根据联合国粮食及农业组织(FAO)2020年的数据( https://www.fao.org/hunger/en/)，由于全球人口的持续增长和可耕地面积的持续减少，全球超过8亿人正遭受饥饿和粮食安全问题，作物产量需要大幅度增加才能满足人们对粮食的需求。大量研究证明，作物产量提升将主要依赖于生物量的提高，而生物量与光合效率密切相关。植物通过光合作用将光能转化为生物量的效率仅为1%左右，距理论效率值(5%~6%)还有很大的提升空间^[1]，因此以提高作物光合效率为中心的育种技术，被认为是新一轮的“绿色革命”^[2-4]。

提高作物光合作用效率可以从2个方面着手：一是优化光能的吸收、传递和转化效率，包括优化捕光天线系统、提高电子在光合膜上的传递效率和转化效率等^[4-7]；二是提高光合碳同化效率，包括提高核酮糖−1,5−二磷酸羧化/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase, Rubisco)羧化活性、引入C₄光合作用途径和降低光呼吸等。本文将聚焦作物光合碳同化方面的研究进展。

1.   改良Rubisco，提升其羧化效率

1.1   Rubisco的进化和催化特性

Rubisco是地球上含量最丰富的酶，其催化CO₂的固定反应是地球生物圈有机碳的主要来源。在35~40亿年前，Rubisco就已在一些远古光合细菌中出现，那时地球大气中O₂体积分数仅为现在的1/10¹⁴，而CO₂体积分数是现在的100多倍^[8-9]。也就是说，Rubisco是从没有O₂选择压的环境中进化而来，其活性中心特异性识别CO₂与O₂的能力差^[10-11]。随着蓝藻Cyanobacteria光合作用(约30亿年前)和氧气大爆发事件(Great oxidation event，约25亿年前)的出现^[12-13]，大气中CO₂体积分数逐渐下降而O₂体积分数逐渐上升，Rubisco底物特异性差、羧化效率低的缺陷随之暴露出来。尽管在漫长的进化过程中，Rubisco部分改善了对CO₂的选择能力，但仍不可避免地保留了可观的加氧反应活性。

已知的Rubisco主要有3种类型(I型、II型和III型)，高等植物的Rubisco以I型为主，一般是由8个大亚基(RbcL)和8个小亚基(RbcS)构成的L₈S₈蛋白寡聚体^[14]。不同光养生物Rubisco催化CO₂羧化反应的转换数( $K_{{\rm{cat}}}^{{\rm{c}}} $ )存在较大差异，介于2~10 s⁻¹之间，是自然界目前已知转换数最低的酶^[15]，这导致Rubisco羧化反应成为了光合碳同化过程的关键限速步骤^[16-17]。不同光养生物Rubisco的特异性常数(S_c/o)表示对CO₂和O₂的偏好程度，也呈现显著差异，介于10~240 mol/mol之间^[18-20]。如何有效提高作物Rubisco的 $K_{{\rm{cat}}}^{{\rm{c}}} $ 和S_c/o，是当前改良Rubisco以提升羧化效率的关注焦点。

1.2   提高Rubisco含量和活化水平

极低的催化速率导致植物需要大量合成Rubisco来维持正常的光合作用，植物叶片中Rubisco含量一般占总蛋白含量的20%~30%，在一些特定生长条件下可达到50%^[15]。增加作物中Rubisco含量可以提高植株整体光合速率。例如，在水稻中过表达OsRbcL、OsRbcS以及相应的Rubisco组装伴侣蛋白基因OsRAF1，转基因水稻叶片中Rubisco含量增加90%~110%，在中、高氮种植条件下光合速率提升约14%，植株增产20%~28%；但在低氮种植条件下Rubisco含量、光合速率与产量均未表现出明显优势^[21]。在玉米中过表达ZmRbcL、ZmRbcS与ZmRAF1基因，也可使转基因玉米维管束鞘细胞中Rubisco含量上升30%，CO₂同化速率提高约15%^[22]。

