Development and application of KASP marker for rice blast resistance gene Pi2
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摘要:目的
水稻稻瘟病抗性基因Pi2对稻瘟病生理小种具有广谱抗性，开发Pi2的KASP分子标记并对其评价，为抗稻瘟病水稻品种分子育种提供简便、可靠的基因分型检测方法。
方法利用593份自然群体中筛选出的不同抗性和亲缘关系的2份材料H-74和H-78，针对Pi2基因核心区域的SNP位点开发成KASP标记Pi2-C3。
结果利用标记Pi2-C3对自然群体中的84份材料进行KASP基因分型，结果表明，该标记可以准确地将不同水稻材料的Pi2位点分为抗病基因型、杂合基因型和感病基因型，是一种高效鉴定抗稻瘟病基因Pi2的方法。利用标记Pi2-C3对阳江市病圃材料进行检测，结合表型调查结果发现，检测到含有Pi2基因的46份材料均表现出不同程度的稻瘟病抗性，表明该标记可以用于检测材料在病圃的发病情况。
结论本研究采用KASP技术，开发了能准确检测Pi2基因的特异性分子标记Pi2-C3，并建立一套水稻Pi2基因的KASP基因分型体系，对提高抗性育种效率，改良抗稻瘟病水稻品种具有重要应用价值。
Abstract:ObjectiveThe rice blast resistance gene Pi2 has broad spectrum resistance to physiological race of rice blast. Developing and evaluating KASP molecular markers for Pi2 will provide a convenient and reliable gene typing method for molecular breeding of rice varieties with blast resistance.
MethodTwo materials H-74 and H-78 with different resistance and genetic relationships selected from 593 natural populations were used to develop KASP marker for the SNP sites in the core region of the Pi2 gene, named Pi2-C3.
ResultUsing the marker Pi2-C3, 84 materials from the natural population were genotyped, and the results showed that the Pi2-C3 marker accurately distinguished the Pi2 loci of different rice materials into resistant, heterozygous, and susceptible genotypes, which was an efficient method for identifying the blast-resistant gene Pi2. The marker Pi2-C3 was used to detect the materials in Yangjiang disease nursery. Combined with the phenotypic investigation, it was found that 46 materials containing Pi2 gene showed different degrees of rice blast resistance, which indicated that the marker could be used to detect the incidence of materials in disease nursery.
ConclusionThis study develops a specific molecular marker Pi2-C3 for accurately detecting the Pi2 gene using the KASP technology, and establishes a KASP genotyping system for rice Pi2 gene. It has important application value for improving the efficiency of resistance breeding and improving blast-resistant rice varieties.
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Keywords:
- Rice /
- Rice blast /
- Pi2 gene /
- KASP marker /
- Molecular marker /
- Resistance gene /
- Genotyping
