Eukaryotic expression and bioactivity verification of porcine prolactin
-
摘要:目的
催乳素(Prolactin，PRL)具有广泛的生理调节作用，但其多效性机制仍不清楚。为了更好地研究猪PRL的多效性，本研究制备猪源PRL真核重组蛋白并验证其生物活性。
方法利用分子克隆技术将猪PRL基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro中，经慢病毒包装获得携带猪PRL基因的PRL−慢病毒；用浓缩的PRL−慢病毒感染CHO-K1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得能够分泌PRL重组蛋白的阳性细胞系CHO-K1-PRL；利用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化并进行LC-MS/MS质谱鉴定，利用HC11细胞体外培养体系验证PRL重组蛋白的生物活性。
结果成功构建了携带猪PRL基因的pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro慢病毒表达载体；包装及浓缩后的PRL−慢病毒滴度为9.9×108 TU/mL，其感染的CHO-K1细胞经嘌呤霉素筛选后得到阳性细胞系CHO-K1-PRL；从CHO-K1-PRL细胞培养液中成功纯化出重组蛋白，质量浓度为50 μg/mL，LC-MS/MS质谱分析的覆盖率达94%，鉴定为猪PRL重组蛋白；重组PRL具有促进HC11细胞增殖及酪蛋白表达的生物活性。
结论构建的细胞系CHO-K1-PRL可稳定表达具有生物活性的猪重组PRL，为猪PRL功能的研究和生产应用奠定了基础。
Abstract:ObjectiveProlactin (PRL) has a wide range of physiological regulatory effects, but its pleiotropic mechanism is still unclear. In order to investigate the pleiotropy of porcine PRL, we obtain porcine PRL eukaryotic recombinant protein and verify its biological activity.
MethodThe porcine PRL gene was cloned into the lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro by molecular cloning technology, and the PRL-lentivirus carrying porcine PRL gene was obtained by lentivirus packaging. CHO-K1 cells were infected by the concentrated PRL-lentivirus solution, and the positive cell line named CHO-K1-PRL, which could secrete recombinant PRL protein, was obtained after purinomycin screening. The recombinant protein was purified by nickel column affinity chromatography, and identified by LC-MS/MS mass spectrometry. The biological activity of recombinant PRL was verified by adding recombinant PRL into HC11 cell culture system in vitro.
ResultThe recombinant expression vector pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro carrying porcine PRL gene was successfully constructed. The titer of PRL-lentivirus after concentrating was 9.9×108 TU/mL, and the positive cell line CHO-K1-PRL was obtained after puromycin screening. The recombinant protein with the mass concentration of 50 μg/mL was successfully purified from the supernatant of CHO-K1-PRL cells. The recombinant porcine PRL protein was identified as porcine PRL by LC-MS/MS mass spectrometry, and the coverage rate of recombinant PRL was 94%. The recombinant PRL had the biological activity of promoting the proliferation and casein expression of HC11 cells.
ConclusionThe cell line CHO-K1-PRL constructed in this study can stably express porcine recombinant PRL with biological activity, which lays a foundation for the functional research, production and application of porcine PRL.
-
Keywords:
- Porcine /
- Prolactin /
- CHO-K1 cell /
- Eukaryotic expression /
- Lentiviral vector /
- Recombinant protein
-
磷(Phosphorus，P)既是核酸、蛋白质、脂质等生物大分子的重要组成成分，同时，还参与光合作用、能量代谢、各种生化反应的调节和细胞信号传导等多种代谢过程[1]，因此，磷是植物生长不可缺少的营养元素。玉米Zea mays L.是世界上三大粮食作物之一，在我国农业生产中占据重要的地位[2]。近年来，磷素营养在玉米生长发育中的作用越来越受到重视，合理施磷不仅能够增加玉米的产量[3]，促进玉米根系生长(总根长、根体积和根表面积增加)[4]，还能够提高玉米叶绿素含量和可溶性蛋白含量[5]。
