Pcgf2 promotes the reprogramming of chicken embryonic fibroblasts into induced pluripotent stem cells
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摘要:目的
以提高诱导鸡多能干细胞的干性为目的，利用Pcgf2基因与传统诱导多能干细胞的重编程因子共同诱导鸡多能干细胞。
方法以鸡早期胚胎为模板，对Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4这6种传统的重编程因子及Pcgf2进行基因扩增，并与慢病毒载体重组为慢病毒质粒，在包装慢病毒并测定相对应的病毒滴度后，分组感染鸡胚成纤维细胞，在诱导的过程中对干细胞标记物进行检测。
结果利用传统的重编程因子组合与加入Pcgf2共同诱导后的细胞都较早地表达出磷酸酶活性。加入Pcgf2诱导多能干细胞可以使细胞更早地出现类干细胞形态，且内源性基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表达得到更稳定的提高。
结论Pcgf2在加入诱导体系后可以有效提高细胞的重编程接近干细胞状态。该研究可为选择重编程因子诱导鸡细胞完全重编程及其机制研究提供理论参考。
Abstract:ObjectiveWe aimed to improve the stemness of chicken induced pluripotent stem cells using the Pcgf2 gene together with conventional reprogramming factors to induce chicken pluripotent stem cells.
MethodSix conventional reprogramming factors including Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, C-myc and Klf4 as well as Pcgf2 gene were amplified and reconstituted with lentiviral vectors as lentiviral plasmids using chicken early embryos as templates. After packaging the lentivirus and measuring the corresponding viral titers, chicken embryonic fibroblasts were infected in groups and stem cell markers were assayed during the induction process.
ResultThe cells induced by the combination of conventional reprogramming factors and Pcgf2 all expressed phosphatase activity early. Inducing the pluripotent stem cells with Pcgf2 could make the cells appear stem-like morphology earlier, and the expressions of endogenous genes Oct4, Sox2, Nanog and Lin28 increased more stably.
ConclusionPcgf2 can effectively enhance the reprogramming of cells to approach the stem cell state after being added to the induction system. The research provides a theoretical reference for the selection of reprogramming factors to induce complete reprogramming of cells in chickens and the mechanism study.
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立地质量是影响林分生长的关键因素，准确评价立地质量是科学经营森林的前提和基础[1-2]。在“碳达峰碳中和”的战略背景下，科学的立地质量评价对提高林分生长收获预估准确性、优化抚育经营设计、提升森林碳汇经营水平以及森林生态系统应对气候变化能力具有极其重要的意义[3]。林分生产力的立地质量评价方法分为生物因子法和地理因子法2大类，其中，生物因子法的地位级和立地指数是立地质量评价最常用的指标。采用不同方法评价立地质量各有优缺点[4-5]。地理因子法易于分类，却缺乏立地条件影响林分生长的生物学解释。地位级法简便易行，但其精度和准确性低于立地指数的。立地指数的无偏估计要求准确的年龄测量值。相较基于年龄和树高的地位级和立地指数而言，已有研究者[6-8]提出了立地形(Site form)的方法，即用基准胸径时林分优势高表示立地质量，回避林分年龄，对混交异龄林具有较好的评价效果，但胸径和树高的关系也受林分的竞争程度影响[9-11]。