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腐植酸(Humic acid，HA)是动植物残体通过复杂的生物及物理化学作用形成的天然有机高分子混合物。按腐植酸相对分子质量的大小和溶解性能可将其分为棕腐酸(又称胡敏酸)、黑腐酸(又称真腐酸)和黄腐酸(又称富里酸)3大类。由于腐植酸的特殊结构和官能团赋予它对植物生长的刺激和促进作用[1-2]，所以几十年来腐植酸的研究与应用一直受到各界的关注。近40年来，由于化肥大量和不合理施用等原因[3-5]，已导致我国70%的土壤存在耕作障碍，0.23×109 hm2耕地被污染，土壤板结、养分失衡、有机质贫乏等问题普遍存在[6-8]。特别是土壤酸化除了引起土壤物理化学障碍以外，更重要的是破坏了土壤微生物群落结构[9-11]，致使土传病害严重，例如香蕉枯萎病的肆虐已经威胁到我国香蕉产业[12-14]。
为了农业的持续和健康发展，亟需开展耕地保育，为此腐植酸肥料引起各方面的长期关注。据国家化肥登记中心网站资料统计，近些年腐植酸肥料产品登记数量剧增，占前20多年同类产品登记总数的60%以上[15]。然而当前腐植酸类型的肥料仍然是常规酸性或生理酸性化肥与腐植酸的复混肥。虽然肥料中的腐植酸有改土培肥的效果，但是由于化肥与腐植酸的双重酸性导致腐植酸肥料的酸性更强，酸性对土壤的危害可能大于腐植酸本身的有益功能。例如肥料的酸性会加剧土壤的酸化，而土壤酸化又会进一步带来诸如土壤重金属活化、病虫害加剧等一系列土壤耕作障碍问题。故此，研发高pH化肥及其与腐植酸的复合(混)肥是解决问题的根本出路。本文作者团队提出了碱性肥料的概念[16]，并研发了碱性肥料、碱性腐植酸肥料的制造与应用技术。然而相对而言，我国的碱性腐植酸肥料研究还相当薄弱。同时，我国腐植酸肥料主要应用于三大粮食作物及部分蔬菜、棉花等经济作物上[17]。在小麦、玉米、水稻作物上施用酸性腐植酸肥料[18-20]，不但其酸害不明显，特别是施用于北方种植小麦、玉米的石灰性土壤上，还能降低土壤pH，有利于作物生长。但是，在南方的酸性土壤上施用酸性腐植酸肥料，不仅难于发挥腐植质的改土作用，而且由于肥料的酸性还会造成土壤Cd等重金属活化[21-22]、加剧香蕉枯萎病发生[9, 12, 14, 23]。如果将腐植酸肥料的化学性质由酸性改变成碱性，那么上述问题就会迎刃而解，同时还能充分发挥腐植酸的各种有益功能。腐植酸型碱性液体复合肥料就是本文作者所在广东高校环境友好型肥料工程技术研究中心针对目前酸性腐植酸肥料的短板而研发的新型腐植酸肥料。本文以热带亚热带酸性土壤及该地区主要经济作物香蕉为对象，系统地研究腐植酸碱性液体肥料对香蕉的生长效应，并通过土壤微生物群落数量、土壤养分、土壤酶活性等方面的研究，揭示腐植酸碱性液体肥料的作用机理，为腐植酸型碱性液体复合肥在香蕉产业中的应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试肥料是华南农业大学广东高校环境友好型肥料工程技术研究中心研发的腐植酸型碱性液体复合肥料(简称腐植酸碱性液体肥)。腐植酸碱性液体肥是参考含腐植酸水溶肥料标准[24]，采用羟甲基脲醛工艺制造的，与对照肥料氮磷钾相等、腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g/L，分别标记为AF0、AF1、AF2和AF3。肥料的氮磷钾总量均为 500 g/L，N、P2O5、K2O质量比为1.0︰0.5︰2.0，pH为9.0。另外，以尿素、过磷酸钙及硫酸钾、氯化钾为原料配制氮磷钾总质量比为45%，其氮、磷、钾比例与液体复合肥相等的掺混肥为常规复合肥，标记为Comp。共计5种供试肥料，即5个试验因素。
供试土壤采自华南农业大学树木园，风干后过10 mm筛，按照土壤∶椰糠为2.5∶1.0的体积比混合。供试土壤的理化性状如下：全氮0.73 g/kg，速效氮46.62 mg/kg，速效磷0.45 mg/kg，速效钾55.35 mg/kg，有机质11.70 g/kg，土壤pH 6.1。
供试盆钵是盆口直径17 cm，高度15 cm的红色塑料盆，每盆装土2.2 kg。供试地点在华南农业大学广东高校环境友好型肥料工程技术研究中心网室。供试作物是具有4片绿叶的健康巴西蕉假植苗。选用香蕉为供试作物的优点一方面在于它是典型的热带亚热带作物，有利于研究结果在当地的应用，另一方面香蕉生长期长，即使研究其苗期的肥料效应，时间长达3个月，已达到热带亚热带叶菜和大部分果菜的生长期，结果对这类大田作物有一定的指导意义。
1.2 试验设计与管理
试验采用5因素(上述5种肥料)对比设计，即腐植酸AF0、AF1、AF2和AF3和常规复合肥Comp共5个处理，其中Comp和AF0为对照，每个处理重复6次，每盆1株，单株为1个重复。Comp和AF0的比较用于研究常规固态肥料与等养分液体肥料的差异，AF0和FA1、FA2、FA3的比较用于研究等养分液体肥料中有无腐植酸的差异。每个处理的养分用量相等，即香蕉移栽后第1个月，每周施肥1次，肥料溶液的质量浓度为2 g/L，每次浇灌200 mL/盆。第2个月开始至试验结束每周施肥1次，肥料溶液的质量浓度为3 g/L，每次浇灌200 mL/盆。香蕉移栽90 d后收获采样。香蕉生长期进行正常的浇水、病虫害防治等日常管理。
1.3 测定项目及方法
肥料N、P、K的含量参考农业标准NY/T1977—2010方法测定[25]。腐植酸的含量根据农业标准NY/T1971—2010方法测定[26]。土壤pH用电位计法测定；土壤铵、硝态氮用0.01 mol/L 的CaCl2浸提，然后用AA3自动分析仪测定；土壤有效磷用NH4F-HCL法测定[27]。香蕉株高用直尺统一测量基部到最新完全展开叶与茎的交叉点的距离(精度0.1 cm)；茎粗用游标卡尺统一测量距地表2 cm处香蕉假茎的直径(精度0.1 mm)；叶面积 = 叶长×叶宽×0.762 9+0.026 6，其中0.763 9和0.026 6为香蕉叶面积系数；叶片叶绿素相对含量用便携式502 SPAD仪测定完全展开的倒数第2片叶的SPAD值，每片叶子测6个点，包括叶缘基部、中部和尾部，最后取平均值。根系活力用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定[28]。土壤微生物群落用平板培养法测定[29]。土壤脲酶活性用靛酚蓝比色法测定，土壤磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定[29]。
