早在2006年，Takahashi等^[1]通过在胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)培养条件下的小鼠与人的成纤维细胞中外源引入Oct4、Sox2、C-myc和Klf4这4种重编程因子，细胞会表现出ESC的生长特性以及形态特征，且会表达ESC中的标记基因，他们将诱导后且具有ESC特征的细胞称为诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell, iPSC)。Yu等^[2]的研究同样发现，在Oct4、Sox2、Nanog和Lin28这4种因子的诱导下也会产生iPSC且同样拥有ESC的特征。iPSC可以作为一种保护珍惜动物种质资源的途径。现如今，有接近13%的鸟类已经灭绝或者接近灭绝了，而通过人工干预所建造的保护区以及圈养在一定程度上缓解了物种灭绝的问题，但物种的总量依然有趋于下降的趋势^[3]。此前就有学者尝试通过Oct4、Sox2、C-myc、Klf4或miR-302/367将东北虎的体细胞诱导为iPSC，且均表现出一定的分化潜力，既可以作为遗传资源保存，又可以用于嵌合体的研究^[4-5]。在当前关于iPSC的研究中，哺乳动物iPSC的相关研究较多，而禽类因为其不同的生理结构而研究较少。禽类在发育生物学以及疾病中都是一种重要的动物模型，构建禽类iPSC不仅可以方便对禽类进行基因编辑，从而促进发育生物学等的研究，更在农业与医学上有着重要的意义。在禽类iPSC方面，2012年Lu等^[3]研究表明利用人源的Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、Klf4和C-myc这6种重编程因子可以共同诱导鹌鹑iPSC，内源性多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28均在诱导的iPSC中被检测到高度表达。而在后续研究中他们采用相同的转录因子重编程鸡体细胞，诱导了鸡iPSC并表达出相对应的干细胞的表型^[6]。Fuet等^[7]同样采用6种重编程因子对鸡成纤维细胞进行重编程，结果表明重编程后的细胞会表达出iPSC的标记物，但如果需要稳定获得完全重编程且低致瘤性的鸡iPSC，还需要进一步的研究去发现新的重编程因子或特定的培养条件。

PcG蛋白是一种可以调控表观遗传染色质修饰的蛋白，其中包括PRC1与PRC2，而PRC1蛋白复合物中可以和RING1A/B形成二聚体的亚基叫做Pcgf蛋白，这类蛋白有6个亚型，分别为Pcgf1到Pcgf6^[8]。已有研究发现，Pcgf1不仅会正向调控外胚层分化所必须的转录因子与多能基因Oct4、Nanog的表达，也对胚胎干细胞的维持起到了重要的作用，且Pcgf1可以通过调控组蛋白甲基化的方式维持iPSC的多能性^[9-10]，Pcgf6在体细胞重编程方面有着取代Sox2的潜力，正向调控iPSC的生成^[11]。Liao等^[12]研究发现，Pcgf1与Pcgf6的同家族蛋白Pcgf2在鸡胚早期中高度表达，但其对于iPSC的调控作用尚不明确。本试验通过Pcgf2与传统重编程因子Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、Klf4和C-myc共同诱导多能干细胞，并通过内源性基因的表达与细胞特征判断干细胞状态，以期挖掘出有助于稳定诱导iPSC的方法与新的转录因子。

1.   材料与方法

1.1   试验动物、细胞株及质粒

9~11胚龄的无特定病原(Specific pathogen free，SPF)鸡胚采购于广东大华农动物保健股份有限公司；SV40 大T抗原的人肾上皮细胞系(293T)由华南农业大学动物科学学院家禽研究室保存；pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro慢病毒表达质粒及其配套的PLP1、PLP2、VSVG质粒购自吉凯生物；感受态细胞stbl3 购自Genesand。