土壤是农业生产的基础，植物所需的磷素营养主要来自土壤。土壤酸碱性是土壤的基本属性之一，影响着土壤的肥力和植物的生长，我国土壤pH大多在4.5~8.5范围内[6]。在酸性和石灰性土壤中磷素都是容易缺乏的必需营养元素。酸性土壤中含有活性高的铝、铁、锰等有害元素，具有较强的固磷能力；而在石灰性土壤中磷素容易被含量丰富的钙、镁等离子固定，导致磷在土壤中的有效性大大降低。由于植物在土壤中只能吸收离子态的磷，因此，生长过程中植物经常遭受低磷胁迫的危害[7]。根系是植物吸收养分的主要器官，在缺磷条件下，植物可以通过改变根形态构型、根系生理性状以及与有益微生物共生来缓解低磷胁迫。例如，在低磷条件下，植物可以增加总根长、侧根数量、根毛长度，使根系直径变小等增加根系与土体的接触面积，从而获取更多的磷素；植物也可以通过分泌质子、磷酸酶、羧酸盐等将土壤中难溶态磷活化为有效态磷，促进根系磷吸收[8-9]。与丛枝菌根真菌共生，通过根外菌丝扩大根系磷素吸收面积，也是植物缓解低磷胁迫的重要途径[10]。与此同时，施用磷肥是缓解酸性或石灰性土壤中植物缺磷的有效方法。石灰性土壤施用磷肥能够使土壤有效磷含量显著增加[11]、提高小麦的磷含量以及产量[12]、缓解玉米的盐胁迫并提高玉米生物量以及产量[13]。在酸性土壤上，施用磷肥同样能够较好改善紫花苜蓿的生长状况[14]。玉米是磷素敏感的作物，玉米在不同类型土壤上对低磷及施磷响应的对比研究报道较少。为了探究玉米在不同类型土壤上对高、低磷的响应，本研究分别在2种不同来源的酸性土壤(NX和WY)与2种不同来源的石灰性土壤(SP和CP)上进行了不同磷处理的盆栽试验，旨在了解玉米在不同类型土壤上对低磷及施磷的响应，为不同类型土壤上制定合理的玉米施磷方案、提高玉米产量提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
供试玉米品种是‘正甜 68’。供试土壤分别来自于中国南方(NX和WY)和北方(SP和CP)，土壤pH和有效磷含量差异较大。NX：酸性土壤，采自华南农业大学宁西试验基地(23°13′N，13°81′E)，pH 4.5，有效磷0.97 mg∙kg−1；WY：采自翁源广东省生物工程研究所试验基地(24°28′N，113°94′E)，pH 4.9，有效磷0.04 mg∙kg−1；SP：采自新疆农业大学三坪教学试验基地(43°56′N，87°21′E)，pH 8.6，有效磷4.82 mg∙kg−1；CP：采自中国农业大学昌平试验基地(40°08′N，116°10′E)，pH 7.9，有效磷0.50 mg∙kg−1。土壤其他理化性状见文献[15]。
1.2 试验设计
试验采用两因素试验设计，A因素为不同类型的土壤，即酸性土壤和石灰性土壤；B因素为2种磷水平，即不施磷处理(低磷，LP)和施过磷酸钙[w (P)=50 mg∙kg−1，高磷，HP]。钾肥施用氯化钾[w (K)=70 mg∙kg−1]；氮肥施用尿素[w (N)=70 mg∙kg−1]。每个处理设4个重复。
每种土壤称取3.3 kg，在播种前与肥料混匀后倒入矩形花盆(29 cm×13 cm×11 cm)中，并浇500 mL去离子水，2 d后，每盆播种6粒玉米种子，盖土后浇200 mL去离子水，播种7 d后，间苗使每盆2棵苗。试验采用完全随机设计，种植期间进行常规管理，适时补充水分保持土壤湿润。
1.3 样品的收获与测定
在播种50 d后收获，收样时，将地上部和根部分开，地上部用信封装好后放入烘箱105 ℃杀青30 min，65 ℃烘干至恒质量进行称样。地下部根系去除松散的大块土，收集紧附在根上的根际土用于测定碱性磷酸酶活性；之后将根系浸入塑料瓶(装有100 mL 0.2 mmol/L CaCl2溶液)中轻轻摇晃，收集涮根溶液用于测定根际酸性磷酸酶活性、羧酸盐含量和pH。
1.3.1 根际酸性磷酸酶活性测定
采用对硝基苯磷酸盐反应比色法[16]。将0.5 mL土壤悬浊液加入2 mL的离心管中，加入0.4 mL 200 mmol/L醋酸钠缓冲液和0.1 mL 150 mmol/L对硝基苯磷酸二钠底物溶液。放入25~30 ℃的恒温箱内培养1 h。反应结束时用0.5 mL 0.5 mol/L NaOH溶液终止反应。同时设置空白对照：重复上述土壤悬浊液、缓冲液和底物的加入步骤，但在加入底物后立即加入NaOH溶液终止反应，然后放入恒温箱内培养1 h。培养结束后于12 000 r/min离心10 min，取上清液在405 nm的波长下比色读取吸光度。此外，为了获得土壤基础数据，将底部土层在90 ℃条件下烘干，并测定烘干土样的干质量。
1.3.2 根际碱性磷酸酶活性和pH测定
取0.5 g根际土加入2 mL的离心管中，将醋酸钠缓冲液改为200 mmol/L 碳酸氢钠缓冲液，其余步骤与“1.3.1”步骤一致。根际土壤用pH计测定pH后，再烘干并称质量，矫正水土比为2.5∶1.0的pH[17]。
1.3.3 根际羧酸盐含量的测定
将涮根溶液用0.22 µm水系滤膜过滤至进样器中，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定，测试条件为：Agilent 1200 HPLC system (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)，色谱柱(Thermo C18 5 µm Micron, Length 250 mm, I.D. 4.6 mm)，流动相0.2%(φ)偏磷酸溶液，流速1 mL/min，柱温35 ℃，DAD检测器，检测波长210 nm，进样体积20 µL。根据标准品的出峰时间，对应找出样品出峰时间，通过标准曲线计算出涮根溶液中羧酸盐的浓度，按照下式计算根际羧酸盐含量[18]：
$$ b=cV/m， $$ 式中，b为根际羧酸盐质量摩尔浓度，μmol/g；c为涮根溶液中羧酸盐的浓度，μmol/L；V为涮根溶液总体积，L；m为土壤干质量，g。
1.3.4 根系性状和菌根侵染率的测定
根系利用扫描仪扫描后使用根系分析软件WinRHIZO (Regent Instruments Inc., 加拿大)分析测定单株玉米总根长、根表面积、根体积和平均根直径等根系性状。扫描后的根系取部分样品，先用10%(w)KOH溶液进行透明处理，再使用5%(φ)醋酸墨水染液进行染色，采用网格交叉法[19]进行菌根侵染率的测定。之后，将根部样品105 ℃杀青后75 ℃烘干至恒质量。烘干的地上部和根部样品粉碎后用H2SO4−H2O2法消煮，流动分析仪(Skalar, 荷兰)测定磷质量。
1.4 数据处理
使用Excel软件(Microsoft 2019)进行数据处理，采用IBM SPSS Statistics 26统计软件进行双因素方差分析和多重比较(Duncan’s法)，使用Origin 2021b作图软件对植株功能性状进行主成分分析。
2. 结果与分析
2.1 土壤类型和磷处理对玉米植株干质量和磷质量的影响
不同的土壤类型和磷处理均显著影响植株干质量，且土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(P<0.001，表1)。图1A可以看出，SP石灰性土壤的植株干质量在低磷和高磷条件下都是最高的；在低磷条件下，SP石灰性土壤的植株干质量比NX酸性土壤的增加了9.4倍，比WY酸性土壤的增加了23.9倍；在高磷条件下，SP石灰性土壤的植株干质量比NX酸性土壤的增加了0.8倍，比WY酸性土壤的增加了0.7倍；在施磷(HP)或不施磷(LP)条件下，CP石灰性土壤的植株干质量与2种酸性土壤之间差异均不显著。在酸性和石灰性土壤中施用磷肥均能显著增加植株的干质量，与不施磷相比，酸性土壤NX和WY施磷后植株干质量分别增加了6.5和18.0倍，石灰性土壤SP和CP施磷后植株干质量分别增加了0.3和5.8倍。