林业生产实践中树龄数据往往不准确或缺失，而林分胸径准确数据通过测量即可获取，理论上能修正由于树龄误差而导致的立地质量评价偏差。全国林分的情况复杂多样，天然林与人工林、混交林与纯林、异龄林与同龄林等差异会进一步影响立地质量评价方法的选择和评价结果的准确性[12]，缺乏统一的评价模型也导致同一树种各区域间立地质量评价结果不具可比性。采用胸径与树高关系评价森林立地质量在一定程度上减少了其他评价方法的限制条件，同时在森林资源连续清查和森林资源规划设计调查中均有相应的因子调查要求，因此在实际生产管理中应用更便捷[13-15]。建立覆盖全国范围的主要针叶林分类型的胸径与树高模型，并编制指数模型表，不仅是森林经营管理的基础性工作[16]，也能为建立大区域尺度的森林立地质量评价体系提供科学参考。
1. 材料与方法
1.1 数据来源及描述性统计
数据来源于全国森林资源连续清查第6次(1999—2003年)、第7次(2004—2008年)、第8次(2009—2013年)和第9次(2014—2018年)结果。根据全国主要针叶林分样地数量，划分为16个针叶树种组。每种树种中样本数量足够的单列，不够的合并为其他，优势树种组中的3种混交类型未纳入主要针叶林分立地形指数模型。主要针叶林分立地形指数模型研建数据描述性统计分析见表1。其中，数量最多的是马尾松林分样地，共
15430 块，数量最少的是铁杉林分样地，共182块。林分胸径均值为10.6~32.8 cm，林分树高均值为6.1~19.8 m，样地数量及规格均能满足建模和检验要求。表 1 立地形指数模型研建数据描述性统计Table 1. Descriptive statistics of model establishment data for site form index林分类型 Stand types 样地数量
Number of plots林分胸径/cm Stand DBH 林分树高/m Stand height 区间 Range 均值 Mean 标准差 SD 区间 Range 均值 Mean 标准差 SD 冷杉 Abies fabri 4363 6.5~77.1 32.8 11.05 2.8~43.7 19.8 5.95 云杉 Picea asperata 11869 5.0~60.0 27.2 10.61 1.7~41.5 17.0 6.11 铁杉 Tsuga chinensis 182 6.9~58.0 29.9 9.61 4.0~29.0 16.6 4.42 油杉 Keteleeria fortunei 217 6.9~27.1 13.0 4.18 2.8~18.3 7.2 2.97 落叶松 Larix gmelinii 9105 5.0~69.7 16.4 9.19 2.0~36.2 13.5 5.00 红松 Pinus koraiensis 290 5.0~58.9 17.5 10.52 1.5~29.2 12.1 5.83 樟子松 Pinus sylvestris 563 5.4~43.2 16.9 7.13 2.8~26.7 11.6 4.78 赤松 Pinus densiflora 296 5.3~23.1 10.6 3.55 1.8~16.7 6.1 3.06 黑松 Pinus thunbergii 346 5.3~20.0 10.8 3.13 2.2~16.0 6.3 2.46 油松 Pinus tabuliformis 4525 5.0~35.0 13.2 5.16 1.5~23.0 7.7 3.27 华山松 Pinus armandii 1029 5.0~34.3 13.9 5.60 1.5~25.0 9.3 3.83 马尾松 Pinus massoniana 15430 5.0~39.9 12.9 4.90 1.5~28.5 9.2 3.58 云南松 Pinus yunnanensis 3510 5.0~43.0 14.6 6.58 2.2~30.0 9.6 4.48 思茅松 Pinus kesiya var. langbianensis 478 5.7~33.4 16.5 5.14 2.9~27.2 12.4 4.13 高山松 Pinus densata 5125 5.3~40.0 27.9 6.53 2.0~28.0 17.8 4.41 其他松类1) Other pines 1350 5~27.4 12.8 4.44 2.5~18.7 8.1 3.06 1) 其他松类指样地数量较少的针叶林分类型。
1) Other pines indicate stand types with less sample plots.1.2 地位级指数模型构建及编表
1.2.1 导向曲线拟合
导向曲线的选择直接影响模型对立地质量评价的准确性，因此，导向曲线的形式既需要符合树高生长的生物学规律，又要能对数据进行最优化的拟合。良好的导向曲线应该呈平滑的“S”型，且具有上限渐近线。本文采用Richards、Logistic和Korf 3个胸径−树高生长模型拟合径阶中值和林分树高均值，如公式(1)~(3)所示。根据决定系数(Coefficient of determination，R2)、标准估计误差(Standard estimation error，SEE)和曲线形式等选择导向曲线模型。
