刺五加Acanthopanax senticosus为五加科五加属落叶灌木，主产于东北、陕西、四川、河南等地^[1]，是我国传统药用植物之一，以干燥根和根茎或茎入药，具有益气健脾、益智安神等功效^[2]。近年来，随着刺五加栽培面积逐渐扩大，其侵染性病害也逐渐加重，由细极链格孢Alternaria tenuissima引起的刺五加黑斑病^[3]，主要为害刺五加叶片，严重时叶片干枯脱落，对其产量和品质造成严重影响。细极链格孢致病能力强、寄主范围广，可导致马铃薯Solanum tuberosum^[4]、甜菜Beta vulgaris^[5]、五味子Schisandra chinensis^[6]、丹参Salvia miltiorrhiza^[7]等多种作物发病。目前主要采用氟菌唑、苯醚甲环唑、菌核净等^[8]化学药剂防治刺五加黑斑病，然而化学药剂长期大量使用易引发环境污染、农药残留等问题。因此，开发绿色、无污染、成本低的生防菌剂对刺五加黑斑病的防控具有深远的意义。

生物防治通过引入对病原菌具有拮抗作用的细菌、真菌等有益微生物来防治植物病害^[9]，是当前植物病害绿色防控的研究热点。生防微生物通过拮抗、竞争作用等防控植株病害发生和发展^[10]。王妍等^[11]从防风Saposhnikovia divaricata根际分离筛选出对防风枯萎病菌Fusarium oxysporum具有较好拮抗作用的生防真菌Aspergillus terreus MR-97，防效达67.86%。Ryu等^[12]研究表明，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HK-CSM-1能够降低人参炭疽病Colletotrichum panacicola的发病率和病情指数。Sun等^[13]从人参Panax ginseng根际分离获得1株对人参黑斑病菌Alternaria panax具有较好拮抗效果的生防细菌Brevundimonas terrae SZ-22，防效达82.47%。刺五加黑斑病生物防治的研究鲜有报道。因此，从刺五加根际土壤中分离筛选对刺五加黑斑病具有防治效果的生防菌，具有重要的理论和实践指导意义。本研究以刺五加根际土壤为材料，分离筛选出对刺五加黑斑病菌具有拮抗作用的生防细菌，测定其广谱抑菌特性，并通过形态学特性、生理生化特性结合16S rDNA和gyrB测序分析确定其分类学地位，同时开展其叶面定殖能力和生物防治能力的评价，以期为刺五加黑斑病生物防治提供良好的生防菌源，为药用植物病害防治奠定理论基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

于 2020 年10月以五点取样法自吉林农业大学药用植物园(43°48′23″N，125°24′57″E)采集人工栽培刺五加的根际土，装于无菌自封袋中，放入 4 ℃ 冰箱内保存，备用。

刺五加细极链格孢Alternaria tenuissima、人参立枯丝核菌Rhizoctonia solani、人参茄腐皮镰孢菌Fusarium solani、人参核盘菌Sclerotinia ginseng、人参链格孢Alternaria panax、人参毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans和五味子尖镰孢菌Fusarium oxysporum由吉林农业大学植物病害综合治理实验室提供。

NB 培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、pH 7.0~7.2；NA培养基为NB培养基加20 g/L琼脂；BPY培养基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化钠5 g/L、pH 6.8~7.0；PDA培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、pH 7.0~7.2。

基因组抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒，宝生物工程(大连) 有限公司；16S rDNA通用引物、gyrB通用引物，生工生物工程(上海) 股份有限公司；有效成分质量分数为97%的利福平(Rifampicin, Rif)，上海麦克林生化科技有限公司；1000亿/g枯草芽孢杆菌WP，山东鲁抗生物农药有限责任公司；10%(w)苯醚甲环唑WG，先正达(中国)投资有限公司；GAPS-9700型PCR仪，美国Rockwell Allen-Bradley公司；DYCP-31DN水平电泳仪，北京市六一仪器厂；GIS-2010 型凝胶成相系统，上海天能科技有限公司。