表 1 土壤类型(S)和磷处理(P)对玉米植株生长以及根际指标影响的方差分析1)Table 1. Analysis of variance of effects of soil types (S) and phosphorus treatments (P) on plant growth and rhizosphere indexes in maize性状(指标) Trait (Indicator) S P S×P 植株干质量 Plant dry weight 261.50*** 632.72*** 16.00*** 植株磷质量 Plant phosphorus weight 16.79*** 632.72*** 1.36*** 总根长 Total root length 2.23ns 145.28*** 9.46*** 根表面积 Root surface area 10.94*** 73.06*** 10.21*** 根体积 Root volume 16.58*** 51.40*** 9.90*** 平均根直径 Average root diameter 64.82*** 59.14*** 16.92*** 菌根侵染率 Mycorrhizal colonization rate 8.25** 181.10*** 23.27*** 根际 pH Rhizosphere pH 1553.68*** 7.54* 5.91** 根际羧酸盐含量 Carboxylate content in rhizosphere 12.57*** 35.30*** 6.56** 根际酸性磷酸酶活性 Acid phosphatase activity in rhizosphere 12.45*** 2.93ns 3.53* 根际碱性磷酸酶活性 Alkaline phosphatase activity in rhizosphere 8.48** 1.01ns 1.25ns 1)“*”：0.01≤P<0.05；“**”：0.001≤P<0.01； “***”：P<0.001； “ns”：不显著
1) “*”: 0.01≤P<0.05; “**”: 0.001≤P<0.01; “***”: P<0.001; “ns”: No significance![]()
图 1 不同土壤类型和磷处理对玉米植株干质量和磷质量的影响LP：不施磷；HP：施磷；NX：宁西酸性土壤；WY：翁源酸性土壤；SP：三坪石灰性土壤；CP：昌平石灰性土壤；各图中柱上不同小写字母代表处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 1. Effects of different soil types and phosphorus treatments on plant dry weight and P weight in maizeLP: No P added; HP: P fertilizer added; NX: Acid soil of Ningxi; WY: Acid soil of Wengyuan; SP: Calcareous soil of Sanping; CP: Calcareous soil of Changping; In each figure, different lowercase letters on the column represent significant differences among different treatments (P< 0.05, Duncan’s method)不同的土壤类型和磷处理均显著影响植株磷质量，且土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(P<0.001，表1)。图1B可以看出，SP石灰性土壤的植株磷质量在低磷和高磷条件下都是最高的，在低磷条件下，SP石灰性土壤的植株磷质量比NX酸性土壤的增加了8.7倍，比WY酸性土壤的增加了40.2倍；CP石灰性土壤的植株磷质量与酸性土壤无显著差异；在高磷条件下，SP石灰性土壤的植株磷质量比NX酸性土壤的增加了0.8倍，比WY酸性土壤的增加了1.7倍；CP石灰性土壤的植株磷质量与NX酸性土壤无差异，但显著高于WY酸性土壤。从磷处理来看，施磷显著增加了植株磷质量，与不施磷相比，酸性土壤NX和WY施磷后植株磷质量分别增加了9.7和28.6倍，石灰性土壤SP与CP施磷后植株磷质量分别增加了0.9与7.2倍。
2.2 土壤类型和磷处理对玉米根系性状的影响
2.2.1 总根长与根表面积
不同磷处理显著影响玉米总根长，且土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(P<0.001，表1)。图2A可以看出，在低磷条件下，SP石灰性土壤的总根长比NX酸性土壤增加了0.9倍，比WY酸性土壤增加了2.0倍；CP石灰性土壤的总根长与NX无显著差异，但显著高于WY；在高磷条件下，SP土壤的总根长与NX无显著差异，但显著低于WY。施磷显著增加了玉米总根长，与不施磷相比，酸性土壤NX和WY施磷后的玉米总根长分别增加了1.6和3.8倍，石灰性土壤SP和CP施磷后的玉米总根长分别增加了0.3与1.2倍。
![]()
图 2 不同土壤类型和磷处理对玉米总根长和根表面积的影响LP：不施磷；HP：施磷；NX：宁西酸性土壤；WY：翁源酸性土壤；SP：三坪石灰性土壤；CP：昌平石灰性土壤；各图中柱上不同小写字母代表不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 2. Effects of different soil types and phosphorus treatments on total root length and root surface area in maizeLP: No P added; HP: P fertilizer added; NX: Acid soil of Ningxi; WY: Acid soil of Wengyuan; SP: Calcareous soil of Sanping; CP: Calcareous soil of Changping; In each figure, different lowercase letters on the column represent significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)不同土壤类型和磷处理均显著影响玉米根表面积，且土壤类型和磷处理的影响存在极显著的交互作用(P<0.001，表1)。图2B可以看出，在低磷条件下，SP石灰性土壤的根表面积比NX酸性土壤增加了3.1倍，比WY酸性土壤增加了4.7倍；CP石灰性土壤的根表面积与2种酸性土壤无显著差异；在高磷条件下，2种石灰性土壤的根表面积和2种酸性土壤之间均无显著差异。施磷显著增加了酸性土壤上玉米的根表面积，与不施磷相比，NX和WY施磷后根表面积分别增加了2.2和5.1倍；在石灰性土壤中，SP土壤施磷后根表面积与不施磷的差异不显著，而CP土壤施磷后根表面积比不施磷的增加了2.0倍。