$$ {H_{\mathrm{S}}} = 1.3 + a {\left( {1 - {{\text{e}}^{ - b {{\mathrm{DBH}}_{\mathrm{S}}}}}} \right)^c} \text{，} $$ (1) $$ {H_{\mathrm{S}}} = {{1.3 + a} \mathord{\left/ {\vphantom {{1.3 + a} {\left( {1 + b {{\text{e}}^{c {{\mathrm{DBH}}_{\mathrm{S}}}}}} \right)}}} \right. } {\left( {1 + b {{\text{e}}^{c {{\mathrm{DBH}}_{\mathrm{S}}}}}} \right)}} \text{，} $$ (2) $$ {H_{\mathrm{S}}} = 1.3 + a {{\text{e}}^{\frac{b}{{{\mathrm{DB}}{{\mathrm{H}}_{\mathrm{S}}}^c}}}} \text{，} $$ (3) $$ {R^2} = 1 - \sum {\frac{{{{\left( {{y_i} - {{\hat y}_i}} \right)}^2}}}{{{{\left( {{y_i} - {{\bar y}_i}} \right)}^2}}}} \text{，} $$ (4) $$ {{\mathrm{SEE}}} = \sqrt {\frac{{\displaystyle\sum {{{\left( {{y_i} - {{\hat y}_i}} \right)}^2}} }}{{ {n - p} }}} \text{，} $$ (5) 式中，HS为林分树高，DBHS为林分平均胸径，a、b、c为待求解参数，
$ {y_i} $ 为实际观测值，$ {\hat y_i} $ 为模型预估值，$ \bar y_i $ 为样本平均值，n为样本单元数，p为参数个数。1.2.2 基准胸径确定
基准胸径对立地形指数模型编表具有十分显著的影响，基准胸径选择不恰当会造成立地质量评价结果的偏差。在确定基准胸径时，本研究利用大量样地历史调查监测数据分析树高的生长过程，同时计算各径阶的树高变异系数及变化幅度，并绘制曲线图，根据曲线图中树高生长趋于平缓且能灵敏反映立地质量的原则确定基准胸径。
1.2.3 指数表编制
适宜的编表方法取决于树种、编表数据量等，编表方法不当会造成较大误差。本文利用林分树高生长及树高标准差曲线，依据 ± 2倍标准差原则确定立地形级的上、下限曲线，根据上、下限曲线所夹的面积及预定的5个指数级，采用相对系数法确定各指数级上、下限，编制全国主要针叶林分立地形表。该方法按照一定比例将胸径−树高生长曲线平移，在确定导向曲线模型后，将林分胸径代入模型，得到理论树高，将基准胸径代入模型得到树高理论值，调整系数和各指数级树高计算公式如下：
$$ {K_j} = \frac{{{H_{0j}}}}{{{H_{0k}}}} \times 100{\text{%}} \text{，} $$ (6) $$ {H_{ij}} = {K_j} \times {H_{ik}} \text{，} $$ (7) 式中，Kj为立地形曲线簇调整系数，H0j为基准胸径各指数级树高，H0k为基准胸径导向曲线树高，Hij为各指数级树高，Hik为导向曲线树高。
1.3 模型统计检验
为了检验立地形指数模型对全国针叶林分立地质量评价的准确性和适用性，对编制的立地形表进行落点检验和适用性检验。
1.3.1 落点检验
将林分平均胸径−树高数据作成散点图，并绘制到立地形曲线簇中，算出散点落在曲线簇内的概率，即立地形表能够解释林分平均树高生长的概率。一般认为，落点检验值大于90%时，新编的立地形表满足使用要求。否则，应进行必要的调整。
1.3.2 适用性检验
采用连续的调查监测数据对新编的立地形表进行适用性检验。根据林分平均胸径及树高由立地形指数表确定其立地形等级，然后，比较多期调查数据下林分立地形等级有无跳级的现象，并统计出跳级个数占总个数的百分比。一般认为，跳级个数小于5%时，新编的立地形表满足使用要求。
2. 结果与分析
2.1 立地形指数模型拟合结果
由表2可知，Richards模型拟合所有针叶树种决定系数均值为0.96，标准估计误差均值为0.98；Logistic模型拟合所有针叶树种决定系数均值为0.96，标准估计误差均值为1.10；Korf模型拟合所有针叶树种决定系数均值为0.96，标准估计误差均值为1.00。Richards模型的普遍适用性更强，但油杉和高山松2个优势树种林分的上限渐近线参数均超过45，与Richards模型参数所反映的林分生物学规律存在差异，即林分平均树高的上限水平应不超过45 m。油杉和高山松2个优势树种林分的Korf模型拟合参数也出现了偏离合理值的情况，因此这2个优势树种林分应选择Logistic模型作为导向曲线。
表 2 主要针叶林分胸径和树高模型参数Table 2. Model parameters of DBH and height for major coniferous stands林分