1.4 数据处理与分析
数据的统计分析采用SPSS 17.0软件，图表采用Microsoft office excel绘制。
2. 结果与分析
2.1 腐植酸碱性液体肥对香蕉生长指标的影响
表1结果表明，常规复合肥(Comp)和无腐植酸碱性液体肥(AF0)间的株高、茎粗、叶面积和叶片SPAD值无显著差异，表明肥料的形态以及液体肥的碱性不影响其肥效。但是腐植酸碱性液体肥处理(AF1、AF2和AF3)的株高均显著大于Comp和AF0处理的株高，其中，比Comp的增加了2~4 cm，比AF0的增加了3~5 cm。AF1、AF2和AF3处理的叶面积明显大于Comp和AF0处理的，其中，比Comp的增加了50~65 cm2，比AF0的增加了85~100 cm2。结果显示，Comp、AF0、AF1和AF2处理间的茎粗无统计学上的差异，只有AF3的茎粗较Comp的增加了11%，且差异显著。AF1、AF2和AF3处理的SPAD值明显大于AF0的。由此可见，当养分含量相等时，Comp和AF0的肥效相等，但是两者的肥效不如碱性液体腐植酸肥料的肥效，腐植酸碱性液体肥能更好地发挥其碱性与腐植酸的协同效果，从而增加叶面积和叶绿素的含量，促进香蕉生长。
表 1 腐植酸碱性液体肥(AF)对香蕉株高、茎粗、叶面积和叶片SPAD值的影响1)Table 1. Effect of humic acid alkline liquid fertilizer (AF) on plant height, stem diameter, leaf area and SPAD value of banana肥料类型
Fertilizer typeρ(腐植酸)/(g·L−1)
Humic acid content株高/cm
Plant height茎粗/cm
Stem diameter叶面积/cm2
Leaf area叶片SPAD值
SPAD value of leafComp 0 27.75±1.44bc 27.22±0.60b 571.10±8.91ab 52.52±0.73c AF0 0 26.52±0.77c 28.44±0.43ab 536.12±29.23b 56.14±1.63bc AF1 10 29.8±0.51ab 28.33±0.40ab 621.23±12.29a 61.02±1.17a AF2 30 31.63±1.06a 28.82±0.67ab 635.89±37.53a 59.87±1.13ab AF3 50 31.26±1.17a 30.18±0.77a 625.96±30.94a 57.20±1.79ab 1) Comp：常规复合肥；表中数据为平均值±标准误，n=6；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，DMRT法)
1) Comp: Conventional compound fertilizer; Data are means ± SE, n=6; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments (P<0.05, DMRT method)2.2 腐植酸碱性液体肥对香蕉生物量的影响
腐植酸型碱性液体肥有利于香蕉生长和光合作用的效果还体现为能明显地提高香蕉的生物量(表2)。与Comp和AF0相比，腐植酸碱性液体肥料处理(AF1、AF2和AF3)的根鲜生物量分别提高了10.2%~15.1%和5.9%~10.7%。但AF1、AF2和AF3处理间的根鲜生物量差异不显著。AF1、AF2和AF3处理的茎鲜生物量比Comp和AF0处理分别提高了16.1%~26.0%和8.1%~17.4%，三者间以AF3处理显著高于其他2个处理，提高了6.8%~8.6%。AF1、AF2和AF3处理的叶鲜生物量比Comp和AF0处理的分别提高了27.5%~41.8%和13.3%~26.1%，三者之间结果与茎鲜生物量一致，以AF3最高，较AF1和AF2提高了6.3%~11.2%。AF0处理的茎、叶鲜生物量明显大于Comp的，分别增加了约7.3%和12.5%。就地上部鲜生物量而言，施用腐植酸碱性液体肥和无腐植酸碱性液体肥均能明显增加香蕉的地上部生物量。AF0、AF1、AF2和AF3的地上部鲜生物量分别比Comp的增加了9.4%、24.3%、20.7%和32.5%，其中腐植酸碱性液体肥的生物量比无腐植酸碱性液体肥的增加了10.3%~21.0%。说明腐植酸具有明显的促生效果，而且腐植酸与碱性液体肥的复合更能显著提高香蕉的生物量。
表 2 腐植酸碱性液体肥(AF)对香蕉单株鲜生物量的影响1)Table 2. Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on fresh biomass per plant of bananag 肥料类型
Fertilizer typeρ(腐植酸)/(g·L−1)
Humic acid content根
Root
茎
Stem
叶
Leaf
地上部
