Eukaryotic expression and bioactivity verification of porcine prolactin
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摘要:目的
催乳素(Prolactin，PRL)具有广泛的生理调节作用，但其多效性机制仍不清楚。为了更好地研究猪PRL的多效性，本研究制备猪源PRL真核重组蛋白并验证其生物活性。
方法利用分子克隆技术将猪PRL基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro中，经慢病毒包装获得携带猪PRL基因的PRL−慢病毒；用浓缩的PRL−慢病毒感染CHO-K1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得能够分泌PRL重组蛋白的阳性细胞系CHO-K1-PRL；利用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化并进行LC-MS/MS质谱鉴定，利用HC11细胞体外培养体系验证PRL重组蛋白的生物活性。
结果成功构建了携带猪PRL基因的pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro慢病毒表达载体；包装及浓缩后的PRL−慢病毒滴度为9.9×108 TU/mL，其感染的CHO-K1细胞经嘌呤霉素筛选后得到阳性细胞系CHO-K1-PRL；从CHO-K1-PRL细胞培养液中成功纯化出重组蛋白，质量浓度为50 μg/mL，LC-MS/MS质谱分析的覆盖率达94%，鉴定为猪PRL重组蛋白；重组PRL具有促进HC11细胞增殖及酪蛋白表达的生物活性。
结论构建的细胞系CHO-K1-PRL可稳定表达具有生物活性的猪重组PRL，为猪PRL功能的研究和生产应用奠定了基础。
Abstract:ObjectiveProlactin (PRL) has a wide range of physiological regulatory effects, but its pleiotropic mechanism is still unclear. In order to investigate the pleiotropy of porcine PRL, we obtain porcine PRL eukaryotic recombinant protein and verify its biological activity.
MethodThe porcine PRL gene was cloned into the lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro by molecular cloning technology, and the PRL-lentivirus carrying porcine PRL gene was obtained by lentivirus packaging. CHO-K1 cells were infected by the concentrated PRL-lentivirus solution, and the positive cell line named CHO-K1-PRL, which could secrete recombinant PRL protein, was obtained after purinomycin screening. The recombinant protein was purified by nickel column affinity chromatography, and identified by LC-MS/MS mass spectrometry. The biological activity of recombinant PRL was verified by adding recombinant PRL into HC11 cell culture system in vitro.
ResultThe recombinant expression vector pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro carrying porcine PRL gene was successfully constructed. The titer of PRL-lentivirus after concentrating was 9.9×108 TU/mL, and the positive cell line CHO-K1-PRL was obtained after puromycin screening. The recombinant protein with the mass concentration of 50 μg/mL was successfully purified from the supernatant of CHO-K1-PRL cells. The recombinant porcine PRL protein was identified as porcine PRL by LC-MS/MS mass spectrometry, and the coverage rate of recombinant PRL was 94%. The recombinant PRL had the biological activity of promoting the proliferation and casein expression of HC11 cells.
ConclusionThe cell line CHO-K1-PRL constructed in this study can stably express porcine recombinant PRL with biological activity, which lays a foundation for the functional research, production and application of porcine PRL.
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Keywords:
- Porcine /
- Prolactin /
- CHO-K1 cell /
- Eukaryotic expression /
- Lentiviral vector /