1.2   方法

1.2.1   细菌分离纯化及菌株活化

方法参照冯志珍等^[14]。采集健康刺五加根际土样若干，风干土壤后过20目筛。称取样品10 g放入装有玻璃珠与90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡10~30 min，混匀后静置5 min。无菌条件下按照梯度制成稀释液至10⁻⁴ mL⁻¹，以200 µL各稀释液涂布于NA培养基。每处理3次重复，平板倒置于恒温培养箱内30 ℃条件下培养24~48 h。菌株纯化、编号，4 ℃条件下冷藏备用。

将供试病原菌制成8 mm的菌饼，在无菌条件下分别接种于PDA平板中心，25 ℃恒温培养，待菌株长满后，备用。无菌条件下，挑取细菌单菌落划线接种于含NB培养液的三角瓶(50 mL/100 mL)，32 ℃、180 r/min震荡培养24 h后即得细菌培养液；培养12 h的细菌培养液以1% (φ)的接种量接入含50 mL BPY培养基的100 mL三角瓶中，34 ℃、180 r/min震荡培养24 h，即得菌株发酵液。

1.2.2   拮抗菌株筛选及抗菌谱测定

滤纸片法^[15]初筛：将活化好的病原菌制成直径8 mm的菌饼，在无菌的条件下接种于PDA平板(平板直径90 mm)的中心，同时将灭菌的滤纸片浸泡在NB培养基中1 min，进行阴干，之后将滤纸片粘于距平板中心约25 mm处的4个对称角点，以只接病原菌为对照，每处理3次重复，置25 ℃恒温培养箱中暗箱培养。待对照长满平板，对病原菌生长情况进行测量，观察有无抑菌带产生。

牛津杯法^[16]复筛：将菌株培养液于4 ℃、12000 r/min离心20 min，收集上清液，经0.22 μm滤膜去除菌体、收集无菌滤液。在PDA平板中心接种直径为8 mm的菌饼，将4个无菌牛津杯放入距PDA平板中心约25 mm处的4个对称点，每个杯内加入200 μL无菌滤液，以单独接种病原菌为对照，重复3次，25 ℃条件下培养，待对照组长满后，测量菌落半径。

采用滤纸片法，以供试的6种常见真菌性病害致病菌为靶标，选取复筛中具有拮抗效果的细菌菌株测定抗菌谱，每个处理3次重复，置于25 ℃培养箱暗箱培养，待对照组长满平板，计算抑菌率。

1.2.3   拮抗菌株鉴定

参照文献[17-18]，将拮抗菌株划线接种于NA培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中培养2~3 d，观察单菌落形态特征，并进行革兰染色和芽孢染色观察，采用细菌微量生化反应管进行碳水化合物代谢试验、酶类试验、柠檬酸盐利用试验，测定耐盐性等生理生化指标。

拮抗菌株的单菌落接种在NB培养液中于32 ℃、180 r/min培养24 h，离心收集菌体，采用细菌提取试剂盒对细菌DNA进行提取。16S rDNA选择通用引物27F和1492R^[19-20]，gyrB选择扩增引物UP-1和UP-2r、测序引物UP-1S和UP-2Sr^[21]。PCR反应体系为50 μL：基因组DNA模板2 μL，10 mmol/L的 dNTP 2 μL，10×Buffer 2 μL，正、反引物各2 μL，2.5 U/ μL的Taq酶2 μL，ddH₂O 补充至50 μL。16S rDNA扩增条件^[22]：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，70 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。gyrB扩增条件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 8 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后送至武汉生工生物测序。所得的碱基序列经过DNAMAN拼接后与GenBank数据库中序列进行BLAST比对分析，以序列相似性达95%以上的标准选择参考菌株，采用MEGA5.1软件，通过Neighbor-Joining法^[23]构建系统发育树。