2.2.2 根体积与平均根直径
不同土壤类型和磷处理显著影响玉米根体积，且土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(P<0.001，表1)。图3A可以看出，在低磷条件下，SP石灰性土壤的根体积比NX酸性土壤高6.0倍，比WY酸性土壤高7.8倍，而CP石灰性土壤的根体积与2种酸性土壤之间均无显著差异；在高磷条件下，SP土壤的根体积比NX增加了0.6倍，但与WY无显著差异；CP土壤的根体积比NX增加了0.7倍，但与WY无显著差异。在酸性土壤中，施磷显著增加了玉米的根体积，NX和WY施磷后的玉米根体积比不施磷的分别增加了3.0和6.6倍；在石灰性土壤中，SP施磷后玉米根体积与不施磷相比无明显变化，CP施磷后玉米根体积比不施磷的增加了3.1倍。
![]()
图 3 不同土壤类型和磷处理对玉米单株根体积和平均根直径的影响LP：不施磷；HP：施磷；NX：宁西酸性土壤；WY：翁源酸性土壤；SP：三坪石灰性土壤；CP：昌平石灰性土壤；各图中柱上不同小写字母代表不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 3. Effects of different soil types and phosphorus treatments on root volume and average root diameter in maizeLP: No P added; HP: P fertilizer added; NX: Acid soil of Ningxi; WY: Acid soil of Wengyuan; SP: Calcareous soil of Sanping; CP: Calcareous soil of Changping; In each figure, different lowercase letters on the column represent significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)不同的土壤类型和磷处理显著影响玉米平均根直径，且不同土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(P<0.001，表1)。图3B可以看出，低磷条件下，SP石灰性土壤的平均根直径比NX酸性土壤增加了0.7倍，比WY酸性土壤增加了0.5倍；CP石灰性土壤的玉米平均根直径比NX增加了0.1倍，与WY无显著差异。施磷显著增加了酸性土壤中玉米的平均根直径，NX与WY施磷后玉米平均根直径均比不施磷的增加了0.2倍；在石灰性土壤中，SP施磷后玉米平均根直径与不施磷的无明显变化，CP施磷后玉米平均根直径比不施磷的增加0.4倍。
2.3 土壤类型和磷处理对玉米菌根侵染率的影响
不同的土壤类型和磷处理显著影响玉米的菌根侵染率，且土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(0.001≤P<0.01或P<0.001，表1)。图4可以看出，在酸性土壤中，NX和WY不施磷处理的菌根侵染率分别比施磷的高1.4和0.9倍；在石灰性土壤中，与施磷处理相比，SP不施磷的玉米菌根侵染率无显著变化，CP不施磷的玉米菌根侵染率高1.2倍。在低磷条件下，2种石灰性土壤菌根侵染率均显著低于2种酸性土壤；在高磷条件下，SP石灰性土壤的菌根侵染率显著高于2种酸性土壤；CP石灰性土壤的菌根侵染率与NX酸性土壤无显著差异，但显著低于WY酸性土壤。
![]()
图 4 不同土壤类型和磷处理对玉米菌根侵染率的影响LP：不施磷；HP：施磷；NX：宁西酸性土壤；WY：翁源酸性土壤；SP：三坪石灰性土壤；CP：昌平石灰性土壤；柱上不同小写字母代表不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 4. Effects of different soil types and phosphorus treatments on mycorrhizal colonization rate in maizeLP: No P added; HP: P fertilizer added; NX: Acid soil of Ningxi; WY: Acid soil of Wengyuan; SP: Calcareous soil of Sanping; CP: Calcareous soil of Changping; Different lowercase letters on the column represent significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)2.4 土壤类型和磷处理对玉米根际指标的影响
2.4.1 根际pH和羧酸盐含量
不同的土壤类型和磷处理均显著影响玉米根际pH，且不同土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(P<0.001、0.01≤P<0.05或0.001≤P<0.01，表1)。图5A可以看出，石灰性土壤的玉米根际pH显著高于酸性土壤；施磷降低了CP石灰性土壤的玉米根际pH，但对其他3种土壤的玉米根际pH无显著影响。
![]()
图 5 不同土壤类型和磷处理对玉米根际pH和根际羧酸盐含量的影响LP：不施磷；HP：施磷；NX：宁西酸性土壤；WY：翁源酸性土壤；SP：三坪石灰性土壤；CP：昌平石灰性土壤；各图中柱上不同小写字母代表不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 5. Effects of different soil types and phosphorus treatments on rhizosphere pH and carboxylate content in maizeLP: No P added; HP: P fertilizer added; NX: Acid soil of Ningxi; WY: Acid soil of Wengyuan; SP: Calcareous soil of Sanping; CP: Calcareous soil of Changping; In each figure, different lowercase letters on the column represent significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)不同的土壤类型和磷处理均显著影响玉米根际羧酸盐含量，且不同土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(P<0.001或0.001≤P<0.01，表1)。图5B可以看出，在低磷条件下，NX酸性土壤的根际羧酸盐含量比SP石灰性土壤高42.8倍，但显著低于CP石灰性土壤；WY酸性土壤的根际羧酸盐含量显著高于其他土壤；在高磷条件下，不同类型土壤的根际羧酸盐含量差异不显著。除SP外，低磷提高了玉米根际羧酸盐含量；在酸性土壤中，NX不施磷的根际羧酸盐含量比施磷高3.9倍，WY不施磷的根际羧酸盐含量比施磷高5.0倍；在石灰性土壤中，SP施磷与不施磷的玉米根际羧酸盐含量差异不显著，CP不施磷的玉米根际羧酸盐含量比施磷的高4.2倍。