- Recombinant protein
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生物炭是生物质在有限供氧的密闭环境中经高温热裂解产生的一类富含碳素(碳质量分数≥60%)的性质稳定、难溶以及具有一定程度高度芳香化的固体物质，主要成分是烷基和芳香结构碳。在土壤中加入生物炭，能够均衡土壤有机碳库[1]、提升肥料养分在作物中的利用率[2]以及提高作物产量[3]等。土壤微生物是土壤生态环境的重要组成部分，土壤微生物群落对土壤环境条件的变化十分敏感[4]，同时，土壤微生物也是土壤养分转化和有机质分解的关键因子，常被用于评价土壤质量的生物学特性[5]。已有研究表明，生物炭可提供大量碳源以利于微生物活动并成为微生物栖息地，为微生物提供了丰富的食物来源，促进微生物繁殖，进而活化土壤肥力[6-7]。还有研究表明，生物炭能够影响微生物多样性及群落结构、改变土壤微生物利用碳源种类，张秀等[8]研究表明，施用生物炭能提高土壤中微生物群落碳源代谢活性及功能多样性。前人研究结果表明，生物炭可影响土壤细菌群落，但不同水稻品种施用生物炭对其土壤细菌群落组成及结构的影响差异性不甚明了。本研究选取广东省江门县台山镇潮土型双季稻田土壤，种植6个品种的常规优质稻水稻，在收割前进行土壤微生物取样，通过Ion S5TMXL高通量测序技术，对16S rRNA基因V3-V4进行测序和分析，比较研究不同水稻品种施用生物炭对其土壤细菌群落组成及结构的影响差异性，以期为生物炭改善不同品种稻田土壤细菌群落环境提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验点与试验材料
试验在广东省江门市台山市下川岛试验田进行，下川岛地处北回归线南侧，N21°39′10.49″，E112°36′46.75″，属亚热带海洋性季风气候，年平均气温23℃，年均降雨量2279.5 mm，年均日照1672.5 h，气候温和，四季如春。潮土种植6种水稻品种，分别为黄华占(Hua)、五常香稻(Wu)、象牙香占(Ya)、湘晚籼17(X)、农香32(N)、玉针香(Yu)，供试生物炭是稻壳生物炭。
1.2 试验设计
试验采用裂区设计。试验以生物炭处理为主区，以水稻品种为副区。其中，主区面积120 m2，副区面积20 m2，重复3次。潮土中生物炭施用量设3个处理，分别为0（对照）、3.5和 7.0 t/hm2，依次记作CK、Tr1和Tr2。在田间水稻移栽前，一次性通过人工翻耕将不同处理的生物炭施入土壤。施入前，各小区田埂均采用耐用的黑色塑料薄膜进行覆盖包裹，以防止不同处理之间发生窜肥窜水的情况，对试验地水稻按照当地常规管理制度进行日常管理。
1.3 样品采集及分析方法
收割前利用取土钻采集水稻土壤0~15 cm土层土壤样品，五点土样法取样后迅速混匀，装在聚乙烯自封袋中，放入冰盒带回实验室，委托诺禾致源生物科技有限公司进行土壤DNA的提取、文库构建以及高通量测序。
1.4 基因组DNA的提取和PCR扩增及高通量测序
对样本的基因组DNA进行提取，检测DNA的纯度和浓度，使用无菌水稀释样本DNA至1 ng·μL−1。以稀释后的基因组DNA为模板，选择16S rRNA基因V3-V4区引物鉴定细菌多样性。PCR产物进行电泳，检测纯化PCR产物，剪切回收目标条带。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库的构建，经Qubit定量和文库检测合格后，使用Ion S5TMXL进行上机测序。
1.5 数据分析
根据Ion S5TMXL下机数据，先对Reads进行剪切、拆分，与注释数据库进行比较，去除其中的嵌合体序列得到最终的有效数据。全部Clean reads默认以97%的一致性聚类成为OTUs，选取出现频数最高的OTUs作为代表序列，与SILVA132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析,序列进行均一化处理。使用Qiime软件(V1.9.1)计算Chao1、Shannon、Simpson和ACE指数，使用R软件(V2.15.3)绘制稀释曲线并进行Alpha多样性指数组间差异分析、Beta多样性指数组间差异分析，绘制NMDS图。数据采用SPSS(21.0)软件进行分析。
2. 结果与分析
2.1 测序序列的质量控制
通过对42个土壤样品细菌V3-V4区高通量测序，根据优化标准对所测序列去杂后，结果显示共获得3336672条Clean reads，平均读长大于414 bp，相似度为0.97的条件下，对土壤中细菌的覆盖率为97.9%~98.5%，由图1可知，所有样本OTU数量稀释曲线都急剧上升后趋向平坦，表示各样本高通量测序数据量渐近合理，能够较准确地反映土壤微生物的丰富度和多样性。
2.2 土壤细菌群落多样性和丰富度分析
选用Shannon指数、Simpson指数比较菌群中优势种种类的丰富程度，反映细菌群落多样性，选用Chao1指数和ACE指数反映细菌群落的数量丰富度。由表1可知，Shannon指数的范围是6.708~9.706，Simpson指数的范围是0.919~0.995，Chao1指数的范围是3024.949~4746.209，ACE指数的范围是3169.582~4339.961。Tr1、Tr2处理均显著提高了品种Yu的细菌群落多样性(P<0.05)，但Tr1、Tr2之间差异不显著。Tr2处理显著提高水稻品种Yu的细菌群落丰富度(P<0.05)。Tr1处理显著提高了水稻品种Hua的细菌群落丰富度(P<0.05)。水稻品种Yu在CK处理时细菌群落多样性显著低于其他品种(P<0.05)，但Tr2处理时水稻品种Yu的细菌群落丰富度显著高于品种Hua、Wu和N(P<0.05)。
表 1 基于OTU的土壤细菌群落多样性指数1)Table 1. Diversity index of soil bacterial community based on OTU品种
Variety处理
Treatment香农指数
Shannon index辛普森指数
Simpson indexChao1指数
Chao1 indexACE指数
ACE index黄华占
Huanghuazhan(Hua)CK 8.966±0.05abA 0.989±0.006aA 3480.75±517.08bA 3 563.55±537.94bA Tr1 9.706±0.45aA 0.995±0.002aA 4179.17±316.40aA 4 339.96±213.84aA Tr2 8.091±1.24bA 0.969±0.022aA 3490.21±836.31bB 3 586.29±830.62bA 农香32