Stand typesRichards Logistic Korf a b c R2 SEE a b c R2 SEE a b c R2 SEE 冷杉 34.9304 0.0278 1.2032 0.94 2.08 29.7918 6.2168 − 0.0711 0.92 2.25 71.0181 − 8.2024 0.5228 0.94 2.07 云杉 35.0515 0.0292 1.2862 0.99 0.83 27.6166 7.9591 − 0.0872 0.98 1.12 104.1793 − 7.7122 0.4304 0.99 0.82 铁杉 42.7731 0.0100 0.7756 0.84 2.36 25.0287 4.3132 − 0.0612 0.81 2.52 228.4099 − 6.1365 0.2395 0.84 2.35 油杉 49.4001 0.0217 1.5328 0.96 0.94 17.6832 15.4880 − 0.1514 0.95 0.96 356.5069 − 9.6653 0.3327 0.96 0.94 落叶松 21.7763 0.0825 1.6565 0.92 1.54 21.4231 5.7592 − 0.1286 0.91 1.63 24.4672 − 16.0920 1.1943 0.91 1.63 红松 23.7699 0.0706 1.9944 0.95 1.54 22.4409 9.9858 − 0.1324 0.95 1.64 31.3234 − 15.3821 0.9800 0.95 1.60 樟子松 23.1622 0.0573 1.6375 0.97 1.07 19.8216 9.2197 − 0.1350 0.96 1.27 69.4325 − 7.1841 0.4718 0.97 1.06 赤松 11.2997 0.1945 5.7997 0.89 1.32 10.6562 48.3629 − 0.3444 0.92 1.14 15.2157 − 32.2581 1.4462 0.88 1.43 黑松 32.0888 0.0315 1.4875 0.97 0.60 13.1164 14.9074 − 0.2020 0.98 0.49 646.3492 − 8.9301 0.2569 0.97 0.62 油松 34.1642 0.0217 1.2051 0.99 0.28 17.6943 9.4751 − 0.1219 0.99 0.49 474.2441 − 8.0463 0.2431 0.99 0.26 华山松 23.2458 0.0527 1.5916 0.99 0.59 17.9922 10.4218 − 0.1496 0.98 0.68 69.1080 − 7.7007 0.4897 0.99 0.59 马尾松 20.7730 0.0585 1.4939 0.99 0.28 17.5935 8.1581 − 0.1427 0.99 0.55 41.5400 − 7.4772 0.5971 0.99 0.24 云南松 32.6336 0.0345 1.4617 0.99 0.38 22.9034 10.6239 − 0.1183 0.99 0.67 182.4129 − 7.9799 0.3567 0.99 0.38 思茅松 23.3830 0.0688 1.8721 0.97 0.87 19.5171 10.3107 − 0.1589 0.96 1.01 42.3634 − 10.2905 0.7343 0.98 0.84 高山松 47.8737 0.0196 1.2483 0.99 0.71 25.0354 10.2222 − 0.1076 0.98 0.89 378.0811 − 8.2583 0.2902 0.99 0.71 其他松类1) 15.6588 0.0804 1.7907 0.99 0.35 13.0084 10.8083 − 0.1960 0.99 0.28 36.7931 − 7.3685 0.5885 0.99 0.40 1) 其他松类指样地数量较少的针叶林分类型。
1) Other pines indicate stand types with less sample plots.导向曲线的选择不仅需要考虑模型的拟合决定系数和参数范围，同时也需要考虑导向曲线的良好形式，尤其是幼龄林阶段。拟合的导向曲线应能反映逻辑合理性，即林分胸径为0 cm，林分树高应为1.3 m，模型形式需要反映出此特征。大区域尺度的调查数据中，不同径阶段的样地数量呈现正态分布，导致小径阶林分的调查数据较少，也无法全面反映小径阶林分的生长情况，各针叶树种在小径阶的标准差范围也较小，如图1所示。其中，油杉、赤松、黑松、油松、华山松、马尾松、云南松、思茅松、高山松和其他松类胸径建模数据未超过60 cm，这也导致林分胸径−树高拟合曲线未出现明显的生长平缓阶段，这就意味着生产实践中应尽可能对中龄林、近熟林和成熟林进行评价，减少采用小径阶林分评价森林立地质量，从而避免出现跳级现象和评价结果的不确定。