2.4.2 根际磷酸酶活性
不同的土壤类型显著影响玉米根际酸性磷酸酶活性，土壤类型和磷处理的影响存在显著的交互作用(0.01≤P<0.05，表1)。图6A可以看出，NX酸性土壤的玉米根际酸性磷酸酶活性最高的，在低磷条件下，NX的玉米根际酸性磷酸酶活性比SP石灰性土壤高4.3倍，比CP石灰性土壤高14.8倍；在高磷条件下，NX的玉米根际酸性磷酸酶活性比SP高1.5倍，比CP高4.4倍。施磷降低了NX的根际酸性磷酸酶活性，但对另外3种土壤无显著影响。
![]()
图 6 不同土壤类型和磷处理对玉米根际磷酸酶活性的影响LP：不施磷；HP：施磷；NX：宁西酸性土壤；WY：翁源酸性土壤；SP：三坪石灰性土壤；CP：昌平石灰性土壤；各图中柱上不同小写字母代表不同处理间差异显著(P<0.05，Duncan’s法)Figure 6. Effects of different soil types and phosphorus treatments on rhizosphere phosphatase activities in maizeLP: No P added; HP: P fertilizer added; NX: Acid soil of Ningxi; WY: Acid soil of Wengyuan; SP: Calcareous soil of Sanping; CP: Calcareous soil of Changping; In each figure, different lowercase letters on the column represent significant differences among different treatments (P<0.05, Duncan’s method)不同的土壤类型显著影响玉米根际碱性磷酸酶活性(0.001≤P<0.01，表1)。图6B可以看出，在低磷条件下，SP石灰性土壤的根际碱性磷酸酶活性与2种酸性土壤无显著差异；CP石灰性土壤的根际碱性磷酸酶活性显著低于NX酸性土壤，与WY酸性土壤无显著差异；在高磷条件下，SP石灰性土壤的根际碱性磷酸酶活性与NX酸性土壤无显著差异，但显著高于WY酸性土壤；CP石灰性土壤的根际碱性磷酸酶活性与2种酸性土壤无显著差异。在酸性土壤和石灰性土壤中，施磷对玉米的碱性磷酸酶活性均无显著影响。
2.5 基于不同土壤类型和磷处理的主成分分析
由图7可知，在低磷条件下，PC1和PC2累计贡献度达84.4%；在高磷条件下，PC1和PC2累计贡献度达71.4%。在高、低磷中，PC1非常明显地将2种酸性土壤与SP石灰性土壤区分开，而与CP石灰性土壤没有明显的区分，表明在高、低磷条件下，2种酸性土壤均与SP差异明显。在低磷条件下，根系性状与植株干质量和磷质量呈正相关关系；根际羧酸盐含量、菌根侵染率与植株干质量和磷质量呈负相关关系，表明在低磷条件下，玉米主要通过改变根系性状促进磷吸收；在高磷条件下，菌根侵染率、碱性磷酸酶活性、根际pH及平均根直径均与植株干质量和磷质量呈正相关关系，表明在高磷条件下，玉米可以通过同时调整根系(根际)性状和菌根侵染率来促进磷吸收。
3. 讨论与结论
3.1 土壤因素影响玉米生长和磷吸收
土壤pH和本底养分状况均能影响玉米的生长与施磷的效果。植物根系从土壤中获取养分促进自身的生长发育，不同的土壤性质会影响植物对养分的吸收[20]。本研究利用不同来源的2种酸性土壤和2种石灰性土壤进行玉米盆栽试验，结果表明，4种土壤对玉米生长的影响存在显著差异，尽管被测试的4种土壤在多个土壤理化性状上有差异，但主要差异是土壤pH的不同。pH会直接影响土壤中养分的溶解性和有效性，进而影响玉米生长[21]。有研究发现，酸性土壤中玉米的产量低于非酸性土壤[22]。在本研究中，2种酸性土壤的玉米植株干质量和磷质量在高、低磷条件下均与CP石灰性土壤无显著差异，但与SP石灰性土壤差异显著，这可能是由于SP土壤的本底有效磷含量较高。土壤pH和有效磷含量会直接限制植株对磷酸盐的吸收，进而影响玉米的生长[23]。与SP土壤相比，CP土壤全氮以及有效钾含量也较低，这可能也是影响玉米生长的因素。缺氮会抑制玉米光合作用和植物体内有机碳的积累，而缺钾会降低玉米的结实率，而且会影响其他营养元素的吸收和利用[24-25]。
3.2 植株根系和根际指标影响玉米对磷的活化吸收
根系性状对于提高植物的养分吸收起重要作用。较发达的根系能够更好地探索土壤空间，增加与土壤颗粒的接触面积，从而提高磷素的吸收能力[26]。低磷会刺激植株根系的生长进而增加养分吸收[27]；而施磷肥同样能够促进根系生长[28]。本研究发现，施磷显著增加了2种酸性土壤和CP石灰性土壤上玉米的总根长、根表面积、根体积和平均根直径，从而显著提高了玉米植株磷质量，表明施磷促进了根系生长，进而促进养分吸收。在不施磷条件下，SP石灰性土壤的玉米总根长、根表面积、根体积和平均根直径均显著高于其他土壤；施磷后SP土壤的总根长也显著增加。因此，在高、低磷条件下，SP土壤的玉米植株干质量和磷质量都是最高的。
菌根共生能够帮助植物获取更多的养分，尤其是磷[29]。通常低磷会增加菌根侵染率[30-32]，从而促进植物磷含量的增加。本研究中，低磷条件下，2种酸性土壤的玉米菌根侵染率均高于2种石灰性土壤，但是植株磷质量却没有显著提升，表明菌根侵染率的高低有时只是植株对低磷的响应，且受土壤本身酸碱性的影响。低磷条件下，2种酸性土壤以及CP石灰性土壤菌根侵染率显著高于施磷后；SP土壤由于本底有效磷含量较高，施磷前后菌根侵染率没有显著变化；所有土壤的植株磷质量在施磷后均显著增加，表明施用磷肥能更好地改善植株磷营养状况。
在缺磷条件下，植物会改变根际过程，提高对土壤中磷的高效利用[33]。本研究中，低磷条件下，2种酸性土壤以及CP石灰性土壤的玉米根际羧酸盐含量都显著高于施磷处理，NX酸性土壤的玉米根际酸性磷酸酶活性显著高于施磷处理，表明在低磷条件下，玉米可以通过促进根际羧酸盐分泌，增强酸性磷酸酶活性以活化土壤磷促进玉米生长。另外，主成分分析发现，在低磷条件下，总根长、根表面积、根体积、平均根直径与植株干质量和磷质量呈正相关关系，而根际羧酸盐含量、菌根侵染率与植株干质量和磷质量呈负相关关系，表明低磷条件下，玉米主要通过调整根系性状促进磷吸收。
3.3 结论
缺磷严重影响植株生长，施用磷肥可以促进不同类型土壤上玉米生长和植株的磷吸收。玉米对施磷的响应很大程度上受到土壤本底养分含量的影响，有效磷含量低的土壤对施用磷肥的响应更加明显；低磷条件下，玉米主要通过改变根系性状促进磷吸收。
-
![]()
图 1 pMD18-T-PRL克隆载体的构建与PCR鉴定
A：PRL基因的PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1~4以母猪垂体组织cDNA为模板；B：pMD18-T-PRL菌液PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1~16分别以挑选的不同pMD18-T-PRL菌落的菌液为模板
Figure 1. Construction and PCR identification of pMD18-T-PRL cloning plasmid