Nongxiang32(N)CK 8.921±0.30aA 0.979±0.004aA 3866.23±347.77aA 3 951.35±380.68aA Tr1 9.348±0.04aA 0.984±0.006aA 4044.71±157.98aA 4128.83±192.08aA Tr2 8.671±0.19aA 0.984±0.006aA 3468.91±569.14aB 3538.57±588.43aA 五常香稻
Wuchangxiangdao(Wu)CK 8.683±0.14aA 0.979±0.005aA 3816.22±187.40aA 3946.03±228.30aA Tr1 9.253±0.66aA 0.987±0.007aA 4191.22±353.26aA 4300.22±318.69aA Tr2 8.521±0.70aA 0.986±0.005aA 3235.06±789.02aB 3334.52±839.40aA 湘晚籼17
Xiangwanxian 17(X)CK 8.424±1.89aA 0.976±0.026aA 3518.03±797.80aA 3655.60±744.40aA Tr1 9.023±0.35aA 0.979±0.005aA 4045.54±289.53aA 4121.37±284.28aA Tr2 8.931±0.64aA 0.983±0.004aA 3832.92±747.80aAB 3947.94±753.74aA 象牙香占
Xiangyaxiangzhan(Ya)CK 8.651±1.24aA 0.975±0.021aA 3561.74±695.16aA 3598.91±691.79aA Tr1 8.988±0.09aA 0.972±0.004aA 4074.37±52.38aA 4234.22±5.95aA Tr2 8.956±0.54aA 0.987±0.005aA 3696.07±627.56aAB 3787.12±622.64aA 玉针香
Yuzhenxiang(Yu)CK 6.708±1.00bB 0.919±0.047bB 3024.95±367.96bA 3169.58±292.43bA Tr1 8.682±0.14aA 0.980±0.001aA 3637.90±127.86abA 3735.90±125.70abA Tr2 8.738±0.73aA 0.984±0.005aA 4746.21±1530.11aA 4073.96±257.00aA 1) 表中数据为平均值±标准差，n=3；同列数据后的不同小写字母表示同一水稻品种在不同生物炭施加量处理下差异显著；同列数据后的不同大写字母表示同一生物炭施加量处理下不同水稻品种间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)
1) Data are means±standard deviations, n=3; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences of the same variety among different biochar treatments, different capital letters in the same column indicate significant differences among different rice varieties under the same biochar treatment(P<0.05, Duncan’s test)2.3 土壤细菌群落组成分析
本研究采用97%相似水平为标准界定OTU，对OTU代表序列进行聚类和物种注释，共检测出细菌73门、92纲、174目、298科、682属和456种，细菌群落具有较高的多样性。由图2门水平的细菌相对丰度柱状图可知，在门水平上占优势水平的为变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、硝化螺旋菌门Nitrospirae、蓝藻细菌门Cyanobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、泉古菌门Crenarchaeota、放线菌门Actinobacteria和广古菌门Euryarchaeota。细菌群落第1优势类群为变形菌门，其相对丰度为30.0%~61.1%，主要包括3个亚类：γ–变形菌(Gamma-proteobacteria)、δ–变形菌(Delta-proteobacteria)和α–变形菌(Alpha-proteobacteria)，其所占的比例范围分别为9.1%~52.5%、5.7%~17.9%和2.9%~8.6%，其中，以γ–变形菌和δ–变形菌为优势菌纲。细菌群落第2大优势类群为厚壁菌门，其相对丰度为13.4%~30.6%；且绝大部分为芽孢杆菌纲Bacilli。细菌群落第3大优势类群为拟杆菌门，其相对丰度为3.3%~11.1%，其主要有拟杆菌纲Bacteroidia和懒杆菌纲Ignavibacteria。
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图 2 生物炭不同施加量处理在门水平上对土壤细菌相对丰度的影响Figure 2. Effects of different biochar application amounts on the relative abundance of soil bacteria at phylum level细菌群落组成中优势菌门类型在生物炭不同施加量处理后无较大区别，但生物炭不同施加量处理间的细菌相对丰度有所区别。各水稻品种Tr2处理相较Tr1处理均使变形菌门的相对丰度上升，其中以品种Hua变化最为明显，品种Hua的变形菌门相对丰度Tr2处理为53.5%，显著高于CK处理(相对丰度为31.2%，P<0.05)。Tr1处理降低了品种X、N、Yu的相对丰度，其中品种Yu的变形菌门相对丰度Tr1处理(30.0%)显著低于CK处理(61.1%，P<0.05)。品种Yu的拟杆菌门相对丰度随着生物炭的施加而逐渐上升，Tr2处理的相对丰度(11.4%)较CK(3.3%)明显上升(P<0.05)。品种Hua的酸杆菌门相对丰度Tr2处理(4.5%)较CK(8.0%)明显下降(P<0.05)。广古菌门的相对丰度则随着生物炭的施加，Tr1处理较CK明显上升，Tr2处理较CK明显下降(P<0.05)。厚壁菌门、硝化螺旋菌门在部分品种中同样存在相似趋势，但未表现出显著性差异。水稻土壤在CK处理的各菌门相对丰度存在品种间的显著性差异，其中，品种Yu的变形菌门相对丰度在CK处理时显著高于除品种X外的其他品种(P<0.05)，以γ−变形菌相对丰度52.5%相较其他品种存在极显著差异(P<0.01)；品种Hua的硝化螺旋菌门相对丰度在CK处理时显著高于除品种Ya外的其他品种(P<0.05)，品种Ya的硝化螺旋菌门相对丰度在CK处理时也显著高于品种Yu(P<0.05)。不同生物炭施加量对不同菌种门的相对丰度影响不尽一致；不同品种的水稻对土壤细菌群落相对丰度存在影响。