AbovegroundComp 0 21.83±0.44b 104.17±2.21d 71.54±2.46d 175.71±4.03d AF0 0 22.71±0.42b 111.80±3.36c 80.49±3.23c 192.28±4.39c AF1 10 24.08±0.36a 122.97±3.21b 95.41±3.33b 218.38±4.66b AF2 30 24.05±0.52a 120.89±2.58b 91.25±3.00b 212.13±3.14b AF3 50 25.13±0.40a 131.29±2.18a 101.46±1.30a 232.74±3.70a 1) Comp：常规复合肥；表中数据为平均值±标准误，n=6；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，DMRT法)
1) Comp: Conventional compound fertilizer; Data are means ± SE, n=6; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments (P<0.05, DMRT method)2.3 腐植酸碱性液体肥对香蕉根系活力的影响
肥料处理对香蕉根系活力影响的结果见图1。3个腐植酸碱性液体肥处理的根系活力均显著大于常规复合肥(Comp)和无腐植酸碱性液体肥(AF0)的，其中AF1、AF2和AF3的根系活力比Comp的分别增加了89%、148%和66%，比AF0的分别增加了119%、188%和93%。AF2处理的根系活力增量最大，分别比AF1和AF3增加了32%和49%。根系活力强则有利于香蕉根系吸收利用养分和水分而促进其生长。由此可见，腐植酸碱性液体肥较常规复合肥和无腐植酸碱性液体肥可以显著地提高香蕉根系活力，且在腐植酸用量为30 g/L时对于增加香蕉根系活力的效果最佳。无腐植酸碱性液体肥和常规复合肥处理间的根系活力无显著差异，因此，碱性肥料与腐植酸配合是增加香蕉根系活力的有效措施。
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图 1 腐植酸碱性液体肥(AF)对香蕉根系活力的影响Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)Figure 1. Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on root vigor of bananaComp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; Different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)2.4 腐植酸碱性液体肥对土壤酶活性的影响
肥料处理对土壤脲酶和酸性磷酸酶活性影响的结果见图2。5个处理的脲酶活性大小为AF2 >AF3 > AF1 > AF0 > Comp，其中AF1、AF2和AF3处理的脲酶活性比Comp处理的分别增加了25%、91%和61%，比AF0处理的分别增加了7.0%、64.4%和38.3%。AF0和Comp处理的脲酶活性也有明显的差异，前者比后者的增加了16%( 图2A)。可见，碱性液体肥较常规肥复合肥可明显增加土壤脲酶活性，其中腐植酸用量为30 g/L 时的效果最佳，促进脲酶活性最明显，这一结果和腐植酸碱性液体肥对根系活力影响的结果一致。腐植酸碱性液体肥对土壤酸性磷酸酶活性影响的结果表现为，AF1、AF2、AF3的酶活性均显著高于Comp和AF0处理的，分别是Comp的3.5、3.3和3.4倍，分别是AF0的2.6、2.5和2.4倍，3个腐植酸碱性液体肥料之间的酸性磷酸酶活性无显著差异，Comp和AF0之间无显著差异(图2B)。脲酶是土壤氮素循环中的关键酶，其活性与土壤氮素的转化关系密切，酸性磷酸酶参与土壤有机磷分解。故此，腐植酸碱性液体肥较常规肥料在提高土壤脲酶和酸性磷酸酶活性方面功能更强，从而改善香蕉的氮、磷营养。综合土壤脲酶活性和土壤酸性磷酸酶活性，肥料中腐植酸用量为30 g/L 时为宜。
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图 2 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤脲酶和酸性磷酸酶活性的影响Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；各图中，柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)Figure 2. Effects of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on soil urease and acid phosphataseComp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; In each figure, different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)2.5 腐植酸碱性液体肥对土壤矿质态氮和有效磷含量的影响