A: PCR products of PRL gene, M is DL 2000 DNA Marker, 1−4 use sow pituitary tissue cDNA as template; B: PCR products of pMD18-T-PRL colonies, M is DL 2000 DNA Marker, 1−16 respectively use different pMD18-T-PRL colonies as template
![]()
图 2 pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro慢病毒表达载体的构建与PCR鉴定
A：EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I序列片段PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1为EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I序列片段；B：EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I序列片段双酶切产物，M为DL 2000 DNA Marker，1为6His-PRL-6His片段；C：pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro质粒双酶切产物，M为DL 15000 DNA Marker，1为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro线性片段；D：pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro菌液PCR产物，M为DL 2000 DNA Marker，1~12分别以挑选的不同单菌落的菌液为模板；E：重组质粒pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro的双酶切结果，M1为DL 15000 DNA Marker，M2为DL 2000 DNA Marker，1和2为重组质粒双酶切片段
Figure 2. Construction and PCR identification of pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro lentivirus expression plasmid
A: PCR product of EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I sequence fragment, M is DL 2000 DNA Marker, 1 is EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I sequence fragment; B: Double digested product of EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I sequence fragment, M is DL 2000 DNA Marker, 1 is 6His-PRL-6His sequence fragment; C: Double digested product of pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro plasmid, M is DL 15000 DNA Marker, 1 is pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro plasmid linear fragment; D: PCR products of pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro colonies, M is DL 2000 DNA Marker, 1−12 respectively use selected bacterial solutions from different single colonies as templates; E: Double digested product of recombinant vector pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro, M1 is DL 15000 DNA Marker, M2 is DL 2000 DNA Marker, 1 and 2 are double digested products of recombinant vector
![]()
图 3 慢病毒载体转染293T细胞24 h荧光表达情况
空白：未做处理的293T细胞；空载：转染空慢病毒载体的293T细胞；PRL：转染pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro慢病毒表达载体的293T细胞
Figure 3. Fluorescent expression of 293T cells transfected with lentivirus plasmid for 24 h
Control: Untreated 293T cells; Empty vector: 293T cells transfected with empty lentiviral vector; PRL: 293T cells transfected with pCDH-CMV-6His-PRL-6His-EF1-GFP+Puro lentiviral vector
![]()
图 4 慢病毒浓缩液感染CHO-K1细胞72 h及药筛7 d后荧光表达情况
空白：未做处理的CHO-K1细胞；空载：感染空载体慢病毒液的CHO-K1细胞；PRL：感染PRL−慢病毒液的CHO-K1细胞；PRL(药筛后)：感染PRL−慢病毒液的CHO-K1细胞经嘌呤霉素药物筛选7 d后
Figure 4. Fluorescence expression of CHO-K1 cells infected with concentrated lentivirus solution for 72 h and seven days after drug screening
Control: Untreated CHO-K1 cells; Empty vector: CHO-K1 cells infected by the concentrated empty lentivirus solution; PRL: CHO-K1 cells infected by the concentrated PRL-lentivirus solution; PRL (after drug screening): CHO-K1 cells infected with PRL-lentivirus solution and then screened by purinomycin for seven days