相对丰度较高的前20属细菌中，根据各细菌类群的平均相对丰度排名，将未能在97%相似度上分类的归类为Unidentified。由图3可见，马赛菌属Massilia相对丰度为1.2%~41.4%、芽孢杆菌属Bacillus相对丰度为9.4%~24.1%，均为优势菌属，除此之外，其他各细菌类群的平均相对丰度均小于2.0%，主要有不动杆菌属Acinetobacter、寡养单胞菌属Stenotrophomonas、未鉴定的蓝细菌(Unidentified Cyanobacteria)、未鉴定的梭状芽孢杆菌(UnidentifiedClostridiales)、膨胀芽胞杆菌属Tumebacillus等。食酸菌属Acidovorax、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、土地杆菌属Pedobacter等菌属的相对丰度均在Tr2处理时较CK组显著上升(P<0.05)，相对丰度较小或极小的菌属易在生物炭处理后出现显著性差异。马赛菌属在水稻品种Yu的CK处理相对丰度为41.4%，极显著高于其他水稻品种(P<0.01)；不动杆菌属在水稻品种Hua的Tr2处理相对丰度为14.1%，显著高于其他水稻品种及处理(P<0.05)。可见，生物炭处理引起了对应土壤细菌群落结构组成在属水平上的变化，相对丰度较低或极低的土壤细菌类群更敏感，更容易受到生物炭的影响。
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图 3 生物炭不同施加量处理在属水平上对土壤细菌相对丰度的影响Figure 3. Effect of different biochar application amounts on the relative abundance of soil bacteria at the genus level2.4 不同土壤细菌群落间的关系分析
如图4所示，对各土壤样本序列进行非度量多维尺度(Non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)分析，各水稻品种均显示出Tr1处理组内差异最小，CK则相对组内差异较大，Tr2处理则相对组内差异最大。尽管生物炭不同施加量处理下各样本的组内差异略大，但CK组较生物炭Tr1处理在空间位置上有明显分离，而Tr2处理的土壤样本与CK组土壤样本的空间距离较近，说明各水稻品种均表现出在Tr1处理下相较CK组土壤细菌群落组成有差别。
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图 4 土壤细菌群落结构的非度量多维尺度(NMDS)分析Figure 4. Non-metric multi-dimensional scaling (NMDS) analysis of soil bacterial community structure对门水平上的物种相对丰度进行聚类分析，聚类结果(图5)显示，各处理在门水平上的细菌主要分为3个分支，主要以Tr1分类聚类在一起，CK与Tr2处理聚类在一起，说明施用生物炭Tr2处理与CK组的菌群丰度相似性较Tr1处理更高，Tr1处理对土壤细菌群落的分布存在影响。
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图 5 门水平上的土壤细菌相对丰度聚类分析Figure 5. Cluster analysis of relative abundance of soil bacteria at phylum level3. 讨论与结论
3.1 生物炭对土壤细菌群落多样性及丰富度的影响
研究表明，土壤微生物与其所处的环境密切相关，改变环境因素会引起微生物群落结构及其组成的变化[9]；土壤细菌多样性指数大，说明供微生物生长的营养物质较丰富[10]。本研究表明，Tr1、Tr2处理均显著提高了水稻品种Yu的土壤细菌群落多样性，同时Tr2处理还显著提高了水稻品种Yu的细菌群落丰富度；生物炭Tr1处理显著提高了水稻品种Hua的细菌群落丰富度；相较于CK处理，生物炭Tr1处理对土壤群落结构也存在影响，这与Muhammad等[11]、Doan等[12]研究生物炭在适宜施加范围内能够改善微生物丰富度、群落多样性[9,13]及群落结构的结果一致。生物炭施加的促进作用主要在于生物炭为细菌生长补充了丰富的碳源，土壤中溶解性有机碳是土壤微生物群落的能量和微生物细胞组成成分的主要来源以及土壤微生物新陈代谢的主要产物，适量的外部碳源能激发细菌的生长繁育[14]。生物炭Tr1处理较CK组显著提高了水稻品种Hua的土壤细菌群落丰富度，但Tr2处理较CK无显著性差异，这一结果与Dempster等[15]、常栋等[16]研究结果相似，可能是因为微生物对有机质正当分解的碳氮质量比为25∶1，所以当生物炭施加后，需要消耗土壤中有效态氮素，但因土壤中的有效态氮素含量有限，因此当生物炭施加过量时，土壤中碳氮比增大，反而导致微生物的分解作用变慢，抑制了土壤细菌群落多样性以及物种丰富度[17]。
3.2 生物炭对土壤细菌群落组成的影响
本研究中发现，不同生物炭处理并没有改变主要优势菌群门的种类，但优势类群的相对丰度存在显著差异，各处理均以变形菌门为最优势菌门，其中以γ−、δ−、α−变形菌纲为优势亚群，具有丰富的代谢多样性，Lesaulnier等[18]的研究还发现土壤中变形菌门大多为革兰阴性菌，其中许多细菌负责固氮，可增加土壤中的氮素营养，参与N、P、C等元素循环[19-20]，促进植物的生长[21-22]，这与周佳等[23]、毛立晖[24]研究得到的稻田土壤细菌优势菌群相似。本研究结果发现，生物炭在Tr2处理的土壤中变形菌门相对丰度明显上升，其中以水稻品种Hua的变化最为显著，表明生物炭的施加促进了土壤细菌群落的固氮功能。拟杆菌门具有降解糖类及一种分布广泛的难降解的有毒有机物多环芳烃的能力[25]，试验结果表明，水稻品种Yu的拟杆菌门相对丰度随着生物炭的添加而上升，表示提升了糖类降解的能力。生物炭施加使得变形菌门及拟杆菌门相对丰度的变化结果与冯慧琳等[26]、朱孟涛等[27]在生物炭施加对土壤细菌群落的影响研究中所得结果一致。在属分类水平，隶属于变形菌门的马赛菌属以及隶属于厚壁菌门的芽孢杆菌属是优势属，优势属的相对丰度无显著性差异；但生物炭Tr2处理显著提升了食酸菌属、鞘氨醇单胞菌属、土地杆菌属等菌属的相对丰度，这些菌主要隶属于变形菌门或拟杆菌门，因此生物炭施加能够促进固氮的功能，而引发变化的主要原因可能在于生物炭的结构特性是多孔并且具有巨大比表面积，炭表面的功能基团具有专性吸附作用，能够在土壤中有效吸附包括溶解性有机碳在内的易矿化有机碳和NH4+[11]，所以当生物炭被施入稻田后，稻田土壤理化性质及养分含量发生了改变，土壤中相对丰度较低的细菌菌属比优势菌属对土壤环境因子的微小变化更敏感，因此也更容易发生改变[28]。虽然马赛菌属、芽孢杆菌属等细菌的相对丰度在生物炭施加处理后也出现了波动，但因其相对丰度较高，微小的外在环境变化并未改变其在群落结构组成中的优势地位。