1.2   主要试剂

RNAiso Plus、PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂购自TaKaRa；2× Phanta^® Flash Master Mix、T4 DNA Ligase (Rapid)购自诺唯赞；内切酶BamH I、Nhe I购自NEB；无内毒素质粒小提中量提取试剂盒购自Aidlab；Invitrogen脂质体转染试剂Lipo3000购自赛默飞；40 g/L多聚甲醛溶液购自Pythonbio；4× EZscript RT Mix II、2× Color SYBR Green qPCR Mix购自EZBioscience；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自碧云天；KNOCKOUT DMEM、高糖DMEM、OPTI MEM I、2.5 g/L胰蛋白酶、血清代替物、鸡血清、GLUTAMAX I(100×)、MEM非必需氨基酸溶液、Sodium Pyruvate、双抗Pen Strep购自GIBCO；Valproic acid、CHIR-99021、PD0325901、A83-01购自Selleck；胎牛血清购自华韵生物。

1.3   多能基因扩增与质粒构建

参考NCBI数据库中鸡Oct4(GenBank登录号：NC_000006.12)、Sox2(GenBank登录号：NC_052540.1)、Nanog(GenBank登录号：NC_052532.1)、Lin28(GenBank登录号：NC_052554.1)、C-myc(GenBank登录号：NC_052533.1)、Klf4(GenBank登录号：NC_052572.1)和Pcgf2(GenBank登录号：NC_052558.1)基因的编码区，设计质粒的引物以及多能基因带有质粒同源臂的扩增引物，引物信息见表1。以早期鸡胚RNA的反转录DNA以及慢病毒质粒为模板，采用对应引物对多能基因与质粒进行扩增；产物回收并纯化后，将慢病毒质粒与多能基因分别连接，然后在带有氨苄抗性的SOC固体培养基上培养过夜，挑取单克隆进行扩大培养，根据无内毒素质粒小提中量提取试剂盒说明书进行质粒的抽提，采用内切酶BamH I、Nhe I进行酶切鉴定；将酶切鉴定正确的质粒送至生工生物广州分公司进行测序，将测序结果与预测一致、无突变或为同义突变的质粒置于−20 ℃条件下保存。

表  1  多能基因编码区序列的PCR同源重组扩增引物

Table  1.  PCR homologous recombinant amplification primers for the coding region sequences of the pluripotent genes

基因 Gene	正向引物序列 (5′→3′) Forward primer sequence	反向引物序列 (5′→3′) Reverse primer sequence	产物大小/bp Product size
pCDH-CMV	GGTGGCTAGCTCTAGAATCTTCTATGGAGGTCAAAACAG	GGATCCGCGGCCGCAAGGATCTGCGATCGCTCCGGT	8176
Oct4	GGCACCGGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTCAGTGGCTGCTGTTGTTCA	CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCATGTAAAAGCCAAAAA	888
Sox2	GGCACCGGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTACATATGTGATAGAGGGA	CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGTACAACATGATGGAAAC	968
Nanog	CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGAGCGCTCACCTGGCCAT	CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGAGCGCTCACCTGGCCAT	930
Lin28	GGCACCGGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTCATTCCCGGGTTTCGGGGC	CTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGGGGTCTGTTTCCAACCA	609
C-myc	TCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCCTATGCACGAGAGTTCCTTAG	TTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCCGCTCAGCGCCAGCCT	1251
Klf4	TCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTAAAAGTGCCTCTTCATGT	TTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCGGCAGCCCCCCGGCGA	1377
Pcgf2	GGAGCGATCGCAGATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTAGGTCAGCGCGGACCCC	TGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCCACCATGCACAGGACCACCCGGATA	966

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1.4   慢病毒包装与滴度测定

慢病毒包装：选取生长状况良好、形态健康的293T细胞，当其在10 cm²细胞培养皿生长为单层、细胞汇合度约为50%后进行转染。将重组慢病毒质粒以及辅助质粒PLP1、PLP2、VSVG从冰箱中取出，放在冰盒上融化，根据Invitrogen脂质体转染试剂Lipo3000说明书对4种质粒进行共转染。重组慢病毒质粒以及PLP1、PLP2和VSVG 这3种辅助质粒分别加入14、10、10和6 μg。转染10 h后，弃去细胞原有培养基，并加入8 mL含体积分数为10% FBS的高糖DMEM培养基。随后在转染48和72 h后2次回收细胞上清液并过滤。将过滤后的慢病毒液加入到密理博孔径大小为5 nm、截留相对分子质量为100000的病毒超滤管中进行浓缩，并分装在1.5 mL离心管中，在−80 ℃条件下保存。