1.2.4   抗利福平标记菌株筛选

将活化好的拮抗细菌按照 32 ℃、180 r/min，摇床培养2 d制成拮抗细菌种子液。取种子液10 mL接种在含10 μg/mL Rif的NB培养液中(装液量50 mL/100 mL)。32 ℃、180 r/min振荡培养4~5 d后，如果液体培养基变浑浊，则吸取10 mL接入含20 μg/mL Rif的50 mL NB培养基中，以后每次培养液中Rif质量浓度均增加10 μg/mL，逐级诱导，直至标记至200 μg/mL。然后用含200 μg/mL Rif的NA培养基平板检测并挑取能稳定生长，且拮抗活性、菌落形态变化不大的标记菌株。为检测其遗传稳定性，将其在NA培养基(不含Rif)中连续培养3代后接种在含200 μg/mL Rif的NA培养基平板，观察其是否能正常生长。为检测其拮抗稳定性，采用滤纸片法以原始菌株为对照，观察抑菌率是否存在差异。

1.2.5   标记菌株在刺五加叶面的定殖

将以上突变菌株接种于含BPY培养基的三角瓶 (500 mL/1000 mL)中，34 ℃、180 r/min培养48 h，使用无菌BPY溶液制成含菌量为10⁷ mL⁻¹的菌悬液。菌悬液均匀喷施于刺五加叶面(10 mL)，分别于1、3、7、11、17、25、35 d取样回收，每个处理3个盆，每盆1株刺五加，每盆随机取叶组织，将叶组织表面使用75%(φ)乙醇溶液消毒15 s，无菌水冲洗数次，称取若干叶片组织于无菌研钵中研磨成匀浆，加无菌水10 mL，静置30 min，分别稀释至10⁻³，采用平板梯度稀释法测定菌落数，取200 μL的稀释液涂布于含200 μg/mL Rif的 NA培养基上，每个梯度3次重复，30 ℃条件下培养3 d后，对培养基表面的菌落进行计数。计算每克鲜质量组织中的含菌量 (CFU) 。

1.2.6   拮抗菌株YZ-375盆栽防效试验

将保存病原菌接种于PDA培养基中，25 ℃倒置培养至长满整个平板，之后挑取菌饼接入PDB培养基制成菌丝悬浮液，过滤，吸干水分后称量菌丝质量，然后使用无菌水稀释，细极链格孢制成菌丝悬浮液8.76 g/L，菌悬液于4 ℃条件下冷藏备用。

将拮抗细菌接种至NA培养基中，30 ℃培养48 h，挑取2~3块直径约1 cm的拮抗细菌菌株接种于含NB培养液的三角瓶(50 mL/100 mL)中，32 ℃、180 r/min培养12 h，以1%(φ)接种量接种于BPY发酵液中，34 ℃、180 r/min培养24 h，使用BPY溶液将菌悬液浓度调至10⁷ CFU/mL，即得拮抗菌悬液。

选取3年生刺五加进行盆栽试验，采用针刺法，将刺五加叶片针刺5~6个伤口，每株针刺的叶片上涂抹10 mL菌丝悬浮液，并设置4个处理：枯草芽孢杆菌1000倍液10 mL、10%(w)苯醚甲环唑800倍液10 mL、拮抗菌株10⁷ CFU/mL 10 mL及CK(清水对照)10 mL。每个处理5盆，每盆1株刺五加。

刺五加黑斑病分级标准^[8]：0级：叶片完整，无病斑；1级：有少量病斑(占叶片面积的1%~5%)；3级：有病斑，中等数量(占叶片面积的5%~10%)；5级：病斑数量较多(占叶片面积的10%~20%)；7级：病斑很多且较大(占叶片面积的20%~50%)；9级：病斑很多且较大(占叶片面积的50%~100%)。

处理35 d后，每盆调查15片叶片，共调查5盆刺五加，统计刺五加病情指数并计算防治效果。

1.3   数据处理

应用DPS 9.50和Microsoft Office Excel统计软件分析数据；使用DNAMAN进行序列拼接，MEGAX64软件构建系统发育树。

2.   结果与分析

2.1   拮抗细菌分离筛选

从采集的根际土壤中，经涂布分离、划线纯化，共分离得到419株细菌菌株。初筛中获得45株对刺五加黑斑病菌具有拮抗效果的细菌；进一步对以上菌株的无菌滤液进行测定，结果发现菌株YZ-375对刺五加黑斑病菌具有良好的拮抗效果，抑制率达65.85% (图1)。

图  1  菌株YZ-375对细极链格孢的抑菌效果

Figure  1.  Inhibitory effect of antagonistic strain YZ-375 on Alternaria tenuissima