3.3 结论
生物炭Tr1、Tr2处理显著提高了水稻品种Yu的土壤细菌群落多样性，Tr2处理显著提高了水稻品种Yu的细菌群落丰富度，生物炭Tr1处理显著提高了水稻品种Hua的细菌群落丰富度。细菌群落组成中占优势的菌门类型在生物炭不同施加量处理间无较大区别，但处理间细菌相对丰度上有所区别，某些水稻品种的生物炭Tr1或Tr2处理主要提高了变形菌门、拟杆菌门以及广古菌门的相对丰度，这些细菌在提高土壤养分方面具有一定作用。生物炭处理引起了对应土壤细菌群落结构组成在属水平上的变化，相对丰度较低或极低的土壤细菌类群更敏感，更容易受到生物炭的影响。与CK组相比，生物炭Tr1处理对土壤细菌群落组成及分布存在影响。水稻品种Hua和Yu的土壤细菌群落受生物炭施加影响变化较大。生物炭处理的差异主要体现在土壤细菌群落相对丰度上。
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图 1 pMD18-T-PRL克隆载体的构建与PCR鉴定
A：PRL基因的PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1~4以母猪垂体组织cDNA为模板；B：pMD18-T-PRL菌液PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1~16分别以挑选的不同pMD18-T-PRL菌落的菌液为模板
Figure 1. Construction and PCR identification of pMD18-T-PRL cloning plasmid
A: PCR products of PRL gene, M is DL 2000 DNA Marker, 1−4 use sow pituitary tissue cDNA as template; B: PCR products of pMD18-T-PRL colonies, M is DL 2000 DNA Marker, 1−16 respectively use different pMD18-T-PRL colonies as template
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图 2 pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro慢病毒表达载体的构建与PCR鉴定
A：EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I序列片段PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1为EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I序列片段；B：EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I序列片段双酶切产物，M为DL 2000 DNA Marker，1为6His-PRL-6His片段；C：pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro质粒双酶切产物，M为DL 15000 DNA Marker，1为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro线性片段；D：pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro菌液PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1~12分别以挑选的不同单菌落的菌液为模板；E：重组质粒pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro的双酶切结果，M1为DL 15000 DNA Marker，M2为DL 2000 DNA Marker，1和2为重组质粒双酶切片段
Figure 2. Construction and PCR identification of pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro lentivirus expression plasmid
A: PCR product of EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I sequence fragment, M is DL 2000 DNA Marker, 1 is EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I sequence fragment; B: Double digested product of EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I sequence fragment, M is DL 2000 DNA Marker, 1 is 6His-PRL-6His sequence fragment; C: Double digested product of pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro plasmid, M is DL 15000 DNA Marker, 1 is pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro plasmid linear fragment; D: PCR products of pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro colonies, M is DL 2000 DNA Marker, 1−12 respectively use selected bacterial solutions from different single colonies as templates; E: Double digested product of recombinant vector pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro, M1 is DL 15000 DNA Marker, M2 is DL 2000 DNA Marker, 1 and 2 are double digested products of recombinant vector
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图 3 慢病毒载体转染293T细胞24 h荧光表达情况
空白：未做处理的293T细胞；空载：转染空慢病毒载体的293T细胞；PRL：转染pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro慢病毒表达载体的293T细胞
Figure 3. Fluorescent expression of 293T cells transfected with lentivirus plasmid for 24 h
Control: Untreated 293T cells; Empty vector: 293T cells transfected with empty lentiviral vector; PRL: 293T cells transfected with pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro lentiviral vector
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图 4 慢病毒浓缩液感染CHO-K1细胞72 h及药筛7 d后荧光表达情况
空白：未做处理的CHO-K1细胞；空载：感染空载体慢病毒液的CHO-K1细胞；PRL：感染PRL−慢病毒液的CHO-K1细胞；PRL(药筛后)：感染PRL−慢病毒液的CHO-K1细胞经嘌呤霉素药物筛选7 d后
Figure 4. Fluorescence expression of CHO-K1 cells infected with concentrated lentivirus solution for 72 h and seven days after drug screening
Control: Untreated CHO-K1 cells; Empty vector: CHO-K1 cells infected by the concentrated empty lentivirus solution; PRL: CHO-K1 cells infected by the concentrated PRL-lentivirus solution; PRL (after drug screening): CHO-K1 cells infected with PRL-lentivirus solution and then screened by purinomycin for seven days
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图 5 CHO-K1-PRL细胞的RT-PCR鉴定
M为DL 2000 DNA Marker； 1、3、4、6和7为749 bp 的EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I片段，2、5和8为98 bp的β-actin
Figure 5. RT-PCR identification of CHO-K1-PRL cells
M is DL 2000 DNA Marker; 1, 3, 4, 6 and 7 are the 749 bp EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I fragments; 2, 5 and 8 are the 98 bp β-actin fragments
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图 6 CHO-K1-PRL细胞中His-Tag蛋白Western blot鉴定
A：细胞裂解液：B：细胞培养液；M为Western blot marker，1为未做处理的CHO-K1细胞，2为感染空载体慢病毒液的CHO-K1细胞，3为CHO-K1-PRL；PRL-6His重组蛋白和内参α-tubulin相对分子质量分别约为25 000和55 000
Figure 6. Western blot identification of His-Tag protein in CHO-K1-PRL cells
A: Cell lysate; B: Cell culture fluid; M is Western blot marker, 1 is untreated CHO-K1 cells, 2 is CHO-K1 cells infected by the concentrated empty lentivirus solution, 3 is CHO-K1-PRL; The relative molecular weights of PRL-6His recombinant protein and α-tubulin are about 25 000 and 55 000 resprectively
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图 7 纯化猪源PRL重组蛋白的SDS-PAGE鉴定
Figure 7. SDS-PAGE identification of purified porcine PRL recombinant proteins
M: Protein marker (PM2510)
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图 8 不同质量浓度重组PRL对HC11细胞增殖及酪蛋白表达的影响