慢病毒滴度测定：选取生长状况良好、形态健康的293T细胞进行传代至96孔板中，在培养24 h后进行慢病毒滴度的测定。将慢病毒融化后经过倍比稀释，加入到96孔板中孵育，并按照稀释倍数标注为10¹ μL到10⁻⁵ μL共7个梯度。再继续培养48 h后将细胞放在倒置荧光显微镜下逐个稀释度观察并记录。病毒滴度(TU/mL)计算公式如下：

病毒滴度=荧光细胞数/病毒原液量。

1.5   鸡胚成纤维细胞的分离与培养

采集 9~11胚龄鸡胚消毒后，用镊子打开气室和壳膜，夹起鸡胚，用眼科剪刀和镊子剔除头、爪、骨头和内脏，把鸡胚组织块置于平皿中，用 PBS 缓冲液漂洗去除血污。将漂洗好的组织块放入 5 mL 离心管，用眼科剪刀剪至肉糜状，用 2.5 g/L胰酶在 37 ℃水浴箱中消化 15~20 min，加入适量的小牛血清终止消化。使用 200 目细胞滤膜过滤后，1000 r/min离心 5 min，弃掉上清液，用完全培养基对细胞进行重悬，分装入无菌培养皿中，获取纯化的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryonic fibroblasts, CEF)，细胞在CO₂体积分数为5%、37 ℃的培养箱内培养。

1.6   慢病毒感染CEF

将分离后的原代细胞置于合适大小的无菌培养皿中进行培养，并在其生长状况良好的前提下进行2次传代。对CEF进行纯化后，细胞均为细长梭形、边界清晰的成纤维细胞，将3×10⁴ 个细胞传代至24孔板中，过夜培养后，将浓缩过滤后的病毒从−80 ℃冰箱中取出并置于冰上融化，以慢病毒Lv-Oct4、Lv-Sox2、Lv-Klf4、Lv-C-myc、Lv-Nanog、Lv-Lin28为一组(简称为Lv-OSKMNL组)，以及Lv-OSKMNL中加入Lv-Pcgf2为一组(简称为Lv-OSKMNL+Pcgf2组)，并分别加入助染剂聚凝胺(Polybrene)，感染复数MOI=10，将病毒混合液分别加入到CEF中。将细胞放在CO₂体积分数为5 %、37 ℃恒温培养箱中继续进行培养，每24 h更换1次培养基，并在感染72 h后将培养基换成提前配制好的iPSC Medium培养基。

在培养了5 d后，在加入的iPSC Medium中需要加入1 μg/mL的嘌呤霉素(Puromycin)，在培养了7 d后加入到iPSC Medium的嘌呤霉素质量浓度降低至0.5 μg/mL，从而达到筛选感染了慢病毒的细胞的目的。在后续持续培养观察细胞状态并对细胞进行干细胞标记物的检测。

1.7   碱性磷酸酶检测

将细胞从培养箱中取出并用40 g/L的多聚甲醛溶液固定，根据说明书的步骤，用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对收集的样品进行碱性磷酸酶的活性检测，完成后对细胞进行观察并记录。

1.8   荧光定量PCR

根据内源性多能基因设计荧光定量PCR引物，引物信息见表2。将收集的样品进行RNA抽提并反转录为cDNA后，根据2× Color SYBR Green qPCR Mix说明书配制体系，并进行荧光定量PCR检测，反应程序为95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，30 ℃，30 s，进行35个循环；95 ℃，10 s，60 ℃，5 s；95 ℃，15 s。