Rubisco由Rubisco活化酶(Rubisco activase, RCA)催化活化，其活化程度显著影响羧化反应活性。正常生长条件下，C₃植物中约80%的Rubisco可被RCA激活，但高温、干旱等逆境条件抑制RCA的催化功能，导致Rubisco羧化活性和光合效率下降^[23]。在C₃植物中提高RCA表达量或者引入热稳定性更好的RCA，可显著提高Rubisco的活化程度和催化速率，从而提升植株的整体光合速率和产量^[24-25]。

1.3   改良Rubisco催化特性

相比C₃植物，C₄植物的Rubisco具有更高的羧化速率，若能将C₄植物的Rubisco亚基导入C₃植物或者替换C₃植物中的Rubisco亚基，理论上可以显著增加植物的羧化效率，进行作物的高光效改造^[26]。

水稻有5个RbcS编码基因(OsRbcS1~5)，叶片中的RbcS由OsRbcS2~5负责编码。OsRbcS1主要在叶鞘、根以及花粉等组织中表达，其编码的RbcS1蛋白序列与叶片的RbcS序列相似性较低，基因家族进化分析结果也显示OsRbcS1与OsRbcS2~5分属不同的亚家族，OsRbcS1与葡萄Vitis vinifera L.和杨树Populus L.的RbcS序列更相似^[27]。在水稻叶片中表达OsRbcS1，转基因植株叶片中的Rubisco全酶包含原本的RbcS以及引入的RbcS1这2种小亚基，该杂合型的Rubisco表现出更高的羧化速率，其 $K_{{\rm{cat}}}^{{\rm{c}}} $ 为野生型的1.2~1.5倍，但对CO₂的亲和力与特异性下降(即S_c/o下降)，从而导致转基因水稻在正常大气中光合效率并无明显提升^[27]。

在水稻中引入C₄作物高粱Sorghum bicolor的SbRbcS小亚基基因，然后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除转基因水稻的RbcS2~5，最终获得工程水稻植株，其叶片Rubisco具有由水稻RbcL和高粱SbRbcS组成的杂合型结构。该工程植株中Rubisco羧化速率明显上升，不过也表现出对CO₂亲和力及特异性下降的问题，只有在高体积分数CO₂条件下，该水稻材料才表现出更高的CO₂同化速率^[28]。值得注意的是，上述杂合型Rubisco全酶的羧化速率( $K_{{\rm{cat}}}^{{\rm{c}}} $ )与CO₂亲和力(K_c，S_c/o)所呈现的负相关关系，在不同光合生物自然变异的Rubisco中也较常见^{[1, 29-30]}，这也表明现阶段通过遗传改良Rubisco来提高C₃作物羧化效率，仍面临着较大的理论和实践问题^{[1, 31]}。

低等光合生物(比如蓝藻和红藻Rhodophyta)Rubisco的碳同化效率一般高于C₃植物，但是其Rubisco大亚基RbcL在C₃植物中一直存在表达不理想的问题。Lin等^[32]构建了蓝藻大、小亚基及其装配蛋白的多基因表达载体，通过质体转化用多基因替换了烟草自身NtRbcL基因，获得的转基因烟草可组装具有活性的蓝藻Rubisco全酶，在高体积分数CO₂条件下(φ为0.9%)，该Rubisco具有更高的羧化活性和CO₂同化速率，研究为利用低等光合生物Rubisco改造C₃作物提供了范例。

2.   将C₄光合途径引入C₃作物，建立碳浓缩机制

提高作物CO₂同化效率，一方面可以通过改良Rubisco催化特性，另一方面可以通过提高Rubisco周围CO₂体积分数，以此形成碳浓缩机制(Carbon-concentrating mechanism, CCM)。自然界中，C₄植物光合作用是典型的CCM。

2.1   C₄植物的光合特征

C₄植物具有较高的CO₂同化能力和光合作用效率，地球上250000 种植物中只有不到3%的C₄植物，但它们产生了23%的生物量^[33]。因此，在C₃植物中引入C₄光合作用途径是当前的研究热点之一。2008年，国际水稻研究所(IRRI)启动了国际“C₄水稻”项目( http://irri.org/c4rice)，期望通过遗传改造创制高光效的C₄水稻。