土壤矿质态氮是土壤中铵态氮(NH4+)与硝态氮(NO3−)之和。本文研究矿质态氮的目的一方面在于检验肥料的碱性是否会造成氨的损失；另一方面是为了检验肥料的腐植酸是否可以通过改良土壤微生物群落而改善土壤的氮素营养状况。结果表明，在施氮量相等的条件下，AF1、AF2、AF3处理土壤的铵态氮含量均显著高于对照处理(Comp和AF0)，其中腐植酸碱性肥料处理之间、常规肥料和无腐植酸碱性液体肥处理之间的铵态氮含量无统计学差异(图3A)。说明施用碱性肥料并未导致氨挥发而损失氮素，而腐植酸的加入明显增加了香蕉可利用的氮。其可能原因是肥料中的腐植质促进了土壤脲酶的活性(图2)。图3B结果还表明，腐植酸碱性液体肥处理(AF1、AF2和AF3)和常规肥料处理(Comp)、无腐植酸碱性肥(AF0)间硝态氮含量均无显著差异。说明无论是碱性肥料还是常规肥料并未影响土壤的硝化作用，其可能原因和酸性土壤硝化作用弱有关。就土壤矿质态氮而言，AF1、AF2、AF3的矿质态氮含量无统计学差异，但是均大于Comp和AF0的含量。由此可见，施用腐植酸碱性液体肥不但不会造成土壤氮素损失，反而能够明显地增加土壤的矿质态氮含量，从而提高土壤供氮量，改善香蕉的氮素营养。
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图 3 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤矿质态氮含量的影响Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；各图中，柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)Figure 3. Effect of humic cacid alkaline liquid fertilizer (AF) on mineral nitrogen content in soilComp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; In each figure, different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)施用腐植酸碱性液体肥明显增加了土壤有效磷含量(图4)。无腐植酸碱性液体肥处理(AF0)和常规复合肥处理(Comp)间的有效磷含量无显著差异，但均显著低于腐植酸碱性液体肥处理AF1、AF2、AF3。腐植酸碱性液体肥处理间以AF3的有效磷含量显著大于AF1和AF2处理的。就平均土壤有效磷含量而言，腐植酸碱性液体肥处理比未添加腐植酸的Comp和AF0增加了127%，其中AF3处理比Comp和AF0平均增加了183%，AF1和AF2处理比Comp和AF0平均增加了99%。其主要原因是肥料中添加腐植酸后明显增加了土壤的酸性磷酸酶活性(图2)，从而有利于土壤有机磷的水解[30]。可见，肥料中施用腐植酸碱性液体肥能够显著提高土壤中有效磷含量，减少磷元素的固定和损失，其中以腐植酸用量为50 g/L 时效果最佳。
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图 4 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤有效磷含量的影响Comp：常规复合肥；AF0、AF1、AF2和AF3：腐植酸质量浓度分别为0、10、30和50 g·L−1；柱子上方的不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05，DMRT法)Figure 4. Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on available phosphorus content in soilComp: Conventional compound fertilizer; AF0, AF1, AF2 and AF3: The concent of humic acid is 0, 10, 30 and 50 g·L−1, respectively; Different lowercase letters on the bars indicate significant differences among treatments (P < 0.05, DMRT method)2.6 腐植酸碱性液体肥对土壤微生物的影响
由表3可知，细菌、真菌和放线菌数量均是碱性腐植酸肥料处理明显多于Comp和AF0，Comp和AF0之间无显著差异。在腐植酸碱性肥料中，表现为随着肥料中腐植酸用量的增大，土壤的细菌、真菌和放线菌数量随之增加，当腐植酸的用量为50 g/L(AF3)时微生物数量最多。其中AF3、AF2、FA1的细菌数量分别是Comp的14.4 、4.1和 1.6倍，AF3和AF2的细菌数量分别是AF0的10.6和3.0倍；AF3、AF2、FA1的真菌数量分别是Comp的26.7、2.6和1.7倍，分别是AF0的56.0、5.8和3.9倍；AF3、AF2、FA1的放线菌数量分别是Comp的3.8、2.3和2.6倍，分别是AF0的2.0、1.2和1.4倍。可见，土壤施用碱性肥料与腐植酸协同(腐植酸碱性液体肥)是增加土壤微生物数量、改善土壤微生物结构、促进植物生长的有效措施，肥料中腐植酸用量为50 g/L时，土壤细菌、真菌和放线菌数量均最多。
表 3 腐植酸碱性液体肥(AF)对土壤微生物数量的影响1)Table 3. Effect of humic acid alkaline liquid fertilizer (AF) on microbial population quantity in soil肥料类型
