133个单株，使用水稻白叶枯病V型菌对这133个单株进行抗性鉴定，统计结果发现表型出现明显的抗感分离现象(图3A)。由图3B可知，F2代的抗性等级呈连续分布状。抗性评价中，‘BX02’的抗性评级为苗期3级(抗)、成株期2级(高抗)，而白叶枯病感性亲本‘9311’ 的抗性评级为6级(感)。133个F2家系的抗性评级连续分布为2~6级，以‘BX02’所在的2、3级为抗，其余为感，则F2代的抗感比为38∶95，经过卡方检验(χ2=0.9<χ20.01,1=3.84)表明该性状的分离符合基因的分离规律。说明赋予‘BX02’水稻白叶枯病抗性的基因应为隐性基因。
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图 3 ‘BX02’‘9311’及其杂交后代接种水稻白叶枯病菌的病斑表现Figure 3. Lesion manifestations of ‘BX02’ ‘9311’ and F2 after inoculation with Xanthomonas oryzae pv. oryzae2.4 ‘BX02’抗性基因的初步定位
利用野生稻资源保护利用课题组保存的1560对分子标记引物筛选‘9311’ 和‘BX02’的多态性标记，共筛选出多态性标记183个，总分子标记多态率为10.0%(图4A)。以构建的抗、感DNA池为模板，利用筛选出的183个分子标记验证抗、感池的基因型，发现仅在第5号染色体短臂的标记5M00252、5M1.845存在抗、感DNA池的多态性。另外在该区间筛选2个亲本间具有多态性的分子标记5M3.965和5M4.316。利用软件QTL IciMapping对其进行遗传图谱分析，在分子标记5M00252和5M1.845之间发现1个QTL位点，其极大似然函数(Logarithm of odds，LOD)值达40.6，可解释该群体70.7%的变异(图4B)。
2.5 基因的CDS序列扩增及比对
xa5基因被报道为在第5号染色体短臂0.437—0.443 Mb的水稻白叶枯病隐性抗性基因[18]，所以我们推测‘BX02’中起白叶枯病V型菌抗性作用的基因是xa5。为进一步确定候选基因，我们从国家生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，NCBI)获取了xa5的CDS序列，从水稻基因组注释工程(http://rice.uga.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search，RGAP)上获取了‘日本晴’LOC_Os05g01710的CDS序列，从水稻信息门户(http://rice.hzau.edu.cn/rice_rs2/，RIGW)上比对‘9311’后获得对应位置的序列与我们从‘BX02’中扩增到的序列进行比较。测序结果(图5)表明，‘BX02’中相应序列与已报道的抗病基因xa5序列完全一致，与感性对照品种‘日本晴’‘9311’的差异位于第116、117位的碱基，从AG变为TC，导致‘BX02’第39位的缬氨酸在‘日本晴’和‘9311’中变为谷氨酸(图5)。以上分析表明‘BX02’中的抗性基因为xa5。
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图 5 ‘BX02’与‘日本晴(NIP)’‘9311’的CDS序列和xa5对比Figure 5. Comparison of CDS sequences of ‘BX02’, ‘Nipponbare’ (NIP) and ‘9311’ with xa53. 讨论与结论
近50年间，水稻白叶枯病对我国水稻生产造成了数轮严重的损失。V型水稻白叶枯病菌于20世纪80年代在广东出现，初发现就席卷了华南双季稻作区的大部分区域，数年过后，IX型水稻白叶枯病菌再一次席卷了南方各大稻作区。大量喷施化学药剂不仅成本高，还会造成土地及环境的严重破坏。因此，不断挖掘抗病新种质资源是植物保护工作的重点。为防患于未然，近年来水稻白叶枯病新致病型动态监测逐渐成为水稻白叶枯病的研究重点，国内外学者结合水稻白叶枯病经典寄主以及基于水稻白叶枯病抗性基因所构建的近等基因系，系统性地鉴别水稻白叶枯病新致病小种，加速了新致病型的发现[19-20]。陈深等[21]利用中国经典水稻白叶枯水稻寄主和包含抗水稻白叶枯小种R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10的近等基因系，鉴定了收集自华南稻区的500份种质资源，发现V型菌、R8小种以及强毒性IX型菌的致病率较高，其中，毒性较强的V型菌已上升为华南主要菌系，R8小种及IX型菌则呈现出较快的上升趋势。所以本研究针对毒性较强V型和IX型菌，进行水稻抗白叶枯病的种质资源筛选，具有肯定意义。
苗期接种水稻白叶枯病的抗性反应不如成株期稳定，褚菊征等[22]发现影响苗期抗性的因素有水稻品种、苗龄、观察时期与菌株。抗性表现分为全期抗病、全期中抗、全期感病，还存在苗期感成株期抗病型。本研究发现感性对照品种‘日本晴’对V型菌抗性较好，可能只针对V型菌，也可能因为地域、温度和湿度差异从而影响抗感差异。97个品种在苗期和成株期对V型水稻白叶枯病菌达到中抗及以上的分别有20、8个；IX型分别为34、9个，表明较多品种存在苗抗成感现象，与前人研究不太一致，其原因可能是苗期接种水稻白叶枯病菌后抗性反应不稳定所致，所以苗期与成株期稳定抗性鉴定在种质筛选中是非常必要的。章琦等[23]研究发现水稻对白叶枯病的成株抗性有明显的寄主−病原菌相互作用，因此不同品种对同一菌系或同一品种对不同菌系的成株抗性表现方式、时期等方面有差别。本研究试验结果与前人研究结果基本一致，不同品种对同一菌系的抗性反应差别较大；2种菌株接种出现不同时期不同抗性表现分别为V型菌12个品种、IX型菌26个品种；同一品种中的成株期对2种菌株的抗性反应不一致的有11个。