表  2  干细胞标记物荧光定量PCR检测引物

Table  2.  Primers for fluorescent quantitative PCR detection of stem cell markers

基因名称 Gene name	正向引物序列(5′→3′) Forward primer sequence	反向引物序列(5′→3′) Reverse primer sequence
Endo-Oct4	CTGGCCCCAGGCAGGTAA	CGGGATCTCCATGAACAACAG
Endo-Sox2	AAAAGGTCCAGAATTTCTAATA	CCCCAAGCAGACTTCATA
Endo-Nanog	TAGTAGTGTCCGCACCTAAC	GTATGCAACCAGCTCACC
Endo-Lin28	CAAACAAACCCAAAGATACG	AAAGCCAATGCCAAGTGA
Sall4	GAACTTCGGTCGTGGCACAAGG	AATACCAAGTGAGCGTCCCATTAGC
Gata4	ACAGTTGACACATTCTCGCCCTTC	CCACTTGGACTTCTTCGCCCTTC
Gata6	ACACCAGTGATCCTGCCTGACG	AGAGAGCACCAGTCCCGAAAGC
Pax6	ATGGGCTGGCTATTCATG	CCCCGTTTCCTCTTTCAC
GAPDH	GCACGATGCATTGCTGACAA	GGGTGGTGCTAAGCGTGTTA

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1.9   数据分析

本试验中获得的原始数据均通过GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，并通过LSD法分析不同数据之间是否存在显著差异。

2.   结果与分析

2.1   多能基因的扩增与慢病毒质粒的构建

抽提早期鸡胚的RNA并将总RNA反转录为cDNA后，用设计好加入同源片段的引物，以对应模板对多能基因进行PCR，扩增多能基因的编码区全序列。将PCR产物经过10 g/L凝胶电泳，Oct4在888 bp、Sox2在968 bp、Klf4在1377 bp、C-myc在1251 bp、Nanog在930 bp、Lin28在609 bp以及Pcgf2在966 bp处出现单一特异性条带，与预期7个基因的条带大小均一致，结果如图1所示。将片段回收，经过DNA纯化后与PCDH-CMV载体连接并转化至Stbl3感受态细胞中，过夜培养后将单克隆挑出扩大培养并抽提质粒，将抽提出的7个重组质粒经过BamH I与Nhe I双酶切消化过夜后，经过10 g/L凝胶电泳获得8176 bp的线性化载体条带及对应大小的多能基因的条带，均与预期条带完全一致，结果如图2所示。将经过双酶切及PCR验证正确的pCDH-Oct4等7个重组慢病毒质粒进行测序。分析测序结果表明，7个基因的重组质粒的编码区没有发生移码突变或碱基缺失，碱基突变均为同义突变。上述结果表明，7个pCDH-CMV重组慢病毒质粒均构建成功。

图  1  不同多能基因的PCR结果

Figure  1.  PCR results of different pluripotent genes

M：DL2000 DNA marker

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图  2  不同多能基因的重组慢病毒质粒酶切结果

Figure  2.  Enzyme digestion results of recombinant lentiviral plasmids with different pluripotent genes

M：DL15000 DNA marker

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2.2   慢病毒包装及慢病毒滴度测定

将7个多能基因及候选多能基因的重组慢病毒质粒通过Lipo3000转染试剂盒和辅助质粒PLP1、PLP2、VSVG共转染到293T细胞中。转染24 h后即能在倒置荧光显微镜中观察到GFP绿色荧光，并在转染48~72 h后绿色荧光表达到达顶峰，均可使90%以上细胞表达GFP绿色荧光，结果如图3所示。

图  3  倒置荧光显微镜下观察293T包装慢病毒

Figure  3.  293T packaging lentivirus observed under inverted fluorescence microscope

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将回收的病毒液上清过滤并浓缩后，经过倍比稀释后加入到96孔板中孵育，并按照稀释倍数标注为10¹~10⁻⁵ μL共7个梯度。继续培养48 h后，将细胞放在倒置荧光显微镜下逐个稀释度观察并记录，结果如图4所示。