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图 1 主要针叶林分胸径和树高拟合曲线图Figure 1. Fitted curve plots of DBH and height for major coniferous stands2.2 立地形指数模型检验结果
根据主要针叶林分立地形指数模型曲线簇落点检验结果(图2)可知，冷杉林分落点检验值为95.67%、云杉林分落点检验值为97.42%、铁杉林分落点检验值为96.70%、油杉林分落点检验值为95.39%、落叶松林分落点检验值为97.90%、红松林分落点检验值为94.48%、樟子松林分落点检验值为96.80%、赤松林分落点检验值为92.23%、黑松林分落点检验值为97.69%、油松林分落点检验值为96.40%、华山松林分落点检验值为96.11%、马尾松林分落点检验值为99.16%、云南松林分落点检验值为97.55%、思茅松林分落点检验值为94.98%、高山松林分落点检验值为98.97%、其他松林分落点检验值为97.93%。落点检验值均大于90%，均值达96.59%，表明可以在实际生产中使用。此外，基于落点检验曲线簇分析可知，由于森林资源连续清查数据能获取准确的林分胸径数据，因而大区域尺度立地形指数模型相较于地位级指数模型具有更好的检验效果。
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图 2 主要针叶林分立地形指数模型曲线簇Figure 2. Curve families of site form index model for major coniferous stands2.3 林分立地质量动态变化分析
根据主要针叶林分立地形等级占比动态分析结果(图3)可知，2003年16个针叶树种组立地形等级占比均值为Ⅰ级8.09%、Ⅱ级23.87%、Ⅲ级38.28%、Ⅳ级24.51%、Ⅴ级5.25%，2008年16个针叶树种组立地形等级占比均值为Ⅰ级8.51%、Ⅱ级24.56%、Ⅲ级36.70%、Ⅳ级25.19%、Ⅴ级5.04%，2013年16个针叶树种组立地形等级占比均值为Ⅰ级8.76%、Ⅱ级25.41%、Ⅲ级37.21%、Ⅳ级23.96%、Ⅴ级4.67%，2018年16个针叶树种组立地形等级占比均值为Ⅰ级9.64%、Ⅱ级29.91%、Ⅲ级34.79%、Ⅳ级21.55%、Ⅴ级4.12%。4次森林资源连续清查期间，针叶林分Ⅰ级和Ⅱ级占比均值合计增长了7.60个百分点，Ⅲ级均值合计减少了3.50个百分点，Ⅳ级和Ⅴ级均值合计减少了4.10个百分点。基于立地形等级的评价方法，20年间中国针叶林分立地质量表现为较好的改善趋势，比较典型的针叶林分包括冷杉林、云杉林、油杉林、落叶松林、油松林、华山松林、马尾松林、云南松林、高山松林和思茅松林，其中，马尾松林分有
15430 个样地，样本量大使得立地形等级变化趋势规律更加明显。铁杉林、油杉林、红松林、樟子松林、赤松林、黑松林和其他松类林则出现波动情况，以红松立地形Ⅲ级为例，2003、2008、2013和2018年的占比分别为60.00%、20.00%、40.00%和30.00%，出现了明显的跳跃，是因为小样本量分析导致的，20年间仅有10个样地未发生优势树种的变化，整体可用于立地形等级占比变化分析。![]()
图 3 2003、2008、2013和2018年主要针叶林分立地形等级占比动态直方图Figure 3. Proportion dynamic histogram of site form class for major coniferous stands in 2003, 2008, 2013 and 20183. 讨论与结论
3.1 讨论
不同区域间的气候差异导致林木生长速率差异，进而对林龄−树高关系产生影响，因此，采用林龄−树高关系评价立地质量主要受树种、气候、土壤肥力等主导因素的交互作用，无法建立统一的大尺度立地质量评价模型。相较于传统的立地指数和地位级法，胸径−树高关系在不同气候区域和林龄结构中具备一定的稳定性[17]，常用于不同遗传种源林木的基因表观评估[18]，受树种、土壤肥力和林分密度等主导因素的交互作用影响，这就为相同树种不同区域建立统一的立地质量评价模型提供了前提条件[19-20]。本文16个林分类型胸径−树高关系的拟合决定系数(均值0.96)大于林龄−树高关系的(均值0.94)，以冷杉林为例，林龄−树高和胸径−树高关系的拟合决定系数分别为0.86和0.93。统一的胸径−树高立地质量评价模型使不同地区的相同林分评价结果具有可比性，但在实际应用过程中仍存在挑战，难以排除经营措施对林分密度等竞争指标的影响[21]，导致胸径−树高关系评价立地质量偏差的不确定性增加，从而出现跳级现象，这也是后续研究中需要重点关注的环节。
在实际林业生产实践中，作为森林立地质量的关键因素，土壤类型、厚度、质地、养分的状况在无人为干扰的情况下，将在较长时间内维持在比较稳定的水平[1,22]，因此，立地质量在一定周期内具有稳定性。与此同时，长期积累和分解的森林凋落物可以增加土壤中的速效磷、速效氮等养分含量，促进森林立地质量的改善；不合理的经营措施导致土壤有机物持续减少、土壤养分流失，也可能导致森林立地质量的恶化，因此，在一定周期内立地质量也具有波动性。胸径−树高关系评价森林立地质量的优势是简便和动态，劣势则是灵敏的动态变化可能是人为干扰(如采伐、补植)或气候变化(如降雨、有效积温增加)等综合因素导致，而非真实的立地质量改善[23-24]，同时其也受建模评价样本量的影响，本文中样地数量小于500的铁杉林、油杉林、红松林、赤松林、黑松林和思茅松林均出现了不同程度的跳跃现象，即小样本分析导致的不确定性结果。因此，在林业生产实践中，应综合利用多种方法进行比较分析[7]，全面、准确、客观和科学地反映森林立地质量及动态变化，这也是本文后续需要持续完善的地方。