柱子上方(图A)、相同蛋白(图B)或基因(图C)柱子上方的不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05，LSD法)，不同大写字母表示组间差异极显著(P<0.01，LSD法)
Figure 8. Different mass concentrations of recombinant PRL on proliferation and casein expressions of HC11 cells
Different lowercase letters on bars (figure A), or bars of the same protein (figure B) or gene (figure C) indicate significant differences among groups (P<0.05, LSD method), different capital letters indicate highly significant differences among groups (P<0.01, LSD method)
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图 9 Western blot检测不同质量浓度重组PRL对HC11细胞中Cyclin D1、CSN2蛋白表达的影响
Figure 9. Effects of different mass concentrations of recombinant PRL on expressions of Cyclin D1 and CSN2 proteins in HC11 cells detected by western blot
表 1 qPCR引物序列
Table 1 Primer sequence for qPCR
基因
Gene正向引物序列(5′→ 3′)
Forward primer sequence反向引物序列(5′→ 3′)
Reverse primer sequence产物大小/bp
Product lengthGAPDH GAGCGAGACCCCACTAACATC GCGGAGATGATGACCCTTTT 134 PRLR GTGGAATCCTGGGTCAGATG GGGCCACTGGTTTTGTAGTC 108 CSN1S1 CCTTTCCCCTTTGGGCTTAC TGAGGTGGATGGAGAATGGA 193 CSN2 GCAATCCCGTCCCACAAAAC GGGGCATCTGTTTGTGCTTG 138 CSN3 CCTTTTTGTGCCGTGGTGAG GGCTGGAGACCTAAGCAGAA 197 Cyclin D1 TGGCTAAACAAGGACCCCC ATGTCCACATCTCGCACGTC 203 PCNA AAAGATGCCGTCGGGTGAAT TGGTTACCGCCTCCTCTTCT 179 
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[1] MARANO R J, BEN-JONATHAN N. Minireview: Extrapituitary prolactin: An update on the distribution, regulation, and functions[J]. Molecular Endocrinology, 2014, 28(5): 622-633. doi: 10.1210/me.2013-1349
[2] MACOTELA Y, TRIBEL J, CLAPP C. Time for a new perspective on prolactin in metabolism[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism, 2020, 31(4): 276-286. doi: 10.1016/j.tem.2020.01.004
[3] VILAR L, VILAR C F, LYRA R, et al. Pitfalls in the diagnostic evaluation of hyperprolactinemia[J]. Neuroendocrinology, 2019, 109(1): 7-19. doi: 10.1159/000499694
[4] MELMED S, CASANUEVA F F, HOFFMAN A R, et al. Diagnosis and treatment of hyperprolactinemia: An Endocrine Society clinical practice guideline[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2011, 96(2): 273-288.
[5] RATNER L D, GONZALEZ B, AHTIAINEN P, et al. Short-term pharmacological suppression of the hyperprolactinemia of infertile hCG-overproducing female mice persistently restores their fertility[J]. Endocrinology, 2012, 153(12): 5980-5992. doi: 10.1210/en.2012-1393
[6] 何海迎, 王泳, 段春辉, 等. 催乳素对绵羊颗粒细胞雌激素和孕酮分泌及相关基因表达的影响[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(11): 2226-2233. [7] PHILLIPPS H R, YIP S H, GRATTAN D R. Patterns of prolactin secretion[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2020, 502: 110679. doi: 10.1016/j.mce.2019.110679
[8] SAMPERI I, LITHGOW K, KARAVITAKI N. Hyperprolactinaemia[J]. Journal of Clinical Medicine, 2019, 8(12): 2203.