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2.2   菌株YZ-375形态学及生理生化鉴定

YZ-375菌落呈乳白色，表面干燥，边缘褶皱，不透明(图2A)，革兰染色呈阳性(图2B)，有芽孢。菌株YZ-375不能利用葡萄糖、蔗糖、木糖、L−阿拉伯糖，可以利用甘露醇，VP测试、OF试验均呈阳性，硫化氢试验结果为阴性，明胶水解、淀粉水解均为阳性，能够利用柠檬酸盐，酒石酸盐呈阴性，酪蛋白水解、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原均为阳性，最高耐盐质量分数为10%。而模式菌株枯草芽孢杆菌均能利用葡萄糖、蔗糖、木糖、L−阿拉伯糖，最高耐盐质量分数为7%，其他测试结果与菌株YZ-375均相同，结合形态特征初步鉴定YZ-375为芽孢杆菌属。

图  2  菌株YZ-375 菌落形态(A)与革兰染色(B)

Figure  2.  Colony morphology (A) and gram staining (B) of strain YZ-375

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2.3   菌株YZ-375的分子生物学鉴定

将测序结果通过DNAMAN软件拼接后，得到YZ-375菌株16S rDNA长度为1424 bp的有效序列，gyrB长度为1110 bp的有效序列，GenBank登录号分别为OK474780、OP731351。在NCBI通过BLAST序列比对，并采用MEGA X64软件，通过N-J法构建系统发育树 (图3)。结果(图3A)显示，YZ-375菌株的16S rDNA有效序列与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis聚为一支，但置信度低，由于16S rDNA的局限性，进一步对菌株YZ-375进行gyrB保守序列鉴定，如图3B所示，菌株YZ-375与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis聚为一支，亲缘关系最近且置信度较高，通过16S rDNA与gyrB序列联合构建系统发育树(图3C)发现，菌株YZ-375与Bacillus velezensis聚为一支。因此，结合形态学、生理生化特征、16S rDNA及gyrB综合分析，鉴定菌株YZ-375为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis sp.nov.。

图  3  菌株YZ-375基于16S rDNA与gyrB序列的进化树

Figure  3.  Phylogenetic trees about YZ-375 based on sequences of 16S rDNA and gyrB

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2.4   菌株YZ-375的抗菌谱测定

YZ-375对6种病原真菌均具有较好的拮抗效果，其中对人参茄腐皮镰孢菌和人参链格孢拮抗效果较好，抑菌率分别为77.44%和75.20%；对五味子尖镰孢菌的抑制效果最差，抑制率为69.21%；对人参立枯丝核菌、人参核盘菌、人参毁灭柱孢菌的抑制率分别为73.48%、69.72%和73.58%。

2.5   菌株YZ-375在刺五加叶面的定殖能力

拮抗菌株YZ-375经Rif诱导后，菌株YZ-375能在200 μg/mL Rif的NA培养基上稳定生长，在不含Rif的NA培养基上连续培养3代后，仍能在200 μg/mL Rif NA培养基上正常生长，其发酵液对刺五加黑斑病菌仍有拮抗作用，拮抗效果同原始菌株无明显差异，表明菌株YZ-375遗传稳定且对刺五加黑斑病菌仍能保持良好的抑菌活性。刺五加叶面喷施抗Rif标记菌株YZ-375的菌液，在0~35 d内，菌量呈“先降后升再降”的趋势，且不同时期定殖菌量不同，菌株YZ-375 1d时达到最低值，3 d内缓慢上升，于7 d后达到峰值，定殖菌量达1.43×10⁶ CFU，11~17 d时，定殖菌量达3.73×10⁵ CFU以上， 25~35 d时定殖菌量快速下降，最终定殖菌量为4.00×10³ CFU。标记菌株在0~35 d内，仍能保持每克鲜质量叶片定殖菌量为10³ CFU以上，说明菌株YZ-375具有良好的叶面定殖能力。