3.2 结论
本研究中Richards、Logistic和Korf模型拟合导向曲线决定系数均值均大于0.95，结合模型形式和参数分析结果可用于建立全国主要针叶林分立地形指数模型，建立的立地形指数模型落点检验值均大于90%，均值达96.59%，可以在实际生产中使用。基于胸径−树高关系建立全国统一的立地质量评价模型具有可行性和合理性，通过减少气候差异导致基于树龄的生长速率对立地质量评价的影响偏差，使不同地区相同林分的评价结果具有可比性，在大尺度水平具有较好的适用性，但仍然需要警惕经营措施和小样本数据导致的评价结果不确定。
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图 1 不同多能基因的PCR结果
Figure 1. PCR results of different pluripotent genes
M：DL2000 DNA marker
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图 2 不同多能基因的重组慢病毒质粒酶切结果
Figure 2. Enzyme digestion results of recombinant lentiviral plasmids with different pluripotent genes
M：DL15000 DNA marker
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图 3 倒置荧光显微镜下观察293T包装慢病毒
Figure 3. 293T packaging lentivirus observed under inverted fluorescence microscope
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图 4 倒置荧光显微镜下观察倍比稀释后细胞感染慢病毒情况
Figure 4. Cells infected with lentivirus after multiplier dilution and observed under inverted fluorescence microscope
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图 5 碱性磷酸酶活性检测结果
A：Lv-OSKMNL；B：Lv-OSKMNL+Pcgf2；C：空白对照 Mock
Figure 5. Results of alkaline phosphatase activity assay
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图 6 荧光镜检观察重编程细胞聚团形成过程
Figure 6. Fluorescence microscopy observation of the formation process of reprogrammed cell clusters
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图 7 不同内源性基因的荧光定量PCR检测
各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05， LSD法)
Figure 7. Fluorescence quantitative PCR assay of different endogenous genes
In each figure, different lowercase letters above columns at the same time indicate significant differences among treatments (P<0.05, LSD method)
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图 8 三胚层标记物的荧光定量PCR检测
各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05， LSD法)
Figure 8. Fluorescence quantitative PCR assay of triploblastic markers
In each figure, different lowercase letters above columns at the same time indicate significant differences among treatments (P<0.05, LSD method)