图  4  倒置荧光显微镜下观察倍比稀释后细胞感染慢病毒情况

Figure  4.  Cells infected with lentivirus after multiplier dilution and observed under inverted fluorescence microscope

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从上述结果可知，7个经过包装的慢病毒感染细胞后均有表达GFP绿色荧光基因，将发出绿色荧光的细胞视为感染了对应的慢病毒，可观察到感染了对应慢病毒的细胞随着稀释度的提高而减少。根据最低可观察到绿色荧光的稀释梯度中能观察到的感染细胞数，计算对应慢病毒的病毒滴度，得出慢病毒Lv-Oct4滴度为2×10⁹ TU/mL，Lv-Sox2滴度为1×10⁹ TU/mL，Lv-Klf4滴度为4×10⁹ TU/mL，Lv-C-myc滴度为2×10⁹ TU/mL，Lv-Nanog滴度为1×10⁹ TU/mL，Lv-Lin28滴度为1×10⁹ TU/mL，Lv-Pcgf2滴度为5×10⁹ TU/mL。

2.3   碱性磷酸酶检测

CEF经过不同的慢病毒组合感染并连续培养，在更换为iPSC Medium后开始出现细胞聚团并发生形态上的改变，在连续培养后在培养皿中形成致密的细胞。在病毒感染第8天开始检测碱性磷酸酶，从结果(图5)可知，2种加入慢病毒的组合从第8天开始均可以检测到碱性磷酸酶活性的表达，表现为经过BCIP/NBT染色后，如果细胞中带有碱性磷酸酯酶，可以水解BCIP并生成一种物质与NBT形成不融解的蓝紫色NBT-formazan。结果证明，经过多种慢病毒组合后诱导的CEF呈碱性磷酸酶阳性，表明经过慢病毒诱导，鸡体细胞开启了重编程状态，存在或可能存在成功诱导的鸡多能干细胞。

图  5  碱性磷酸酶活性检测结果

A：Lv-OSKMNL；B：Lv-OSKMNL+Pcgf2；C：空白对照 Mock

Figure  5.  Results of alkaline phosphatase activity assay

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2.4   荧光镜检及荧光定量PCR检测

在CEF诱导为iPSC的过程中，利用荧光显微镜对细胞形态进行观察，随后，通过荧光定量PCR检测细胞中的内源性多能因子基因的表达水平，并检测了经过20 d培养后细胞中三胚层相关标记基因的相对表达量，通过以上检测结果判断细胞的多能性及其状态。将细胞样品通过多聚甲醛固定处理后，通过荧光显微镜观察可得知，Lv-OSKMNL组从第8天开始细胞大多发出绿色荧光，在第16、24和28天的样品中可观察到细胞聚团，其形状为不规则的圆形，且在细胞聚团处可观察到绿色荧光聚集，其边界较为清晰，而在Lv-OSKMNL+Pcgf2组中，从第12天开始即可观察到细胞聚团，且一直到第28天均可以找到边界清晰、呈椭圆状的细胞聚团，随着培养时间的加长，细胞聚团的数量增多且体积增大，且都有较高的绿色荧光强度，结果如图6所示，相较Lv-OSKMNL组，出现细胞聚团的时间更早也更为稳定。

图  6  荧光镜检观察重编程细胞聚团形成过程

Figure  6.  Fluorescence microscopy observation of the formation process of reprogrammed cell clusters