2.6   YZ-375菌株对刺五加黑斑病的防治效果

分离筛选自刺五加根际土壤的菌株YZ-375，其发酵液施用于刺五加叶面后，可有效减轻刺五加黑斑病的发生，在菌株YZ-375接种35 d后，对照组刺五加黑斑病的病情指数为45.48，而经过枯草芽孢杆菌、苯醚甲环唑及菌株YZ-375发酵液处理后的刺五加黑斑病病情指数均有所降低。各处理防治效果为68.73%~72.31%，处理间无差异，其中，菌株YZ-375对刺五加黑斑病的防效达72.31%，与枯草芽孢杆菌和农药苯醚甲环唑防效(68.73%、72.31%)相当(表1)。

表  1  菌株YZ-375对刺五加黑斑病防控效果¹⁾

Table  1.  Control effect of strain YZ-375 against Alternaria tenuissima

处理 Treatment	病情指数 Disease index	防治效果/% Control effect
YZ-375	12.59±2.46b	72.31±5.40a
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis	12.59±1.74b	72.31±3.82a
苯醚甲环唑 Difenoconazole	14.22±0.81b	68.73±1.78a
CK	45.48±2.20a
1)表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05 ，Duncan’s 法) 　1)Data in the table are means ± SDs; Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P < 0.05, Duncan’s test)

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3.   讨论与结论

刺五加黑斑病严重影响刺五加的产量和品质，对其药用价值造成极大影响，因此，深入探究生防细菌对病原菌的抑制作用，对绿色防治刺五加黑斑病具有重要意义。本研究从健康刺五加根际土壤中分离出419株细菌，通过滤纸片法筛选出45株对刺五加黑斑病菌具有抑制效果的菌株，并进一步对45株细菌的无菌滤液进行测定，筛选出1株拮抗细菌YZ-375，其对刺五加黑斑病的抑菌率达65.85%；抗菌谱测定表明，菌株YZ-375对人参立枯病菌、人参黑斑病菌、人参菌核病菌等6种致病菌具有不同程度的抑制作用，平均抑制效果达73.11%，表明菌株YZ-375具有广谱抑菌特性。本研究通过对菌株YZ-375的形态特性、生理生化特性结合16S rDNA及gyrB有效序列分析，确定菌株YZ-375为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis sp. nov.。

定殖是生防菌防治植物病害的先决条件，在抑制植物病害方面发挥重要的作用^[24]。雷晶晶等^[25]采用绿色荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌B2，该标记菌株菌量在烟草Nicotiana tabacum根际土壤接种第42天时达到最大，每克土壤含菌量为1.46×10⁷ CFU。冉淦侨等^[26]采用抗生素标记法标记枯草芽孢杆菌BS24，显示其能在苹果Malus pumila Mill.叶面良好定殖。本研究中采用抗生素Rif标记菌株YZ-375，结果表明，突变菌株YZ-375可以在刺五加叶面成功定殖，7 d时YZ-375定殖菌量达到最大，每克鲜质量叶片含菌量为1.43×10⁶ CFU。另外，菌株YZ-375在叶面定殖菌量呈“先降后升再降”趋势，这与孙卓^[27]、林星辰^[28]的研究结果相同。但标记菌株喷施叶面后，菌株数量迅速下降，可能是受到空气温度、湿度等影响，一部分菌株生长受限，当菌株占据有利生态位点后，开始迅速大量繁殖，故而标记菌株数量出现峰值，趋于稳定后再次下降，但仍能保持每克鲜质量叶片含菌量为10³ CFU以上。

芽孢杆菌是土壤微生态的主要成员之一，具有繁殖快、抗逆性强等特点，常应用于植物病害防控中^[29]。Jiang等^[30]研究发现贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis可防治辣椒灰霉病Botrytis cinerea。Kumbar等^[31]研究表明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis能够显著降低马铃薯晚疫病Phytophthora infestans的发病率。但是关于刺五加黑斑病的生物防治，尤其是菌株Bacillus velezensis在防治刺五加黑斑病方面还鲜见报道，本研究中筛选获得的生防菌YZ-375对刺五加黑斑病具有良好的防治效果，防效达72.31%，与枯草芽孢杆菌和农药苯醚甲环唑防效相当，且具有良好的叶面定殖能力。综上，从刺五加根际土壤中分离筛选的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YZ-375有望开发为刺五加黑斑病绿色防控的生防菌株。