[9] DI FILIPPO L, DOGA M, RWSMINI E, et al. Hyperprolactinemia and bone[J]. Pituitary, 2020, 23(3): 314-321. doi: 10.1007/s11102-020-01041-3
[10] BASINI G, BAIONI L, BUSSOLATI S, et al. Prolactin is a potential physiological modulator of swine ovarian follicle function[J]. Regulatory Peptides, 2014, 189: 22-30. doi: 10.1016/j.regpep.2014.01.003
[11] TRIEBEL J, BERTSCH T, BOLLHEIMER C, et al. Principles of the prolactin/vasoinhibin axis[J]. American Journal of Physiology Regulatory Integrative & Comparative Physiology, 2015, 309(10): R1193-R1203.
[12] TRIEBEL J, ROBLES-OSORIO M L, GARCIA-FRANCO R, et al. From bench to bedside: Translating the prolactin/vasoinhibin axis[J]. Frontiers in Endocrinology, 2017, 8: 342. doi: 10.3389/fendo.2017.00342
[13] SINHA Y N. Structural variants of prolactin: Occurrence and physiological significance[J]. Endocrine Reviews, 1995, 16(3): 354-369. doi: 10.1210/edrv-16-3-354
[14] 田青, SPITZER A J, ZHAO F. PRL对HC11细胞乳蛋白及其调节因子基因表达的影响[J]. 中国乳品工业, 2020, 48(12): 20-23. doi: 10.19827/j.issn1001-2230.2020.12.004 [15] 田青, 王洪荣. 胰岛素、催乳素和氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国饲料, 2013(2): 8-12. [16] NUC P, NUC K. Recombinant protein production in Escherichia coli[J]. Postepy Biochemii, 2006, 52(4): 448-456.
[17] 邓春梅, 葛玉强, 刘丽, 等. 外源基因表达系统的研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2010, 10(19): 3744-3746. [18] KIM J Y, KIM Y G, LEE G M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: Current state and further potential[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(3): 917-930. doi: 10.1007/s00253-011-3758-5
[19] JAIN N K, BARKOWSLI-CLARK S, ALTMAN R, et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293[J]. Protein Expression & Purification, 2017, 134: 38-46.
[20] 孟凡荣, 陈琛, 万海粟, 等. 慢病毒载体及其研究进展[J]. 中国肺癌杂志, 2014, 17(12): 870-876. [21] COCKRELL A S, KAFRI T. Gene delivery by lentivirus vectors[J]. Molecular Biotechnology, 2007, 36(3): 184-204. doi: 10.1007/s12033-007-0010-8
[22] FOLLENZI A, SANTAMBROGIO L, ANNONI A. Immune responses to lentiviral vectors[J]. Current Gene Therapy, 2007, 7(5): 306-315. doi: 10.2174/156652307782151515
[23] ALARCON H, BONZON-KULICHENKO E, PEINADO R, et al. Generation of a lentiviral vector system to efficiently express bioactive recombinant human prolactin hormones[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2020, 499: 110605. doi: 10.1016/j.mce.2019.110605
[24] 宋倩倩, 王文玲, 詹瑛, 等. 真核表达MERS-CoV刺突蛋白亚单位的信号肽序列优化研究[J]. 病毒学报, 2019, 35(1): 20-26. [25] 董金蓉, 毛树宝, 谢震渊, 等. 人巨细胞病毒gB/AD1基因在CHO细胞中的表达和纯化[J]. 生命科学研究, 2015, 19(5): 402-409. [26] FARMER C. Prolactin and the swine mammary gland[J]. Domestic Animal Endocrinology, 2022, 78: 106672. doi: 10.1016/j.domaniend.2021.106672
[27] FREEMAN M E, KANYICSKA B, LERANT A, et al. Prolactin: Structure, function, and regulation of secretion[J]. Physiological Reviews, 2000, 80(4): 1523-1631. doi: 10.1152/physrev.2000.80.4.1523
[28] AKERS R M. Major advances associated with hormone and growth factor regulation of mammary growth and lactation in dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(4): 1222-1234. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(06)72191-9
[29] LEE G Y, KENNY P A, LEE E H, et al. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells[J]. Nature Methods, 2007, 4(4): 359-365. doi: 10.1038/nmeth1015
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期刊类型引用(1)
1. 巩雪燕，刘华伟，李培征，李芬，吴少英. 昆虫化学感受蛋白(CSPs)的功能研究概述. 环境昆虫学报. 2023(01): 42-51 . 
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