Fertilizer typeρ(腐植酸)/(g·L−1)
Humic acid content细菌/(×105 cfu·g−1)
Bacteria真菌/(×104 cfu·g−1)
Fungi放线菌/(×103 cfu·g−1)
ActinomycesComp 0 1.28±0.12c 6.34±0.43cd 1.76±0.44de AF0 0 1.74±0.38c 2.82±0.30d 3.32±0.42d AF1 10 2.01±0.36c 11.08±0.65c 4.51±1.09b AF2 30 5.20±0.55b 16.36±1.55b 4.03±0.40bc AF3 50 18.44±0.50a 169.08±0.80a 6.67±0.39a 1) Comp：常规复合肥；表中数据为平均值±标准误，n=6；同列数据后的不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05，DMRT法)
1) Comp: Conventional compound fertilizer; Data are means ± SE, n=6; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among treatments (P<0.05, DMRT method)3. 讨论与结论
当前我国耕地面临的问题是土壤酸化和土壤有机质缺乏引起的耕地质量退化。提升耕地质量和保障作物健康生长和优质高产的关键就在于改良过低的土壤pH，并防止土壤进一步酸化，同时增加土壤有机质，为此就要从根治耕地退化的源头着手。我国耕地酸化的直接原因是长期大量、过量和不合理施用化学酸性化肥(如复合肥)和生理酸性化肥(如尿素、铵态氮肥)。近40年来，红壤pH从第2次土壤普查的6.0~6.5，下降到了目前的5.5左右，平均下降了0.2~0.5个单位，有些土壤降低了1.5~2个单位[3-5]。土壤酸化又导致了土壤Cd等重金属活化及其污染，并通过食物链威胁人类健康[31-32]。土壤有机质缺乏的原因是施入土壤的有机肥质量良莠不齐，很多有机肥缺乏腐植质，对土壤的培肥改良效果不佳。尽管治理土壤酸化及其引起的土壤重金属污染、增加土壤有机质和提升地力是国家耕地保育的重中之重，然而长期以来，治理土壤酸化的方法是施用石灰和石灰性工业废弃物，而长期施用石灰不仅导致土壤板结，且改良效果不持久，容易返酸[33]；施用石灰性工业废弃物又可能造成新的土壤污染问题。因此，要实现治理土壤酸化、土壤重金属污染和提升地力，就必须从绿色投入品着手，即研发和施用新型的碱性肥料替代常规的酸性或生理酸性肥料，实现在施肥和给作物提供营养物质的同时改良土壤酸性。也就是说解决由于大量和不合理施肥引起的土壤酸化、土壤酸化又导致Cd污染问题之根本出路在于改变肥料的酸碱性，同时将腐植酸和肥料结合，研制腐植酸型碱性肥料，这也就是本文研究的目的所在。以往的研究证明碱性肥料的碱性可以中和土壤的活性酸和潜性酸而改良土壤酸性[34]，与普通肥料比较，碱性肥料还具有抗病促生的功能[9,16, 23]。若肥料中再附以腐植酸，直接增加土壤的腐植质，既可培肥和改良土壤，又可为作物提供生长调节物。因此，腐植酸碱性液体复合肥是可以替代常规复合肥的功能肥料。
本文研究结果证明，应用腐植酸碱性液体肥有利于促进香蕉苗的生长，包括促进株高、茎粗和叶绿素含量，增加香蕉苗的生物量，为香蕉高产优质打好基础。本研究结果还表明：施用腐植酸碱性肥料后，肥料的碱性改良了土壤酸性环境，使其有利于土壤微生物多样性；肥料的腐植酸增加了土壤的脲酶和酸性磷酸酶活性，从而增加了土壤的矿质态氮和有效磷等养分；碱性环境和腐植酸协同作用有利于改善土壤环境和土壤营养状况，使香蕉的根系活力增加，从而促进香蕉的生长。
由此我们认为研制和推广应用腐植酸碱性液体肥料是以肥治肥、以肥治酸改土、培肥土壤和营养作物的有效措施。
与常规肥料相比，施用腐植酸碱性液体肥能明显促进香蕉生长，其机制在于一方面肥料的碱性改良了土壤酸性环境，增加了土壤细菌、真菌和放线菌数量，促进了土壤微生物多样性；另一方面是肥料中的腐植酸增强了土壤的脲酶和酸性磷酸酶活性，改善了土壤的氮、磷营养状况，从而有利于香蕉生长。今后相关领域可以进一步开展固体腐植酸碱性肥料制造技术、应用效果和机理的深入研究。
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图 1 系统进化树及差异SNP位点分析
A：593份材料系统进化树（Ⅰ~Ⅶ：分布密度不同的7个部分）；B：593份材料在Pi2抗性位点核心区域的差异SNP及其碱基分布情况；C：H-74和H-78材料在Pi2抗性位点核心区域差异SNP位点分布(黄色竖线区域表示两者差异SNP位点分布情况)
Figure 1. Phylogenetic tree and analysis of different SNP sites
A: Phylogenetic tree of 593 materials (Ⅰ−Ⅶ: Seven parts with different distribution density); B: Distributions of different SNPs and their bases in the core region of the Pi2 resistance locus for the 593 materials; C: Distribution of different SNP sites in the core region of the Pi2 resistance locus for H-74 and H-78 materials (The yellow vertical line area indicates the distribution of SNP sites that are different between them)