![]()
图 5 CHO-K1-PRL细胞的RT-PCR鉴定
M为DL 2000 DNA Marker； 1、3、4、6和7为749 bp 的EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I片段，2、5和8为98 bp的β-actin
Figure 5. RT-PCR identification of CHO-K1-PRL cells
M is DL 2000 DNA Marker; 1, 3, 4, 6 and 7 are the 749 bp EcoR I-6His-PRL-6His-BamH I fragments; 2, 5 and 8 are the 98 bp β-actin fragments
![]()
图 6 CHO-K1-PRL细胞中His-Tag蛋白Western blot鉴定
A：细胞裂解液：B：细胞培养液；M为Western blot marker，1为未做处理的CHO-K1细胞，2为感染空载体慢病毒液的CHO-K1细胞，3为CHO-K1-PRL；PRL-6His重组蛋白和内参α-tubulin相对分子质量分别约为25 000和55 000
Figure 6. Western blot identification of His-Tag protein in CHO-K1-PRL cells
A: Cell lysate; B: Cell culture fluid; M is Western blot marker, 1 is untreated CHO-K1 cells, 2 is CHO-K1 cells infected by the concentrated empty lentivirus solution, 3 is CHO-K1-PRL; The relative molecular weights of PRL-6His recombinant protein and α-tubulin are about 25 000 and 55 000 resprectively
![]()
图 7 纯化猪源PRL重组蛋白的SDS-PAGE鉴定
Figure 7. SDS-PAGE identification of purified porcine PRL recombinant proteins
M: Protein marker (PM2510)
![]()
图 8 不同质量浓度重组PRL对HC11细胞增殖及酪蛋白表达的影响
柱子上方(图A)、相同蛋白(图B)或基因(图C)柱子上方的不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05，LSD法)，不同大写字母表示组间差异极显著(P<0.01，LSD法)
Figure 8. Different mass concentrations of recombinant PRL on proliferation and casein expressions of HC11 cells
Different lowercase letters on bars (figure A), or bars of the same protein (figure B) or gene (figure C) indicate significant differences among groups (P<0.05, LSD method), different capital letters indicate highly significant differences among groups (P<0.01, LSD method)
![]()
图 9 Western blot检测不同质量浓度重组PRL对HC11细胞中Cyclin D1、CSN2蛋白表达的影响
Figure 9. Effects of different mass concentrations of recombinant PRL on expressions of Cyclin D1 and CSN2 proteins in HC11 cells detected by western blot
表 1 qPCR引物序列
Table 1 Primer sequence for qPCR
基因
Gene正向引物序列(5′→ 3′)
Forward primer sequence反向引物序列(5′→ 3′)
Reverse primer sequence产物大小/bp
Product lengthGAPDH GAGCGAGACCCCACTAACATC GCGGAGATGATGACCCTTTT 134 PRLR GTGGAATCCTGGGTCAGATG GGGCCACTGGTTTTGTAGTC 108 CSN1S1 CCTTTCCCCTTTGGGCTTAC TGAGGTGGATGGAGAATGGA 193 CSN2 GCAATCCCGTCCCACAAAAC GGGGCATCTGTTTGTGCTTG 138 CSN3 CCTTTTTGTGCCGTGGTGAG GGCTGGAGACCTAAGCAGAA 197 Cyclin D1 TGGCTAAACAAGGACCCCC ATGTCCACATCTCGCACGTC 203 PCNA AAAGATGCCGTCGGGTGAAT TGGTTACCGCCTCCTCTTCT 179 
下载: 导出CSV
-
[1] MARANO R J, BEN-JONATHAN N. Minireview: Extrapituitary prolactin: An update on the distribution, regulation, and functions[J]. Molecular Endocrinology, 2014, 28(5): 622-633. doi: 10.1210/me.2013-1349
[2] MACOTELA Y, TRIBEL J, CLAPP C. Time for a new perspective on prolactin in metabolism[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism, 2020, 31(4): 276-286. doi: 10.1016/j.tem.2020.01.004
[3] VILAR L, VILAR C F, LYRA R, et al. Pitfalls in the diagnostic evaluation of hyperprolactinemia[J]. Neuroendocrinology, 2019, 109(1): 7-19. doi: 10.1159/000499694
[4] MELMED S, CASANUEVA F F, HOFFMAN A R, et al. Diagnosis and treatment of hyperprolactinemia: An Endocrine Society clinical practice guideline[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2011, 96(2): 273-288.