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从荧光定量PCR的结果可以得知，Lv-OSKMNL组与Lv-OSKMNL+Pcgf2组均可以有效激活内源性基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28的表达，相较于CEF(空白对照)来说均有显著提高(P < 0.01)，但Lv-OSKMNL+Pcgf2组相较于Lv-OSKMNL组，更为稳定地表达内源性Sox2和Nanog，且表达量较高，内源性Lin28在培养了20 d后也显著高于Lv-OSKMNL组。Sall4是一个与Sox2和Oct4表达相关的多能基因，在Lv-OSKMNL组内其表达相对于CEF并无显著提高，但Lv-OSKMNL+Pcgf2组从培养第12天起Sall4的表达量均有显著提高(P < 0.01)，结果如图7所示。而Gata4、Gata6、Pax6分别是胚外内胚层、胚外中胚层、胚外外胚层的标记基因，在Lv-OSKMNL组中的表达量均远低于CEF，但Lv-OSKMNL+Pcgf2组Gata4虽呈下降趋势，但表达量依然显著高于其他组(P < 0.01)，而Pax6表达量随着培养时间延长不断提高，且显著高于其他组(P < 0.01)，结果如图8所示。

图  7  不同内源性基因的荧光定量PCR检测

各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05， LSD法)

Figure  7.  Fluorescence quantitative PCR assay of different endogenous genes

In each figure, different lowercase letters above columns at the same time indicate significant differences among treatments (P<0.05, LSD method)

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图  8  三胚层标记物的荧光定量PCR检测

各图中，相同时间柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05， LSD法)

Figure  8.  Fluorescence quantitative PCR assay of triploblastic markers

In each figure, different lowercase letters above columns at the same time indicate significant differences among treatments (P<0.05, LSD method)

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3.   讨论与结论

3.1   讨论

iPSC诱导效率不高与重编程不完全一直是iPSC诱导存在的主要问题。在目前的重编程因子体系下，小鼠体细胞重编程效率只有大概1%，而在人类上更是只有0.1%。研究者们通过不同的办法提高重编程的效率，比如在培养基中添加维生素C，通过延缓细胞衰老来增强重编程，可以有效加速iPSC朝完全重编程的状态过渡^[13]；或者通过抑制Ink4/Arf位点如P16位点来提高iPSC的生成^[14]；也有通过加入其他外源因子来达到这种目的，如有研究者发现诱导体系中加入Etv5可以有效促进MET的过程从而促进iPSC的诱导^[15]。而在鸡的iPSC中发现，仅用传统的重编程因子Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4共同诱导多能干细胞并不能完全激活iPSC中内源性Nanog与Lin28的表达，仍需要优化诱导的条件或找到合适的重编程因子^[7]。

在本研究中根据Liao等^[12]的研究从中选取了在鸡胚早期高度表达的Pcgf2基因。Pcgf2是一种表达PcG蛋白的基因，PcG蛋白是一种可以调控表观遗传染色质修饰的蛋白，不同的研究均表明，PcG蛋白不仅可以诱导已分化的细胞重编程为多能干细胞，对干细胞的维持也有着重要的作用^[16-17]。在本研究中，将Pcgf2加入到传统的重编程因子Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4组成的诱导体系中会导致更早地出现细胞聚团，且通过荧光定量PCR的结果得知，在加入Pcgf2后，内源性Sox2、Nanog和Sall4均稳定表达且显著提高，与此同时内胚层与外胚层的标记基因相较于CEF空白对照组，Lv-OSKMNL组也有着显著的提高。有研究表明，Naive态多能干细胞更接近体内胚胎植入前的发育特征，具有更高的分化潜能，而在Primed-to-naive 转变过程中会出现滋养外胚层样和原始内胚层样异质性细胞群体^[18]。以上结果均充分表明，通过将Pcgf2加入到Lv-OSKMNL的诱导体系中共同诱导多能干细胞后，细胞重编程更为接近完全多能的状态，但Pcgf2在该过程中具体的作用机制尚不清楚，仍需要进一步的研究与验证。

3.2   结论

通过构建慢病毒诱导体系，初步建立了诱导鸡多能干细胞的体系。在传统重编程因子的诱导体系中加入Pcgf2后可以有效提高内源性多能基因的表达，且更早更稳定地出现细胞聚团。本研究首次探究了Pcgf2在诱导多能干细胞中的作用，研究结果为后续鸡多能干细胞机理机制的研究以及应用提供了新的思路与方法。