C₄植物的高效光合作用主要源于其独特的叶片花环结构(Kranz anatomy)和两型细胞CO₂同化途径^[34]。花环结构特点是叶脉相对密集、维管束鞘细胞和叶肉细胞围绕叶脉形成同心层、维管束鞘细胞在内层而叶肉细胞在外层(图1)，这种解剖结构可最大化叶中2类细胞间的相邻界面，也使参与C₄光合作用的酶区室化，为其CO₂高效同化提供结构基础^[35]。

图  1  C₃与C₄植物光合作用比较^[35]

Figure  1.  Comparison of the photosynthesis pathways of C₃ and C₄ plants

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与C₃植物单细胞光合作用不同，大多数C₄植物光合作用发生在2种类型细胞中(图1)。C₄植物碳的固定发生在叶肉细胞，由磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)羧化酶催化PEP羧化反应产生四碳化合物草酰乙酸，后者转化为苹果酸或者天冬氨酸，通过扩散进入维管束鞘细胞，然后释放出CO₂。维管束鞘细胞内CO₂的释放有3种不同方式，分别由NADP−苹果酸酶(NADP-dependent malic enzyme, NADP-ME)、NAD−苹果酸酶(NAD-ME)和PEP羧激酶(PEP carboxykinase, PEPCK)催化^[35]，大多数C₄农作物都是NADP-ME类型^[36]。维管束鞘细胞内释放的CO₂在Rubisco周围形成CCM，有利于抑制Rubisco加氧反应和光呼吸，增强CO₂同化反应。

2.2   创制C₄水稻

C₄作物(比如玉米、高粱)的光能利用效率比C₃作物(比如水稻、小麦)高出50%以上，在水稻中导入C₄光合作用机制有望大幅度提高作物产量^[37-38]。然而，创制C₄水稻将会是一个逐步和长期的过程，需要2个方面的突破性工作：一是在水稻中导入完整的C₄光合生物化学过程，二是在水稻叶片中制造双细胞层的花环结构，其中关键的因素包括改变植物组织解剖结构、建立维管束鞘形态、以及确保光合酶在不同细胞中的特异性表达等^{[35, 39-40]}。

2.2.1   水稻中引入C₄光合生物化学途径

在早期的尝试中，一些C₄光合循环中起关键作用的酶，比如PEPC、磷酸丙酮酸二激酶(Pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)、NADP−苹果酸脱氢酶(NADP-malate dehydrogenase, NADP-MDH)和NADP-ME，以单个或者组合的形式在水稻中过量表达，大部分转化事件中水稻叶片光合速率并没有明显提高，而部分报道增加了光合速率和产量的转化水稻，也并非形成类似C₄植物的CCM机制^[41-43]。显然，单靠表达几个C₄途径的酶并不能产生C₄水稻，在水稻中导入完整的C₄光合生物化学过程已逐步成为共识，这需要解决以下几个方面的问题：

首先是鉴定并创制C₄水稻所需的酶和蛋白并进行功能解析。C₄光合循环包括碳酸酐酶(Carbonic anhydrase, CA)、PEPC、MDH、NADP-ME和PPDK，以及协助中间代谢产物转运的转运蛋白，比如OMT1、PPT、DiT2和NHD1等^[44]。需要指出的是，大部分C₄光合途径的酶在水稻中存在相应的异构体，并承担特定的生理功能。外源酶的导入可能破坏水稻正常代谢，造成负面生长表型^[43]。例如，水稻中过量表达玉米NADP-ME会造成光抑制、植株褪绿和生长缓慢等表现，而过量表达水稻源NADP-ME不会影响光合作用和植株生长^{[42, 45-46]}。因此，解析引入酶的表达和动力学特征是创制C₄水稻的关键一步。