[5] RATNER L D, GONZALEZ B, AHTIAINEN P, et al. Short-term pharmacological suppression of the hyperprolactinemia of infertile hCG-overproducing female mice persistently restores their fertility[J]. Endocrinology, 2012, 153(12): 5980-5992. doi: 10.1210/en.2012-1393
[6] 何海迎, 王泳, 段春辉, 等. 催乳素对绵羊颗粒细胞雌激素和孕酮分泌及相关基因表达的影响[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(11): 2226-2233. [7] PHILLIPPS H R, YIP S H, GRATTAN D R. Patterns of prolactin secretion[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2020, 502: 110679. doi: 10.1016/j.mce.2019.110679
[8] SAMPERI I, LITHGOW K, KARAVITAKI N. Hyperprolactinaemia[J]. Journal of Clinical Medicine, 2019, 8(12): 2203.
[9] DI FILIPPO L, DOGA M, RWSMINI E, et al. Hyperprolactinemia and bone[J]. Pituitary, 2020, 23(3): 314-321. doi: 10.1007/s11102-020-01041-3
[10] BASINI G, BAIONI L, BUSSOLATI S, et al. Prolactin is a potential physiological modulator of swine ovarian follicle function[J]. Regulatory Peptides, 2014, 189: 22-30. doi: 10.1016/j.regpep.2014.01.003
[11] TRIEBEL J, BERTSCH T, BOLLHEIMER C, et al. Principles of the prolactin/vasoinhibin axis[J]. American Journal of Physiology Regulatory Integrative & Comparative Physiology, 2015, 309(10): R1193-R1203.
[12] TRIEBEL J, ROBLES-OSORIO M L, GARCIA-FRANCO R, et al. From bench to bedside: Translating the prolactin/vasoinhibin axis[J]. Frontiers in Endocrinology, 2017, 8: 342. doi: 10.3389/fendo.2017.00342
[13] SINHA Y N. Structural variants of prolactin: Occurrence and physiological significance[J]. Endocrine Reviews, 1995, 16(3): 354-369. doi: 10.1210/edrv-16-3-354
[14] 田青, SPITZER A J, ZHAO F. PRL对HC11细胞乳蛋白及其调节因子基因表达的影响[J]. 中国乳品工业, 2020, 48(12): 20-23. doi: 10.19827/j.issn1001-2230.2020.12.004 [15] 田青, 王洪荣. 胰岛素、催乳素和氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国饲料, 2013(2): 8-12. [16] NUC P, NUC K. Recombinant protein production in Escherichia coli[J]. Postepy Biochemii, 2006, 52(4): 448-456.
[17] 邓春梅, 葛玉强, 刘丽, 等. 外源基因表达系统的研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2010, 10(19): 3744-3746. [18] KIM J Y, KIM Y G, LEE G M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: Current state and further potential[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(3): 917-930. doi: 10.1007/s00253-011-3758-5
[19] JAIN N K, BARKOWSLI-CLARK S, ALTMAN R, et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293[J]. Protein Expression & Purification, 2017, 134: 38-46.
[20] 孟凡荣, 陈琛, 万海粟, 等. 慢病毒载体及其研究进展[J]. 中国肺癌杂志, 2014, 17(12): 870-876. [21] COCKRELL A S, KAFRI T. Gene delivery by lentivirus vectors[J]. Molecular Biotechnology, 2007, 36(3): 184-204. doi: 10.1007/s12033-007-0010-8
[22] FOLLENZI A, SANTAMBROGIO L, ANNONI A. Immune responses to lentiviral vectors[J]. Current Gene Therapy, 2007, 7(5): 306-315. doi: 10.2174/156652307782151515
[23] ALARCON H, BONZON-KULICHENKO E, PEINADO R, et al. Generation of a lentiviral vector system to efficiently express bioactive recombinant human prolactin hormones[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2020, 499: 110605. doi: 10.1016/j.mce.2019.110605
[24] 宋倩倩, 王文玲, 詹瑛, 等. 真核表达MERS-CoV刺突蛋白亚单位的信号肽序列优化研究[J]. 病毒学报, 2019, 35(1): 20-26. [25] 董金蓉, 毛树宝, 谢震渊, 等. 人巨细胞病毒gB/AD1基因在CHO细胞中的表达和纯化[J]. 生命科学研究, 2015, 19(5): 402-409. [26] FARMER C. Prolactin and the swine mammary gland[J]. Domestic Animal Endocrinology, 2022, 78: 106672. doi: 10.1016/j.domaniend.2021.106672
[27] FREEMAN M E, KANYICSKA B, LERANT A, et al. Prolactin: Structure, function, and regulation of secretion[J]. Physiological Reviews, 2000, 80(4): 1523-1631. doi: 10.1152/physrev.2000.80.4.1523
[28] AKERS R M. Major advances associated with hormone and growth factor regulation of mammary growth and lactation in dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(4): 1222-1234. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(06)72191-9
[29] LEE G Y, KENNY P A, LEE E H, et al. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells[J]. Nature Methods, 2007, 4(4): 359-365. doi: 10.1038/nmeth1015
-
期刊类型引用(1)
1. 沈迎怡，李振华，李鑫烊. 金枪鱼分拣装置的设计与运动仿真. 机械制造. 2025(02): 37-43 . 
百度学术
其他类型引用(0)
计量
- 文章访问数: 628
- HTML全文浏览量: 16
- PDF下载量: 44
- 被引次数: 1