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图 2 Pi2基因差异位点序列比对
a：H-74材料，b：包含Pi2基因的材料，c：H-78材料，d、e：确定没有Pi2基因的材料；1和2表示材料的2个重复
Figure 2. Sequence alignment analysis of the different sites of Pi2 gene
a: Material H-74, b: Material containing Pi2 gene, c: Material H-78, d and e: Material without Pi2 gene; 1 and 2 represent two repetitions of the material
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图 3 KASP引物基因分型效果
A~E对应的引物分别为Pi2-C1、Pi2-C2、Pi2-C3、Pi2-C4、Pi2-C5
Figure 3. Genotyping effects of KASP primers
Primers corresponding to A−E are Pi2-C1, Pi2-C2, Pi2-C3, Pi2-C4 and Pi2-C5 respectively
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图 4 对照KASP基因分型结果
A~E对应的引物分别为Pi2-C1、Pi2-C2、Pi2-C3、Pi2-C4、Pi2-C5
Figure 4. KASP genotyping results for control samples
Primers corresponding to A−E are Pi2-C1, Pi2-C2, Pi2-C3, Pi2-C4 and Pi2-C5 respectively
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图 5 利用引物Pi2-C3增加PCR循环数后KASP基因分型结果
Figure 5. KASP genotyping results after increasing PCR cycles by primer Pi2-C3
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图 6 84个田间材料Pi2-C3 KASP分子标记的验证
A：Pi2 KASP基因分型检测结果；B：SSR标记检测结果(Marker位于胶图中央，大小为2 000 bp，a、 c、 d区域中相应位置片段大小与b区域标示相同)
Figure 6. Verification of Pi2-C3 KASP molecular marker for 84 field samples
A: KASP genotype detection results for Pi2; B: SSR marker detection results (marker is located in the center of the rubber map, with the size of 2 000 bp, and the corresponding fragment sizes in areas a, c and d are the same as that in area b)
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图 7 593份材料中部分材料KASP基因分型结果
A：Pi2基因KASP基因分型结果；B：Pi2基因KASP基因分型与实际基因型比对分析
Figure 7. KASP genotyping results of partial materials of the 593 materials
A: KASP genotyping results for Pi2 gene; B: Comparison analysis between Pi2 gene KASP genotyping and actual genotype
表 1 测序引物
Table 1 Sequencing primers
引物
名称
Primer
name序列(5′→3′)
Sequence预期片段
大小/bp
Expected
fragment sizePi2-F1 AAGCCTATGATTGGTTTCT 2 098 Pi2-R1 ACTGCCCTTCTTATTGTTC Pi2-F2 AACAATAAGAAGGGCAGTC 1 516 Pi2-R2 GAGGAGGAGATGAAATAGAAT Pi2-F3 AAGGTGGTGGTGCAAGTAC 258 Pi2-R3 CAATGTTATGGCATCGTTC 
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表 2 KASP引物
Table 2 KASP primers
引物名称
Primer name检测位点
Detection site序列(5′→3′)