其次是确保引入酶在特定的细胞类型中表达。创建C₄光合碳循环需要CA、PEPC、MDH和PPDK等蛋白在水稻叶肉细胞表达，而NADP-ME在维管束鞘细胞表达。筛选水稻细胞特异性表达的启动子和关键顺式元件至关重要^[43-44]。例如，玉米PPDK只在叶肉细胞中表达，而利用玉米自身启动子驱动PPDK在水稻中过量表达，在水稻叶肉和维管束鞘细胞中均检测到玉米PPDK的表达^[43]。

最后是多基因协同表达。如上所述，引入完整的C₄途径需要至少表达5个功能基因和一些转运蛋白。传统的单基因转化和杂交技术显然很难满足这个要求，一是获得多基因纯合表达株系将耗费很长的时间，二是不同来源基因协同表达的问题。近年来，多基因组装技术和合成生物学的发展为解决此类问题提供了路径^{[40, 47-48]}。

2.2.2   水稻中创制C₄花环结构

创制C₄水稻另一方面的尝试是在水稻中创建花环结构。然而，花环结构形成的分子遗传基础仍知之甚少，鲜见鉴定控制C₄叶片解剖结构的基因^{[44, 49]}。当前的研究进展主要体现在改变水稻叶片维管束鞘形态和叶脉密度。

水稻有维管束鞘细胞，但其体积小、叶绿体含量很少。在水稻中表达玉米转录因子GOLDEN2或GOLDEN2-LIKE基因，可诱导水稻维管鞘细胞中的叶绿体和线粒体发育、叶肉细胞与维管束鞘细胞的胞间连丝增加，这些特征体现了原初花环结构(Proto-Kranz anatomy)的特征^[50-52]。

为改变水稻叶片结构，有研究将来自玉米的60个发育调节因子在水稻中分别单独表达，但没有1个基因在水稻中诱导形成类似C₄的叶脉形态^[53]。最近一项研究表明，在水稻中过量表达NB-LRR(Nucleotide-binding and leucine-rich repeat)基因可减少叶脉间叶肉细胞数量、增加叶脉密度^[54]，这为通过基因工程创造C₄水稻提供了线索。

3.   重构光呼吸代谢途径，降低光呼吸碳损耗

除了利用C₄植物的CCM来改善作物光合效率，近年来，科学家通过重构光呼吸代谢途径，将其在线粒体中的CO₂部分分流至叶绿体中释放，构建以光呼吸为引擎的CCM，已取得较好的进展。

3.1   光呼吸重构的可行性和必要性

Rubisco催化加氧反应生成2−磷酸乙醇酸(2-Phosphoglycolic acid, 2-PG)。2-PG是有毒代谢产物，其微量积累强烈抑制卡尔文循环中的磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomerase,TPI)和景天庚酮糖−1,7−二磷酸酶(Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,SBPase)等酶的活性，从而抑制核酮糖−1,5−二磷酸(RuBP)的再生与淀粉合成^[55-56]。植物进化出的光呼吸代谢途径可使2分子2-PG再生为1分子3−磷酸甘油酸(3-Phosphoglyceric acid, 3-PGA)，后者进入卡尔文循环。光呼吸代谢可解毒2-PG，同时实现75%有机碳的回收，这被认为是光呼吸最重要的生物学功能^[57]。然而，光呼吸是一个消耗物质和能量的代谢过程。C₃植物中光呼吸是仅次于光合作用的第二大代谢流，正常生长条件下可损耗光合固定碳的25%~30％，在高温、高光或干旱等逆境条件下可高达50%^[58-60]。

鉴于光呼吸的高耗能特性，重构光呼吸代谢途径被认为是提高植物光合效率的一个关键突破口，但也存在不少争议与质疑，主要体现在2个方面：光呼吸是经过漫长进化(约25亿年)保留下来的一个具有普遍性的代谢途径，那么其改造优化的难度可能很大，因此可行性存疑；当前大气中CO₂体积分数在不断上升，过去的100年间上升了0.01%，已抑制了25%左右的光呼吸^[61]，如果未来大气中CO₂体积分数持续上升，改造优化光呼吸就不具有现实的必要性。