表 1 多能基因编码区序列的PCR同源重组扩增引物
Table 1 PCR homologous recombinant amplification primers for the coding region sequences of the pluripotent genes
基因
Gene正向引物序列 (5′→3′)
Forward primer sequence反向引物序列 (5′→3′)
Reverse primer sequence产物大小/bp
Product sizepCDH-CMV GGTGGCTAGCTCTAGAATCTTCTATGGAGGTCAAAACAG GGATCCGCGGCCGCAAGGATCTGCGATCGCTCCGGT 8176 Oct4 GGCACCGGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTCAGTGGCTGCTGTTGTTCA CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCATGTAAAAGCCAAAAA 888 Sox2 GGCACCGGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTACATATGTGATAGAGGGA CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGTACAACATGATGGAAAC 968 Nanog CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGAGCGCTCACCTGGCCAT CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGAGCGCTCACCTGGCCAT 930 Lin28 GGCACCGGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTCATTCCCGGGTTTCGGGGC CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGGGGTCTGTTTCCAACCA 609 C-myc TCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCCTATGCACGAGAGTTCCTTAG TTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCCGCTCAGCGCCAGCCT 1251 Klf4 TCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTAAAAGTGCCTCTTCATGT TTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCGGCAGCCCCCCGGCGA 1377 Pcgf2 GGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTAGGTCAGCGCGGACCCC TGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCACAGGACCACCCGGATA 966 
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表 2 干细胞标记物荧光定量PCR检测引物
Table 2 Primers for fluorescent quantitative PCR detection of stem cell markers
基因名称
Gene name正向引物序列(5′→3′)
Forward primer sequence反向引物序列(5′→3′)
Reverse primer sequenceEndo-Oct4 CTGGCCCCAGGCAGGTAA CGGGATCTCCATGAACAACAG Endo-Sox2 AAAAGGTCCAGAATTTCTAATA CCCCAAGCAGACTTCATA Endo-Nanog TAGTAGTGTCCGCACCTAAC GTATGCAACCAGCTCACC Endo-Lin28 CAAACAAACCCAAAGATACG AAAGCCAATGCCAAGTGA Sall4 GAACTTCGGTCGTGGCACAAGG AATACCAAGTGAGCGTCCCATTAGC Gata4 ACAGTTGACACATTCTCGCCCTTC CCACTTGGACTTCTTCGCCCTTC Gata6 ACACCAGTGATCCTGCCTGACG AGAGAGCACCAGTCCCGAAAGC Pax6 ATGGGCTGGCTATTCATG CCCCGTTTCCTCTTTCAC GAPDH GCACGATGCATTGCTGACAA GGGTGGTGCTAAGCGTGTTA
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百度学术
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