SequencePi2-C1-F1 A GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATGAACAA Pi2-C1-F2 C GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATGAACAC Pi2-C1-R A/C TGTCCTTAGTAGGGGAGGAGG Pi2-C2-F1 C GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTATGATTCAACGATCAAGAGTGGGCAC Pi2-C2-F2 T GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTATGTATTTAAAACACAGCATGGT Pi2-C2-R C/T CCTGTCTCGAGATTGAAACTGTG Pi2-C3-F1 T GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGGAGTATGTCCTGCAAAACT Pi2-C3-F2 A GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGGGAGTATGTCCTGCAAAACA Pi2-C3-R T/A CAAACTGCATGTGCTAGACTCTTGGGTC Pi2-C4-F1 G GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATTGGTAAACTACAGGGCCTACAG Pi2-C4-F2 A GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTGGTAAACTACAGGGCCTACAA Pi2-C4-R G/A CACTTGGTAGTGCTGCAATGTATGTGCTC Pi2-C5-F1 A GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATGTCTGCATACTCTTCGTTGTATAA Pi2-C5-F2 G GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATGTCTGCATACTCTTCGTTGTATAG Pi2-C5-R A/G AGGCATATTGTGTTAGTTATGCACTTCATTGGGTG
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表 3 广东阳江病圃材料Pi2基因检测结果及抗性评价
Table 3 Pi2 gene detection results and resistance evaluation of materials from the Yangjiang disease nursery in Guangdong
编号
NumberPi2基因检测
Pi2 gene detection抗性评价
Resistance evaluation编号
NumberPi2基因检测
Pi2 gene detection抗性评价
Resistance evaluationJ-201 − 中感 J-217 + 抗 J-202 + 抗 J-218 + 抗 J-203 + 抗 J-219 − 抗 J-204 + 抗 J-220 + 中抗 J-205 + 抗 J-221 − 中抗 J-206 − 抗 J-222 − 中抗 J-207 + 抗 J-223 − 中抗 J-208 + 抗 J-224 + 抗 J-209 + 高抗 J-225 + 抗 J-210 + 高抗 J-226 − 中抗 J-211 + 抗 J-227 − 中抗 J-212 − 中感 J-228 − 中感 J-213 + 抗 J-229 − 中抗 J-214 − 抗 J-230 − 中抗 J-215 + 抗 J-231 − 中抗 J-216 + 高抗 J-232 − 中感 J-233 + 抗 J-259 + 高抗 J-234 + 抗 J-260 + 高抗 J-235 − 抗 J-261 + 抗 J-236 + 高抗 J-262 + 高抗 J-237 + 高抗 J-263 − 中感 J-238 + 中抗 J-264 − 高感 J-239 − 中抗 J-265 + 高抗 J-240 + 抗 J-266 − 高感 J-241 + 高抗 J-267 − 高感 J-242 − 高感 J-268 + 抗 J-243 + 抗 J-269 + 抗 J-244 − 感病 J-270 + 抗 J-245 + 中抗 J-271 − 抗 J-246 + 抗 J-272 + 抗 J-247 − 高感 J-273 + 抗 J-248 − 中抗 J-274 + 高抗 J-249 + 抗 J-275 − 抗 J-250 + 中抗 J-276 − 中抗 J-251 − 抗 J-277 − 中抗 J-252 + 高抗 J-278 − 感病 J-253 + 高抗 J-279 − 感病 J-254 − 中抗 J-280 − 感病 J-255 + 高抗 J-281 − 中抗 J-256 + 高抗 J-282 − 感病 J-257 + 高抗 J-283 + 抗 J-258 − 抗 J-284 − 感病
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期刊类型引用(1)
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