Iyer等[24]研究发现赋予‘IRBB5’抗性的隐性基因xa5编码1个转录因子TFⅡA的γ亚基(TFⅡAγ)，xa5在抗感材料间存在2个核苷酸的替换，从而导致1个氨基酸的改变，这种关联在Aus-Boro群体中的27个抗性品种和9个感性品种中保守存在。2008年，研究人员利用粳稻和籼稻的抗病近等基因系，发现xa5 介导的隐性抗病反应通过抑制病原菌的转移而不是限制病原菌的增殖，发挥抗性作用[25]。Yuan等[26]研究发现水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的不同TAL效应子都有一个相对保守的结构域可以与寄主水稻的转录因子TFIIA亚基TFIIAγ5结合，激活宿主即水稻的易感基因从而导致水稻感病。通过抑制或突变水稻TFⅡAγ5基因表达，可以使转基因水稻具有抗病性，所以含xa5基因的水稻对白叶枯病和细菌性条斑病具有广谱抗性。xa5 是1个隐性基因，杂交后代更易获得纯合的稳定抗性品种，是常规稻育种的优质基因。本研究中赋予‘BX02’抗V型水稻白叶枯病的的隐性xa5基因，与感性对照品种‘日本晴’和‘9311’同样存在保守的1个氨基酸的改变。另外，该品种也可能对水稻细菌性条斑病具有广谱抗性。
本研究所用的97个品种均来自我们前期筛选出的抗虫水稻品种，对水稻褐飞虱均具有较强的抗性。何文强等[27]对5份水稻材料进行褐飞虱和水稻白叶枯抗性评价，选育出对褐飞虱和水稻白叶枯病均具有较高抗性的‘Pokkali’。曹建娜[28]对26 个区试品种进行稻瘟病、水稻白叶枯病、褐飞虱的抗性评价，发现只有品种“两优1899”兼抗病虫害。前人的筛选兼抗病虫害的品种试验表明，抗性水平都达到中抗以上的品种比例偏低。本研究中从97个水稻品种中筛选出抗褐飞虱兼抗白叶枯病V型菌的水稻品种‘BX02’‘BX12’‘BX44’和‘BX48’，兼抗白叶枯病IX型菌的水稻品种仅有‘BX24’，研究可为兼抗型水稻品种选育提供原始的种质资源。
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图 1 97个水稻品种的白叶枯病抗性评价
A为苗期V型菌；B为成株期V型菌；C为苗期IX型菌；D为成株期IX型菌
Figure 1. Evaluation of bacterial blight resistance in 97 rice varieties
A is bacterial blight of V type at seedling stage; B is bacterial blight of V type at adult stage; C is bacterial blight of IX type at seedling stage; D is bacterial blight of IX type at adult stage
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图 2 ‘BX02’和‘9311’成株期抗褐飞虱鉴定
Figure 2. Identification of resistance to BPH in adult stage of ‘BX02’ and ‘9311’
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图 3 ‘BX02’‘9311’及其杂交后代接种水稻白叶枯病菌的病斑表现
Figure 3. Lesion manifestations of ‘BX02’ ‘9311’ and F2 after inoculation with Xanthomonas oryzae pv. oryzae
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图 5 ‘BX02’与‘日本晴(NIP)’‘9311’的CDS序列和xa5对比
Figure 5. Comparison of CDS sequences of ‘BX02’, ‘Nipponbare’ (NIP) and ‘9311’ with xa5
表 1 ‘BX02’和‘9311’ 农艺性状考察1)
Table 1 Investigation of agronomic traits of ‘BX02’ and ‘9311’
品种
Variety株高/cm
Plant height分蘖数
Tiller number粒宽/mm
Grain width粒长/mm
Grain length长宽比
Length-width ratio千粒质量/g
1000-grain weightBX02 119.11±3.44 17.00±4.72 2.46±0.27 9.70±0.45 3.99±0.39 19.94±0.51 9311 104.08±2.78 12.13±1.81 2.50±0.21 9.50±0.30 3.82±0.29 28.01±0.59 P <0.0001**** 0.0191* 0.7688 0.2978 0.5004 <0.0001**** 1)“*”和“****”分别表示在0.05和0.0001水平差异显著(单因素方差分析)
1)“*” and “****” indicate significant differences at the levels of 0.05 and 0.0001, respectively (One-way ANOVA)
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