针对可行性质疑，可以依据光呼吸进化历程加以解答。光呼吸是因为大气中O₂体积分数上升而进化出现的，是以适应环境生存为主要目标的一个拯救性代谢途径。从理论逻辑出发，光呼吸途径对植物光合作用而言未必是最优的方案。因此，通过现代技术手段改造优化光呼吸代谢提高植物光合效率具有可行性，至少在正常生长环境下的有效性是可期的。对于现实性质疑，科学家通过大量的模型模拟分析认为，即使在未来气候变化趋势下大气中CO₂体积分数达到预测的最高水平，降低植物光呼吸仍可有望使光合效率提高12%~55%^[59]。其主要原因是CO₂体积分数升高也会导致环境温度升高，高温一方面降低Rubisco对CO₂的亲和力，另一方面也降低CO₂在细胞介质中的溶解度，这2个方面的因素对光呼吸的促进作用可基本抵消环境CO₂体积分数升高对光呼吸的抑制效果^[59]。

3.2   光呼吸重构的路径

重构光呼吸代谢的设计目标有2个：一是截流天然光呼吸代谢，降低线粒体中甘氨酸脱羧反应导致的CO₂与NH₃的释放，从而降低光呼吸碳与能量损耗；二是将光呼吸中的CO₂分流一部分至叶绿体中释放，以此构建一个以光呼吸为引擎的光合CO₂浓缩机制，从而抑制光呼吸和提高光合效率。目前，已报道能显著提高植物光合效率、生物量与产量的光呼吸支路一共有4条(图2)。

图  2  以提高光合效率为目标的光呼吸支路改造策略^{[7, 13, 62-68]}

红色字体表示在叶绿体中过表达的酶；Ac-CoA：乙酰辅酶A；CmMS：南瓜苹果酸合酶；CrGLDH：单亚基莱茵衣藻乙醇酸脱氢酶；EcGDH (DEF)：多亚基大肠埃希菌乙醇酸脱氢酶；EcTSR：羟基丙二酸半醛还原酶； ME：内源苹果酸酶；OsGOX3：双功能乙醇酸氧化酶；OsOxOx：草酸氧化酶；PDH：内源丙酮酸脱氢酶；PLGG1：叶绿体乙醇酸/甘油酸转运体

Figure  2.  Strategies of manipulating photorespiration pathways aiming at improving photosynthetic rate

Overexpressed enzymes in choroplast are shown in red; Ac-CoA: Acetyl-CoA; CmMS: Cucurbita moschata malate synthase; CrGLDH: Chlamydomonas reinhardtii single-protein glycolate dehydrogenase; EcGDH(DEF): Multi-subunit glycolate dehydrogenase; EcTSR: Tartronate-semialdehyde reductase; ME: Endogenous malate enzyme; OsGOX3: Bifunctional glycolate oxidase; OsOxOx: Oxalate oxidase; PDH: Endogenous pyruvate dehydrogenase; PLGG1: Plastidicglycolate/glycerate translocator 1

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最早的一条支路是将大肠埃希菌中催化甘油酸途径的乙醇酸脱氢酶(Glycolate dehydrogenase, EcGDH)、乙醛酸聚醛酶(Glyoxylate carboligase, EcGCL)和羟基丙二酸半醛还原酶(Tartronate-semialdehyde reductase, EcTSR)的基因导入拟南芥并使其定位于叶绿体中(简称GGT支路)^[62]。在这3个酶的作用下，叶绿体中直接架通了从乙醇酸到甘油酸的反应转化桥梁，形成了一条光呼吸代谢捷径(图2)。结果显示，转基因拟南芥净光合速率与生物量均显著提高、光呼吸降低，但上述表型性状仅出现在短日照和低光照条件下^[62]。随后这一支路的有效性在亚麻荠Camelina sativa、马铃薯Solanum tuberosum L.、烟草Nicotiana tabacum、水稻Oryza sativa L.等不同植物中得到了进一步的证实^[63-67]。

第2条支路将拟南芥乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase, AtGOX)、南瓜苹果酸合酶(Malate synthase, CmMS)和大肠埃希菌过氧化氢酶(Catalase, EcCAT)导入拟南芥并定位于叶绿体中(简称GMC支路)^[68]，整个途径是由导入的3个酶与植物内源的酶共同作用完成，将光呼吸乙醇酸先后转化为乙醛酸和苹果酸，苹果酸在内源酶的作用下最终完全氧化为CO₂(图2)。结果显示，转基因植株的净光合速率和生物量均显著提高，但上述表型性状同样只出现在短日照和低光照条件下，在高光条件下植株出现黄化表型^[68]。

第3条支路类同于GMC支路，区别在于莱茵衣藻乙醇酸脱氢酶(CrGLDH)替代了GMC支路中的AtGOX和EcCAT，同时采用RNA干扰技术下调叶绿体内膜上乙醇酸转运蛋白PLGG1的表达，以减少乙醇酸运出叶绿体，从而增强GMC支路的分流量(简称GMC+Ri支路)。结果显示，转基因烟草在大田种植条件下生物量可增加40%^[66]；同时，高温条件下转基因株系表现出更强的热稳定性，光合性能和田间生物量显著高于对照材料^[69]。

第4条支路是将水稻自身的乙醇酸氧化酶(OsGLO3)、草酸氧化酶(Oxalate oxidase, OsOXO3)和过氧化氢酶(OsCATC)导入水稻并定位至叶绿体中(简称GOC支路)^[65]。GOC支路使乙醇酸直接在叶绿体内被催化为草酸并最终完全分解为CO₂，从而形成CCM。结果显示，GOC水稻光合效率、生物量和籽粒产量均有显著提高。同时，GOC水稻叶片与籽粒中的氮含量也显著升高，这意味着分流光呼吸代谢可能减少了氮损耗，从而提高了植物的氮素利用效率^[65]。

计量分析4条支路中的碳与能量，GGT支路具有明显优势，甚至可能优于天然光呼吸途径，因为其不但可回收75%的碳重新进入光合碳循环，还伴随有还原力的产生；而其他3条支路都是将乙醇酸完全氧化为CO₂，按照代谢模型的分析，GMC与GOC支路均不应具有高光效方面的优势^[70]。但也有科学家认为，只要光呼吸CO₂分流在叶绿体内释放，势必会提高植物的光合效率^[71]。尽管光呼吸支路改造取得了一些实质性的进展，但光呼吸重构提升光合效率的机理及最优化方案还有待进一步的研究。

4.   展望

越来越多的研究开始关注植物光合碳同化的改善，以期提高C₃作物的产量。除了文中所综述的改造Rubisco、创制C₄光合机制和重构光呼吸代谢等，近些年来，改进光合碳同化在其他方面也有大量的研究，包括优化表达光合作用关键酶、导入蓝细菌和绿藻CCM、创建C₂光合作用、创建单细胞C₄光合作用机制等^{[39-40, 72]}。

目前，对光合碳同化的改造途径大都涉及多个基因的操作。植物代谢网络是一个复杂的系统，多个基因的导入可能造成难以预测的影响。比如，重构光呼吸支路提高了植物的光合效率和生物量，然而光呼吸代谢的复杂性，尤其是在目前对光呼吸代谢的调控机制知之甚少的情况下，这些增产效应是否与光呼吸的截留直接相关还缺乏相关证据^{[40, 62]}。因此，进一步解析基因功能和代谢网络、多种策略组合将会是未来改进的关键所在。另一方面，在植物中过量表达卡尔文循环(比如SBPase)和光呼吸循环(比如GDC-H、GDC-L)中的单个关键酶，也会增强植物光合速率、生物量和作物产量^[73-76]。最近报道在水稻中过量表达转录因子OsDREB1C，可协同调节光合作用和氮素利用的多个基因，水稻产量增幅达40%以上^[77]。因此，进一步挖掘光合碳同化的限速因子和调控基因，或许是近期更加值得关注的方向。